一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法。本发明所述用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒由底物试剂干粉、底物复溶试剂、铜试剂、反应板以及滤纸干血片质控品组成。本发明所述试剂盒的检测结果准确性和灵敏度高，稳定性好，兼具经济、简便、高效等优点，应用于新生儿筛查工作中时，有利于提高杂合子的检出率，增加判断的准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及检测试剂盒领域，具体涉及一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒及其制备方法。

背景技术

葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症为红细胞葡萄糖六磷酸脱氢酶（G6PD）显著缺乏所导致的一组异质性疾病，俗称“蚕豆病”，是一种最常见的遗传性酶缺陷病。葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症（Glucose-6-phosphate dehydrogenase G6PD）是几乎所有高、低等生物重要看家酶之一，分子量为59kDa，其活性形式由2个或4个亚单位组成，每个亚单位含515个氨基酸。该酶催化细胞能量代谢过程磷酸己糖旁路途径的限速步骤，并在此过程中把NADP（辅酶Ⅱ）还原为NADPH，后者为还原型谷胱甘肽合成所必需，是红细胞抗氧化反应中的重要因子。

G6PD酶活性的缺乏直接影响到红细胞的抗氧化能力，可导致溶血性贫血、蚕豆病、新生儿高胆血红素血症等病患，是人类最常见的酶缺陷病，全球范围内约累及4亿人。目前已发现400多种G6PD变异株，由150多种G6PD基因的突变引起，突变的类型和频率呈现明显的地域或群体特异性。此病主要见于非洲、地中海沿岸、中东、亚洲、太平洋诸岛、南美洲等疟疾曾一度流行的热带和亚热带地区，普遍认为与疟疾的抗性选择有关，但一直缺乏足够和必要的直接证据。我国是本病的高发区之一，呈南高北低的分布特点，患病率为0.2-44.8%。主要分布在长江以南各省，以海南、广东、广西、云南、贵州、四川等省为高。G6PD缺乏症发病原因是由于G6PD基因突变，导致该酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。

G6PD缺乏症的临床表现与一般溶血性贫血大致相同。分新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血、非球形细胞溶血性贫血等临床类型。本病临床表现的轻重程度不同，多数患者，特别是女性杂合子，平时不发病，无自觉症状，部分患者可表现为慢性溶血性贫血症状。常因食用蚕豆、服用或接触某些药物、感染等诱发血红蛋白尿、黄疸、贫血等急性溶血反应。因G6PD缺乏诱发的严重的急性溶血性贫血因红细胞破坏过多，如不及时处理，可引起肝、肾、或心功能衰竭，甚至死亡。60年代在广东兴宁地区在蚕豆收获季节曾爆发G6PD缺乏症的流行，导致许多患者的死亡。G6PD缺乏症又是新生儿病理性黄疸的主要原因。据中山医大的一项统计表明，患G6PD缺乏症的新生儿中，约50%的患儿会出现新生儿黄疸，其中约12%可发展为核黄疸，导致脑部损害，引起智力低下。

G6PD缺乏症在无诱因不发病时，与正常人一样，无需特殊处理。防治的关键在于预防，严格遵照健康处方，预防发作。其次是对妊娠晚期孕妇或新生儿服用小剂量苯巴比妥，可有效减低新生儿核黄疸的发生。输血是本病急性发作时最有效的疗法，其次是纠正酸中毒、处理肾衰。轻中度溶血患者一般用补液治疗。

目前，国际上WHO推荐的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(G6PD/6PGD)直接比值法(UVST)是临床实验室确诊G6PD缺乏症的最佳方法。而我国新生儿G6PD缺乏症筛查的普遍使用为荧光斑点和荧光分析法，其中最常用的方法为荧光分析法，该法原理为G-6-P底物在G6PD催化下转变6PG，同时伴随发生NADPH（可发荧光）增加，通过检测NADPH的量来测定葡萄糖6磷酸脱氢酶活性。筛查血斑标本与底物试剂G6P和NADP在室温混合30min可发生上述反应，加入铜溶液使反应终止，用荧光仪在波长355nm激发光和波长460nm发射光下测定反应物荧光。通过标准曲线得出未知样本和质控品中G6PD浓度（U/gHb），G6PD活性低于正常值者为G6PD缺乏。但是荧光分析法对于贫血，溶血，凝血及陈旧的血样标本假阳性率高，准确率低。

