微生物发酵植物油脂脱臭馏出物生产植物甾醇的方法

摘要

本发明属生物化工领域，特别涉及微生物发酵植物油脂脱臭馏出物生产植物甾醇的方法。该方法使用微生物发酵植物油脂脱臭馏出物，脱臭馏出物中的游离脂肪酸作为微生物的营养物质而被直接代谢利用。脱臭馏出物中的甘油酯在微生物所产生的脂肪酶、酯酶等水解酶的作用下水解为小分子物质，然后被微生物细胞吸收利用，转化为细胞物质。当游离脂肪酸、甘油酯被消化利用后，便将与之结合的植物甾醇释放发酵液中，发酵液经过微滤除去其中的微生物细胞；由于植物甾醇不溶于水，滤液经浓缩后冷析即可分离出植物甾醇。本发明极大地简化了生产工艺，减少了能源消耗，降低了生产成本，同时，由于不使用有机溶剂，无环境污染，经济效益显著。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵植物油脂脱臭馏出物生产植物甾醇的方法，属于生物化工技术领域。 

背景技术

植物甾醇广泛存在于植物及植物种子中，是植物体内构成细胞膜的成分之一。植物甾醇中含有谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇及菜籽甾醇等成分。植物甾醇具有良好的生理功能，有降血清胆固醇、降血脂、抗肿瘤、降低心脏病发生率、防止前列腺疾病，以及抗癌、调节动物的生长、抗炎、抗病毒、延缓衰老等作用，也是多种激素、维生素D及甾族化合物合成的前体。植物甾醇还具有良好的乳化性和稳定性等特点。因此，植物甾醇广泛应用于食品、医药、化妆品、动物生长剂及纺织、印刷以及纸张加工业等领域。目前用来提取植物甾醇的原料主要是植物油脂工业的副产物，如碱炼皂脚、脱臭馏出物、水化油脚、脂肪酸蒸馏残留物等，其中脱臭馏出物是目前用来提取生产植物甾醇的主要原料。 

植物油脂脱臭馏出物是油脂精炼过程中最后过程的副产物，主要成分为游离脂肪酸、甘油酯、甾醇、生育酚(即维生素E)、烃、水及其他氧化分解产物。其各成分的含量因植物油脂种类、生产工艺而有较大的差异。一般含30％～60％游离脂肪酸、10％～20％甘油酯、10％～35％甾醇、1％～20％生育酚、5％～30％烃。甾醇与游离脂肪酸、甘油酯呈结合态，而且脱臭馏出物主要成分的理化性质相差很小，因此从中分离提取甾醇很困难。 

一些微生物如产朊假丝酵母，能直接代谢利用游离脂肪酸，从而将其转化为细胞物质；还能产生脂肪酶、酯酶等水解酶，将甘油酯水解为小分子物质，然后被微生物细胞吸收利用，转化为细胞物质。这样，在微生物发酵植物油脂脱臭馏出物过程中，当脂肪酸、甘油酯被代谢利用后，便将与之结合的植物甾醇释放到发酵液中。 

甾醇通常为片状或粉末状白色固体，熔点较高，在100℃以上，最高达215℃。甾醇相对密度略大于水，不溶于水，可溶于多种有机溶剂。甾醇作为游离的醇类化合物，可以与脂肪酸或酚酸发生酯化反应，也可以与烃类结合。 

