小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法

摘要

一种小分子脂肪酸化学修饰提高氯过氧化物酶催化活性的方法，采用十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸等小分子脂肪酸对氯过氧化物酶进行化学修饰，不仅有效地提高了氯过氧化物酶的催化活性，而且改善了其高温热稳定性及对有机溶剂的抗失活能力。本发明方法简单、成本低，对氯过氧化物酶在有机合成等领域的产业化应用具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种通过小分子化学修饰提高酶的催化 活性的方法。

背景技术

酶催化反应由于其具有条件温和、高效定向、环境友好等特点，如今已被广泛 应用于有机合成、药物制备等领域，被视为今后大宗化学品绿色合成的重要手段， 对实现可持续发展战略具有重要意义。

氯过氧化物酶(CPO)是自海洋真菌Caldariomyces fumago中分离出的一种血 红素糖蛋白酶，CPO因其独特的活性位点结构而兼具过氧化物酶、过氧化氢酶以及 细胞色素P-450的催化功能，目前被认为是已知的血红素过氧化物酶家族中应用最 广泛的酶，并且具有广泛的底物适应性，因此CPO在环境生物催化、医药工业和现 代合成化学中具有很大的应用潜力。

如何改善天然酶的催化活性，提高酶促反应的效率，一直以来是人们坚持不懈 的努力目标。然而由于酶蛋白是分子量很大的生物大分子，结构复杂，影响因素众 多，是一项难度很大的挑战，有效手段还比较缺乏；同时目前普遍存在的酶的稳定 性与工业生产所需的苛刻条件之间的矛盾也是制约酶的大规模产业化应用的一个 瓶颈。对CPO而言，反应体系中经常会使用酸、碱、有机溶剂或反应温度较高等相 对极端的条件，都会引起CPO变性失活。因此，提高CPO对温度、有机溶剂等导致 失活因素的抵抗能力、增强其在极端反应环境中的适应性对提升酶的产业化应用潜 能是很有意义的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述氯过氧化物酶存在的缺点，提供一种 能够有效提高氯过氧化物酶的催化活性，改善其高温热稳定性及对有机溶剂的抗失 活性能的小分子脂肪酸化学修饰氯过氧化物酶的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是由下述步骤组成：

1、配制溶液

将小分子脂肪酸溶于质量分数为4％的二甲基亚砜水溶液中，配制浓度为 0.5mmol/L的小分子脂肪酸溶液；将氯过氧化物酶溶于pH值为5.0的磷酸缓冲液中， 配制浓度为5×10^-6mol/L的氯过氧化物酶溶液。

上述的小分子脂肪酸为十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸中的任意 一种。

2、预处理透析袋

将透析袋用体积分数为50％的乙醇水溶液煮沸1小时，冷却，依次用体积分数 为50％的乙醇水溶液、0.01mol/L的NaHCO₃水溶液、0.001mol/L的乙二胺四乙酸 水溶液、蒸馏水洗涤，再浸泡于蒸馏水中，放置在4℃冰箱中待用。

3、修饰反应

将浓度为5×10^-6mol/L氯过氧化物酶溶液与浓度为0.5mmol/L的小分子脂肪 酸溶液混合，氯过氧化物酶与小分子脂肪酸的摩尔比为1∶15～30，置于冰浴中， 密封搅拌30～60分钟。

4、后处理

将修饰反应后的溶液转入步骤2预处理的透析袋中，放在4℃冰箱中，用pH 值为5.0的磷酸缓冲液透析48小时，得到小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶。

本发明的小分子脂肪酸优选为十八酸或二十酸或二十二酸，最佳为十八酸。

本发明的修饰反应步骤3中，氯过氧化物酶与小分子脂肪酸溶液的最佳摩尔比 为1∶20。

本发明采用十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸等小分子脂肪酸对氯 过氧化物酶进行化学修饰后，不仅有效提高了氯过氧化物酶的催化活性，而且改善 了其高温热稳定性及对有机溶剂的抗失活能力。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

1、配制溶液

将0.142g十八酸溶于质量分数为4％的二甲基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度 为0.5mmol/L的十八酸溶液100mL；将100μL5×10^-4mol/L的氯过氧化物酶溶液 用pH值为5.0的磷酸缓冲液稀释至100mL，配制成浓度为5×10^-6mol/L的氯过氧 化物酶溶液。