现有G6PD／6PGD比值法技术在检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，主要应用于生化仪或者手工测定全血样本中压积红细胞的G6PD和6PGD活性之定量比值。如广州米基公司生产的改良葡萄糖-6-磷酸脱氢酶测定试剂盒（定量比值法）其原理是：G6PD催化试剂中的葡萄糖六磷酸（6PG）生成六磷酸葡萄糖酸（6PG），伴有还原型辅酶II（NADPH）的生成，NADPH的H在PMS的递氢作用下，将氧化型的NBT（黄色）转变为还原型NBT（蓝色）。蓝色的深浅与NADPH的生成量成正比关系，用分光光度计650nm比色（S1）。作为G6PD的同功酶6PGD，也有将氧化型辅酶II（NADP+）转化成NADPH的作用，同法测得NADPH的量（S2），通过S1/S2的比值得出NADPH的相对含量。

还有些技术的测定原理为：检测样品中G6PD催化试剂中6PG生成六磷酸葡萄糖酸（6PG），同时将试剂中的NADP+转化为NADPH。随着NADPH的增多，检测仪器通过监测340nm处吸光度上升的速率，可以计算出样品中G6PD的活性。由于样品中含有6PGD，它能催化6PG生成五磷酸核酮糖，同时也把NADP+还原成NADPH，使吸光度上升，通过分别检测G6PD+6PGD共同作用的吸光度变化速率和G6PD单独作用的变化速率，两者相减，求出真正的葡萄糖六磷酸脱氢酶的活性。

发明内容

本发明的目的在于根据现有的G6PD缺乏症检测方法中存在的对于贫血，溶血，凝血及陈旧的血样标本假阳性率高，准确率低等缺陷，提供一种对杂合子检出率高，假阳性率低且重复性好的用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒。

本发明另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述试剂盒的使用方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的试剂盒，原理是：G6P（6-磷酸葡萄糖）底物在G6PD催化下转变6PG（6-磷酸葡萄糖酸酯），同时伴随发生NADPH（可发荧光）增加，NADPH可以通过荧光仪在波长355nm激发光和波长460nm发射光下测定其荧光强度。作为G6PD同功酶的6PGD也有将NADP转化为NADPH的作用，而人类6PGD缺乏极为罕见。通过分别检测这两种酶的荧光强度，计算比值G6PD/6PGD，以6PGD作为内质控，若比值降低即反应G6PD活性降低，可以正确判断葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症或减少。

一种用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒，包括如下组分：

（1）16ml/瓶的G6P底物试剂干粉；

（2）16ml/瓶的6PG底物试剂干粉；

（3）35ml/瓶的铜试剂：用硫酸铜、酒石酸钾钠及碳酸钠制成；

（4）G6PD滤纸干血片质控品，C1 阳性，C2 阴性；

（5）35ml/瓶的底物复溶试剂：用MgCl₂、双甘氨酸及Tris-Hcl制成；

（6）微孔白色反应板。

上述用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒的制备方法包括如下步骤：

（1）制备G6P和6PG两种底物试剂干粉、底物复溶试剂、铜试剂；

（2）制备滤纸干血片质控品；

（3）分装上述底物试剂干粉、底物复溶试剂、铜试剂；

（4）贴标签；

（5）组装为成品试剂盒；

步骤（1）中，G6P底物试剂的制备是将1.2g的G6P加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.6 g 的NADP·Na₂，补足纯化水至100ml，混匀；6PG底物试剂的制备是将1.5 g的6PG加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.6 g 的NADP·Na₂，补足纯化水至100ml，混匀；底物复溶试剂的制备是将0.2 g Tris和 5.4 g NaCl加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.8 g MgCl₂和2.5 g 双甘氨酸，补足纯化水至100ml，混匀；铜试剂溶液的制备是分别将0.03gCuSO₄·5H₂O、0.05gNa₂CO₃ 和0.03g酒石酸钾钠加入到装有纯化水的容器中，待完全溶解后，补足纯化水至100ml，混匀；