申请号为02829395.9匈牙利专利公开了一种从植物油精制的副产物脱臭馏出物回收植物甾醇的方法，通过真空蒸馏或通过连续溶剂皂化从脱臭馏出液中除去游离脂肪酸，然后将收集的物质与芳族羧酸酐在50℃～150℃和减压下反应，用酸酐处理后，从混合物中除去生育酚，再通过酯交换从蒸馏残余物中回收甾醇。申请号为200710062149.2的中国专利公开了一种从大豆脱臭馏出物中分离提取植物甾醇的方法，用超临界流体对大豆脱臭馏出物进行萃取，萃余物与丙酮混合于54℃下回流溶解，室温缓慢降温结晶，得甾醇晶体。申请号为200810049033.X的中国专利公开了一种酶催化、分子蒸馏提取植物甾醇的方法，将植物油脱臭馏出物中的甘油酯，首先经过脂肪酶水解生成脂肪酸、然后脂肪酶催化甲醇和脂肪酸酯化生成脂肪酸甲酯，再经过滤、脱溶、冷冻脱甾醇，最后通过二次分子蒸馏去除脂肪酸甲酯，而得到甾醇。申请号为200910306961.4的中国专利公开了一种由棉籽油脱臭馏出物中提取植物甾醇的方法，首先以强酸性阳离子交换树脂作为催化剂，加入甲醇将游离脂肪酸转变成相应的甲酯，再经过滤、脱溶、吸附剂吸附及解析、减压蒸发、甲醇中冷析，过滤分离得到植物甾醇晶体。 

以上专利技术方法存在的不足之处为： 

1、采用高真空蒸馏、分子蒸馏或超临界萃取，这些方法工艺复杂、流程长，设备投资大、操作费用高，生产成本高，而且处理量比较小。 

2、使用和消耗大量的甲醇、丙酮等有毒、易燃的有机溶剂，一方面增加了生产车间的建设投资，增加了安全生产风险；另一方面，对工人的身体健康不利，也造成环境污染。 

3、用脂肪酶催化游离脂肪酸转变成相应的甲酯，尽管反应条件温和，无环境污染，但脂肪酶价格高，容易失活、不易保存。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高效、安全、低能耗、无环境污染的由植物油脂脱臭馏出物提取生产植物甾醇的方法。 

本发明的原理：使用微生物发酵植物油脂脱臭馏出物。脱臭馏出物中的游离脂肪酸作为微生物的营养物质而被直接代谢利用。脱臭馏出物中的甘油酯在微生物所产生的脂肪酶、酯酶等水解酶的作用下水解为小分子物质，然后被微生物细胞吸收利用，转化为细胞物质。当游离脂肪酸、甘油酯被消化利用后，便将与之结合的植物甾醇释放发酵液中。发酵液经过微滤除去其中的微生物细胞；由于植物甾醇不溶于水，滤液经浓缩后冷析即可分离出植物甾醇。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现： 

a、发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物 

用于发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物为热带假丝酵母。 

b、培养基的配制及灭菌 

于1L水中，加入60～80g脱臭馏出物、0.5～2g酵母粉、0.5～1g硫酸镁、3～5g磷酸氢二钾，pH值6.5～7.0。按照所述配比，将各种成分称重后加入机械搅拌式发酵罐中，室温下搅拌均匀，制得脱臭馏出物发酵培养基；然后向发酵罐通入蒸汽开始灭菌，待罐温上升到118℃～121℃，保温30分钟，灭菌结束后，引入冷却水将培养基温度降至25℃～30℃。 

c、发酵 

按照8％～10％的接种量将热带假丝酵母菌液接种到步骤b所述发酵罐中的培养基之中，控制发酵温度28℃～37℃，机械搅拌转速150rpm～180rpm，通气量0.8～1.1vvm，pH值6.0～6.5，发酵90～96小时。 

d、冷却、过滤 

发酵结束后，将步骤c所述发酵液泵至储料罐并降温至0℃～5℃，这时在发酵液上部形成一层蜡状固体物，其中含有60％～70％的天然维生素E，可用来进一步提取天然维生素E。打开储料罐底部的放料阀，将下部的发酵液泵至 发酵液储罐，而蜡状固体物仍保留在储料罐中，打开储料罐的热水阀，将罐温升至25℃～30℃，这时蜡状固体物融化为黄褐色液体，然后泵至另一储罐。对于所分离出的发酵液，采用陶瓷微滤膜进行微滤，除去其中的酵母细胞。微滤操作条件：0.22微米直径管式陶瓷膜，控制料液温度30℃，压力0.16～0.18Mpa，稳定膜通量100～120L/hm²。透过微滤膜的发酵液中含有4.7～12.8g/L植物甾醇，将截留液的酵母细胞，收集、干燥后可用作动物饲料。 