2、预处理透析袋

将透析袋用150mL体积分数为50％的乙醇水溶液煮沸1小时，冷却，依次用体积 分数为50％的乙醇水溶液、0.01mol/L的NaHCO₃水溶液、0.001mol/L的乙二胺四乙 酸水溶液洗涤，再用蒸馏水洗涤，然后浸泡于蒸馏水中，放置在4℃冰箱中待用。

3、修饰反应

将3mL 5×10^-6mol/L的氯过氧化物酶溶液、0.6mL 0.5mmol/L的十八酸溶液在 5mL冻存管里混合均匀，氯过氧化物酶与十八酸的摩尔比为1∶20，置于冰浴中搅 拌60分钟。

4、后处理

将修饰反应后的溶液转入步骤2预处理的透析袋中，放在4℃冰箱中，用pH 值为5.0的磷酸缓冲液透析48小时，得到十八酸修饰的氯过氧化物酶。

实施例2

在实施例1的配制溶液步骤1中，将0.1g十二酸溶于质量分数为4％的二甲基 亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0.5mmol/L的十二酸溶液100mL，该步骤的其他 步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将3mL 5×10^-6mol/L的氯过氧化物 酶溶液、0.6mL 0.5mmol/L的十二酸溶液在5mL冻存管里混合均匀，置于冰浴中搅 拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成十二酸修饰的氯过氧化物酶。

实施例3

在实施例1的配制溶液步骤1中，将0.114g十四酸溶于质量分数为4％的二甲 基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0.5mmol/L的十四酸溶液100mL，该步骤的其 他步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将3mL 5×10^-6mol/L的氯过氧化 物酶溶液、0.6mL 0.5mmol/L的十四酸溶液在5mL冻存管里混合均匀，置于冰浴中 搅拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成十四酸修饰的氯过氧化物酶。

实施例4

在实施例1的配制溶液步骤1中，将0.156g二十酸溶于质量分数为4％的二甲 基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0.5mmol/L的二十酸溶液100mL，该步骤的其 他步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将3mL 5×10^-6mol/L的氯过氧化 物酶溶液、0.6mL 0.5mmol/L的二十酸溶液在5mL冻存管里混合均匀，置于冰浴中 搅拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成二十酸修饰的氯过氧化物酶。

实施例5

在实施例1的配制溶液步骤1中，将0.171g 二十二酸溶于质量分数为4％的二 甲基亚砜的磷酸缓冲液中，配制浓度为0.5mmol/L的二十二酸溶液100mL，该步骤 的其他步骤与实施例1相同。在修饰反应步骤3中，将3mL 5×10^-6mol/L的氯过 氧化物酶溶液、0.6mL 0.5mmol/L的二十二酸溶液在5mL冻存管里混合均匀，置于 冰浴中搅拌60分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成二十二酸修饰的氯过氧化 物酶。

实施例6

在实施例1的修饰反应步骤3中，将2mL 5×10^-6mol/L的氯过氧化物酶溶液、 0.3mL 0.5mmol/L的十八酸溶液在5mL冻存管里混合均匀，氯过氧化物酶与十八酸 的摩尔比为1∶15，置于冰浴中搅拌45分钟。其他步骤与实施例1相同，制备成十 八酸修饰的氯过氧化物酶。

本实施例浓度为0.5mmol/L的十八酸溶液也可用等体积0.5mmol/L的十二酸溶 液替换，还可用等体积0.5mmol/L的十四酸溶液或0.5mmol/L的二十酸溶液或 0.5mmol/L的二十二酸溶液替换，制备成十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰 的氯过氧化物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶或二十二酸修饰的氯过氧化物酶。

实施例7

在实施例1的修饰反应步骤3中，将3mL 5×10^-6mol/L的氯过氧化物酶溶液、 0.9mL 0.5mmol/L的十八酸溶液在5mL冻存管里混合均匀，氯过氧化物酶与十八酸 溶液的摩尔比为1∶30，置于冰浴中搅拌30分钟。其他步骤与实施例1相同，制备 成十八酸修饰的氯过氧化物酶。

本实施例浓度为0.5mmol/L的十八酸溶液也可用等体积0.5mmol/L的十二酸溶 液替换，还可用0.5mmol/L的十四酸溶液或0.5mmol/L的二十酸溶液或0.5mmol/L 的二十二酸溶液替换，制备成十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰的氯过氧化 物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶或二十二酸修饰的氯过氧化物酶。