步骤（2）中，所述滤纸干血片质控品的制备方法如下：将枸橼酸抗凝绵羊全血用低速离心机3000rmp，离心 10~15min分离出血浆和红细胞。按红细胞∶血浆=1.1∶1.0调整红细胞压积；分别加入G6PD和6PGD纯品原料，使C1全血中G6PD/6PGD＜1.0，C2全血中G6PD/6PGD＞1.0；将C1、C2分别放在磁力搅拌器上不断搅拌，充分混匀；将裁好的 903#滤纸悬挂在架子上，用移液器将质控品滴加到滤纸片上。取液量为50ul/血斑，对准中心滴下，室温阴干3~4小时，不可重叠摆放，阴干后装入贮存袋，袋内放干燥剂，放入2~8℃冰箱保存备用；

步骤（3）中将步骤（2）中配制好的G6P底物试剂、6GP底物试剂、底物复溶试剂、铜试剂进行分装，将分装好的G6P底物试剂、6GP底物试剂利用冻干机制成冻干粉。

上述用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒的使用方法包括如下步骤：

（1）试剂准备：G6P底物试剂干粉，6PG底物试剂干粉分别加16ml底物复溶试剂，混匀，静置20分钟； 

（2）检验操作：

（a）加样：用打孔钳从样品滤纸干血片中打下下直径为 3mm或1/8 英寸的样本两份，打下纸片须被血液浸透，并依次分别加入G6PD和6PGD测试的空白微孔中，每孔一片，一一对应；

（b）加入底物：向检测G6PD荧光值的微孔中加入复溶好的G6P底物试剂150μl；向检测6PGD荧光值的微孔中加入复溶好的6PG底物试剂150μl并加贴封片；

（c）孵育：在室温下，缓慢振荡30分钟；

（d）加入铜试剂：孵育完成后，立即加入150μl/孔冷的铜试剂工作液，混匀；

（e）检测：使用对应的程序进行检测，检测工作在15分钟内完成，激发波长355nm， 发射波长460nm；

（f）结果分析：将检测得到的G6PD的荧光值（S1）与6PGD的荧光值（S2），计算S1/S2的值，当S1/S2≤1.0时，结果判断为阳性，当S1/S2＞1.0时，结果判断为阴性。

本发明用于新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症筛查的试剂盒的结果判断方法包括如下步骤：

（1）检测：将加完铜试剂的微孔反应板使用对应的程序进行检测，检测工作在15分钟内完成，激发波长355nm，发射波长460nm；

（2）结果分析：将检测得到的G6PD的荧光值（S1）与6PGD的荧光值（S2），计算S1/S2的值，当S1/S2≤1.0时，结果判断为阳性，当S1/S2＞1.0时，结果判断为阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明新生儿葡萄糖六磷酸脱氢酶筛查测定试剂盒主要应用于对新生儿滤纸干血片样品中G6PD/6PGD荧光比值的测定，对杂合子的检出率高，大大的降低了样品的假阳性率，为国际首创，填补国内空白。该方法采用特定设备，测定在355nm激发光激发下产生的460nm发射荧光信号，较传统方法测定吸光度的变化，具有本底低、准确性高、重复性好的优点同时具有较高的敏感性和特异性；采用微孔反应板作为检测载体，操作简便省时、花费低，特别适于对大样本进行新生儿疾病筛查，免去了传统方法单独筛查的繁琐；试剂盒在设计中还含有阴阳性对照质控品，为产品应用过程中的质量控制提供保证；以滤纸干血片作为样本，无需离心和洗涤等样品前处理，大大减轻工作人员的负担，而且一人份血片可同时可应用于筛查四种先天性遗传代谢疾病(先天性甲状腺机功能减退症、先天性肾上腺皮质增生症、苯丙酮尿症和G6PD缺乏症)，非常值得在临床上应用推广（表1）。