e、浓缩 

采用旋转真空浓缩器，在温度70℃～80℃、真空度82～90KPa的条件下浓缩步骤d中的发酵液，使得其中植物甾醇浓度提高至100～120g/L。 

f、冷析、干燥 

将步骤e中浓缩后的发酵液降温至0℃～5℃冷析结晶6～8小时，随后进行过滤，滤饼用去离子水洗涤3次，40℃～50℃冷风干燥即得粗甾醇产品。 

本发明与现有技术相比具有的有益效果为： 

①采用微生物发酵将脱臭馏出物中的游离脂肪酸和甘油酯转化为细胞物质，植物甾醇由结合态转变为游离态，并利用植物甾醇不溶于水的特性，很简单地制备出结晶植物甾醇。同目前的工业生产方法如分子蒸馏相比，本发明的生产方法工艺简单、流程短、设备投资低，处理量大，生产成本低。 

②整个生产过程没有使用有毒的、易燃的有机溶剂。 

③整个生产过程没有环境污染。； 

具体实施方式

下面对本发明作进一步的详细说明。 

实施例1 

微生物发酵大豆油脱臭馏出物生产植物甾醇 

a、发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物 

用于发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物为热带假丝酵母。 

b、培养基 

于1L水中，加入60g大豆油脱臭馏出物(含植物甾醇10.2％)、1.0g酵母粉、0.5g硫酸镁、3.0g磷酸氢二钾，pH值6.5。将各种成分称重后加入机械搅拌式发酵罐中，搅拌均匀，制得脱臭馏出物发酵培养基；然后向发酵罐通入蒸汽开始灭菌，待罐温上升到121℃，保温30分钟。灭菌结束后，将培养基温度降至28℃。 

c、发酵 

按照10％的接种量将热带假丝酵母菌液接种到上述培养基中，控制发酵温度28℃，机械搅拌转速150rpm，通气量1.0vvm，pH值6.5，发酵90小时。 

d、冷却、过滤 

发酵结束后，将上述发酵液泵至储料罐并降温至5℃左右，这时在发酵液上部形成一层蜡状固体物，其中含有72％的天然维生素E。打开储料罐底部的放料阀，将下部的发酵液泵至发酵液储罐，而蜡状固体物仍保留在储料罐中，打开储料罐的热水阀，将罐温升至28℃，这时蜡状固体物融化为黄褐色液体，然后泵至另一储罐。对于所分离出的发酵液，采用陶瓷微滤膜进行微滤，除去其中的酵母细胞。微滤操作条件：0.22微米直径管式陶瓷膜，控制料液温度30℃，压力0.16Mpa，稳定膜通量100L/hm²。透过微滤膜的发酵液中含有5.1g/L植物甾醇。 

e、浓缩 

采用旋转真空浓缩器，在温度80℃、真空度85KPa的条件下浓缩发酵液，使得其中植物甾醇浓度提高至100g/L以上。 

f、冷析、干燥 

将浓缩后的发酵液降温至0℃冷析结晶8小时，随后进行过滤，滤饼用去离子水洗涤3次，40℃～50℃冷风干燥即得粗甾醇晶体，所得甾醇纯度为90.2％。 

实施例二 

微生物发酵菜籽油脱臭馏出物生产植物甾醇 

a、发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物 

用于发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物为热带假丝酵母。 

b、培养基 

于1L水中，加入65g菜籽油脱臭馏出物(含植物甾醇20.5％)、0.5g酵母粉、1.0g硫酸镁、4.0g磷酸氢二钾，pH值7.0。将各种成分称重后加入机械搅拌式发酵罐中，搅拌均匀，制得脱臭馏出物发酵培养基；然后向发酵罐通入蒸汽开始灭菌，待罐温上升到121℃，保温30分钟。灭菌结束后，将培养基温度降至30℃。 