为了证明本发明的有益效果，发明人采用实施例1～5制备的小分子脂肪酸修 饰的氯过氧化物酶进行了各种试验，具体试验情况如下：

1、氯化活性

分别以氯过氧化物酶、十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰的氯过氧化物 酶、十八酸修饰的氯过氧化物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶、二十二酸修饰的氯 过氧化物酶为催化剂，催化2-氯-5，5-二甲基-1，3-环己二酮生成2，2-二氯-5，5-二 甲基-1，3-环己二酮的氯化反应，比较氯过氧化物酶与小分子脂肪酸修饰的氯过氧 化物酶的氯化活性，实验结果见表1。

表1氯过氧化物酶及小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶的氯化活性

由表1可见，经十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸修饰后的氯过氧 化物酶在室温下催化2-氯-5，5-二甲基-1，3-环己二酮生成2，2-二氯-5，5-二甲基 -1，3-环己二酮的氯化活性有较大幅度的提高，且随着碳链长度的增加，修饰后的 氯过氧化物酶的氯化活性先增大后减小，其中以十八酸修饰的氯过氧化物酶的催化 效果最佳，可将氯过氧化物酶的氯化活性提高82％，说明小分子脂肪酸修饰对氯过 氧化物酶的催化活性的影响与其碳链长度相关。

2、高温热稳定性

将氯过氧化物酶、十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰的氯过氧化物酶、 十八酸修饰的氯过氧化物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶、二十二酸修饰的氯过氧 化物酶置于恒温箱50℃温育2小时，再分别用于催化2-氯-5，5-二甲基-1，3-环己二 酮生成2，2-二氯-5，5-二甲基-1，3-环己二酮的氯化反应，计算其残余活性，即氯过 氧化物酶在50℃温育2小时后所残留的活性与其未温育前的活性之比，结果见表2。

表2氯过氧化物酶及小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶的高温热稳定性

由表2可见，经十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸修饰后的氯过氧 化物酶的热稳定性也有明显改善，而且随着碳链长度的增加，修饰后的氯过氧化物 酶的残余活性先增大后减小，其中50℃时温育2小时后十八酸修饰的氯过氧化物酶 的氯化活性可保留43％，相对于未修饰的氯过氧化物酶的残余活性(11％)提高了32％， 说明小分子脂肪酸修饰对氯过氧化物酶的热稳定性的影响也与其碳链长度相关。

3、有机溶剂中抗失活能力

将氯过氧化物酶、十二酸修饰的氯过氧化物酶、十四酸修饰的氯过氧化物酶、 十八酸修饰的氯过氧化物酶、二十酸修饰的氯过氧化物酶、二十二酸修饰的氯过氧 化物酶分别加入体积分数均为10％的二甲基亚砜、甲醇、1，4-二氧六环、N，N-二甲 基甲酰胺水溶液中，通过测试其在水-有机溶剂混合溶剂中常温温育半小时后的残 余活性与氯过氧化物酶在pH值为5.0的磷酸缓冲液中的活性的比值来评价小分子脂 肪酸修饰的氯过氧化物酶在有机溶剂中的抗失活能力，结果见表3。

表3氯过氧化物酶及小分子脂肪酸修饰的氯过氧化物酶在有机溶剂中的抗失活能力

  二甲基亚砜   甲醇   1，4-二氧六环   N，N-二甲基甲酰胺 氯过氧化物酶   24％   28％   19％   20％ 十二酸修饰的氯过氧化物酶   40％   42％   31％   28％ 十四酸修饰的氯过氧化物酶   43％   50％   40％   32％ 十八酸修饰的氯过氧化物酶   63％   65％   56％   58％ 二十酸修饰的氯过氧化物酶   60％   59％   51％   52％ 二十二酸修饰的氯过氧化物酶   52％   54％   45％   48％

由表3可见，氯过氧化物酶属于不耐有机溶剂酶，在有机溶剂中的活性下降， 但经十二酸、十四酸、十八酸、二十酸、二十二酸修饰后的氯过氧化物酶的活性下 降程度远比氯过氧化物酶缓和，其中以十八酸修饰的氯过氧化物酶对有机溶剂的耐 受性最好。

综合实验1～3的结果，本发明采用小分子脂肪酸十二酸、十四酸、十八酸、 二十酸、二十二酸修饰后的氯过氧化物酶，其在常温下的催化活性、高温热稳定性 及对有机溶剂的抗失活能力均明显提高。