表1

 英国朗道广州米基专利本试剂方法速率A法比值终点法 样品速率空白法荧光比值法用途诊断蚕豆病诊断蚕豆病诊断蚕豆病诊断蚕豆病优点保存时间长不用离心，不用检测血红蛋白浓度。一年有效期，双液体，不用配制直接使用。不用测定血红蛋白浓度。使用滤纸干血片检测，方便样本的保存运输；可以同时检测大量样本，可用于新生儿筛查；不用测定血红蛋白浓度；可以随到随做。缺点需检测血红蛋白浓度。全手工操作，操作时间长，试剂配制后保存时间短。要求使用压积红细胞。需要30分钟的孵育时间。样本前处理用生理盐水洗涤红细胞三次。不用不用不用杂合子检出率低高高高

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例中的G6P-Na₂购于Sigma公司；96孔微孔空白板（8×12孔）为Therom产品；6PG（6磷酸葡萄糖）为ORIENTAL公司产品；β-NADP-Na₂购自Regal Biotechnology Company 公司；双甘氨酸（GLY-GLY）购于Sigma公司；G6PD购自WORTHINGTON公司；6PGD购自PROSPEC公司。

其他试剂为国产分析纯；时间分辨荧光免疫分析仪（PE公司1420型），恒温振荡仪为广州市丰华生物有限公司生产。

实施例1

制备本发明的同时检测G6PD测定试剂盒（荧光比值法）组分包括：

（1）G6P底物试剂干粉：用G-6-P和NADP制成分装并冻干；

（2）6PG底物试剂干粉：用6-PG和NADP制成分装并冻干；

（3）铜试剂：用硫酸铜、酒石酸钾钠及碳酸钠制成；

（4）G6PD滤纸干血片质控品，C1 阳性， C2 阴性：用含抗凝绵羊全血红细胞制备成滤纸干血片；

（5）底物复溶试剂：用MgCl2、Gly-Gly（双甘氨酸）及Tris-Hcl制成。

（6）纸片质控品：将枸橼酸抗凝绵羊全血用低速离心机3000rmp，离心 10～15min分离出血浆和红细胞。按比例（红细胞∶血浆=1.2∶1.0）调整红细胞压积；分别加入G6PD和6PGD纯品原料，使C1全血中G6PD/6PGD＜1.0，C2全血中G6PD/6PGD＞1.0。将C1、C2分别放在磁力搅拌器上不断搅拌（避免产生气泡），充分混匀。将裁好的 903#滤纸悬挂在架子上，用移液器将质控品滴加到滤纸片上。取液量为50ul/血斑，对准中心滴下。室温阴干（3～4小时），不可重叠摆放。阴干后装入贮存袋（袋内放干燥剂），放入2～8℃冰箱可保存备用。

（7）微孔白色反应板。

本发明检测G6PD缺乏症试剂盒的主要工艺制备如下：

（1）G6P底物试剂干粉的制备：将1.2 g的G6P于专用桶内，加适量纯化水，充分搅拌溶解。待完全溶解后，加入1.6g 的NADP·Na₂，补足纯化水至100ml，混匀。分装冻干即可。

（2）6PG底物试剂干粉的制备：将1.5 g的6PG于专用桶内，加适量纯化水，充分搅拌溶解。待完全溶解后，加入1.6 g 的NADP·Na₂，补足纯化水至100ml，混匀。分装冻干即可。

（3）铜试剂的制备：分别将0.03gCuSO₄·5H₂O、0.05gNa₂CO₃ 和0.03g酒石酸钾钠加入到装有纯化水的专用容器中，待完全溶解后，补足纯化水至100ml，混匀。

（4）底物复溶试剂的制备：将0.2 g Tris和 5.4 g NaCl加纯化水，充分搅拌溶解，待完全溶解后，加入1.8 g MgCl₂和2.5g 双甘氨酸，补足纯化水至100ml，混匀。