c、发酵 

将热带假丝酵母菌液按照10％的接种量接种到上述培养基中，控制发酵温度30℃，机械搅拌转速160rpm，通气量1.0vvm，pH值7.0，发酵96小时。 

d、冷却、过滤 

发酵结束后，将发酵液泵至储料罐并降温至5℃左右，这时在发酵液上部形成一层蜡状固体物，其中含有75％的天然维生素E。打开储料罐底部的放料阀，将下部的发酵液泵至发酵液储罐，而蜡状固体物仍保留在储料罐中，打开储料罐的热水阀，将罐温升至30℃，这时蜡状固体物融化为黄褐色液体，然后泵至另一储罐。对于所分离出的发酵液，采用陶瓷微滤膜进行微滤，除去其中的酵母细胞。微滤操作条件：0.22微米直径管式陶瓷膜，控制料液温度30℃，压力0.16Mpa，稳定膜通量105L/hm²。透过微滤膜的发酵液中含有10.6g/L植物甾醇。 

e、浓缩 

采用旋转真空浓缩器，在温度80℃、真空度85KPa的条件下浓缩发酵液，使得其中植物甾醇浓度提高至100g/L以上。 

f、冷析、干燥 

将浓缩后的发酵液降温至0℃冷析结晶8小时，随后进行过滤，滤饼用去离子水洗涤3次，40℃～50℃冷风干燥即得粗甾醇晶体，所得甾醇纯度为 91.6％。 

实施例三 

微生物发酵棉籽油脱臭馏出物生产植物甾醇 

a、发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物 

用于发酵植物油脂脱臭馏出物的微生物为热带假丝酵母。 

b、培养基 

于1L水中，加入80g棉籽油脱臭馏出物(含植物甾醇17.2％)、2.0g酵母粉、1.0g硫酸镁、3.5g磷酸氢二钾，pH值6.5。将各种成分称重后加入机械搅拌式发酵罐中，搅拌均匀，制得脱臭馏出物发酵培养基；然后向发酵罐通入蒸汽开始灭菌，待罐温上升到121℃，保温30分钟。灭菌结束后，将培养基温度降至30℃。 

c、发酵 

按照10％的接种量将热带假丝酵母菌液接种到上述培养基中，控制发酵温度30℃，机械搅拌转速180rpm，通气量1.1vvm，pH值6.5，发酵96小时。 

d、冷却、过滤 

发酵结束后，将上述发酵液泵至储料罐并降温至5℃左右，这时在发酵液上部形成一层蜡状固体物，其中含有60％的天然维生素E。打开储料罐底部的放料阀，将下部的发酵液泵至发酵液储罐，而蜡状固体物仍保留在储料罐中，打开储料罐的热水阀，将罐温升至30℃，这时蜡状固体物融化为黄褐色液体，然后泵至另一储罐。对于所分离出的发酵液，采用陶瓷微滤膜进行微滤，除去其中的酵母细胞。微滤操作条件：0.22微米直径管式陶瓷膜，控制料液温度30℃，压力0.17Mpa，稳定膜通量110L/hm²。透过微滤膜的发酵液中含有11.3g/L植物甾醇。 

e、浓缩 

采用旋转真空浓缩器，在温度80℃、真空度85KPa的条件下浓缩发酵液，使得其中植物甾醇浓度提高至110g/L以上。 

f、冷析、干燥 

将浓缩后的发酵液降温至0℃冷析结晶8小时，随后进行过滤，滤饼用去离子水洗涤3次，40℃～50℃冷风干燥即得粗甾醇晶体，所得甾醇纯度为89.2％