（5）G6PD质控品，C1阳性， C2阴性的制备：将枸橼酸抗凝全血用低速离心机3000rmp，离心 10～15min分离出血浆和红细胞待用。将枸橼酸抗凝绵羊全血用低速离心机3000rmp，离心 10～15min分离出血浆和红细胞。按比例（红细胞∶血浆=1.1∶1.0）调整红细胞压积；分别加入G6PD和6PGD纯品原料，使C1全血中G6PD/6PGD＜1.0，C2全血中G6PD/6PGD＞1.0。将C1、C2分别放在磁力搅拌器上不断搅拌（避免产生气泡），充分混匀。将裁好的 903#滤纸悬挂在架子上，用移液器将质控品滴加到滤纸片上。取液量为50ul/血斑，对准中心滴下。室温阴干（3～4小时），不可重叠摆放。阴干后装入贮存袋（袋内放干燥剂），放入2～8℃冰箱可保存备用。

（6）微孔白色反应板；

（7）贴标签；

（8）成品组装。

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出3份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成新生儿筛查G6PD试剂盒(荧光比值法)。组装完成后还需抽检合格后才能出厂。

实施例2  本发明试剂盒的使用方法

以上实施例 1 制备的新生儿G6PD筛查试剂盒(荧光比值法)的具体操作如下：

试剂准备：

底物的复溶：G6P底物试剂干粉，6PG底物试剂干粉分别加16ml底物复溶试剂，混匀，静置20分钟；

铜试剂的冷却：试剂使用前须放入4℃冰箱中冷却备用。

检验操作：

加样：用打孔钳从样品滤纸干血片中打下下直径约为 3mm（1/8 inch）的样本两份(打下纸片须被血液浸透)，并依次分别加入G6PD和6PGD测试的空白微孔中，每孔一片，一一对应。控制打孔的一致性，使纸片尽量一致。

加入底物：向检测G6PD荧光值的微孔中加入复溶好的G6PD底物试剂150μl；向检测6PGD荧光值的微孔中加入复溶好的6PGD底物试剂150μl并加贴封片。

孵育：在室温下，缓慢振荡30分钟。

加入铜试剂：孵育完成后，立即加入150μl/孔冷的铜试剂工作液（刚从冰箱取出，不复温），混匀。

检测：使用对应的程序进行检测，检测工作在15分钟内完成（激发波长355nm，发射波长460nm）。

结果分析：将检测得到的G6PD的荧光值（S1）与6PGD的荧光值（S2），计算S1/S2的值，当S1/S2≤1.0时，结果判断为阳性，当S1/S2＞1.0时，结果判断为阴性。

实施例3  本发明的试剂盒的分析性能评价指标

以上实施例 1 制备的新生儿筛查测定G6PD试剂盒(荧光比值法)的性能评价指标如下：

灵敏度：测定由公司实验室建立的阳性参考品1套。阳性参考品为经临床检测确定为G6PD缺陷症患者的标本，由100份标本组成。

阳性参考品符合率（%）=实测阳性参考品数量/10*100%。

表2  本发明试剂盒的灵敏度测试

 阳性（比值≤1.0）阴性（比值＞1.0）检测结果1000

通过上表继续可得阳性符合率为100%。

特异性：

阴性参考品符合率测定：由公司实验室建立的阴性参考品1套。阴性参考品为经临床检测确定G6PD正常的标本，由100份标本组成。

阴性参考品符合率（%）=实测阴性参考品数量/10*100%  。

表3  本发明试剂盒的特异性测试

 阳性（比值≤1.0）阴性（比值＞1.0）检测结果0100

通过上表计算可得阴性符合率为100%。

精密性：

批内精密度：

使用一个批次试剂，10孔平行测定阴性和阳性质控品，计算测定结果的阴阳性符合度。

表4  本发明试剂盒的批内精密度测试

通过上表计算可得阳性符合率和阴性符合率均为100% 。

批间精密度：

使用三个不同批次试剂，分别10孔测定同一批次阴、阳性质控品，计算测定结果的阴阳性符合度。

表5  本发明试剂盒的批间精密度测试

通过上表计算可得阳性符合率和阴性符合率均为100% 。

热稳定性（加速破坏试验）：

试剂盒在37℃ 3天烘烤后，检测阳性参考品和阴性参考品，计算阴阳性符合率。

表6  本发明试剂盒的热稳定性测试

通过上表计算可得阳性符合率和阴性符合率均为100% 。

以上性能指标表明“新生儿筛查G6PD试剂盒(荧光比值法)”灵敏度高、特异性强、精密性好和热稳定性好。