乳酸双芽菌发酵液的制备方法及利用该发酵液制备乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的方法

摘要

乳酸双芽菌发酵液的制备方法及利用该发酵液制备乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的方法，涉及乳酸双芽菌发酵液的制备方法及制备乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的方法。要解决现有乳酸双芽菌的制备工艺复杂，其防腐剂的制备存在生产成本高和产量低的问题。发酵液制备方法：菌液活化；从四种菌的活化菌液中提取菌体；将菌体混合，接种于发酵罐中发酵，得发酵液；将发酵液培养，即可完发酵液的制备。复合防腐剂制备方法：将乳酸链球菌素、纳他霉素、丙酸、竹叶抗氧化物、壳聚糖、乙二胺四乙酸二钠、乙醇、生育酚和活化水混合；将混合液和发酵液混合，反应，即可完成复合防腐剂的制备。本发明制备工艺简单、成本低、产量高。用于食品防腐。

说明书

技术领域

本发明涉及一种乳酸双芽菌发酵液的制备方法及利用该乳酸双芽菌发酵液制备乳酸 双芽菌发酵液复合防腐剂的方法。

背景技术

乳酸双芽菌是生物食品防腐剂，其杀菌抑菌能力广泛，效果很好。抑菌机理是建立 酶生物合成和活性调节模式，在微生物的细胞膜上形成微孔，导致膜通透性增加、能量 系统破坏和食品毒素破坏，保证食物中不产生过敏原，因而能迅速的杀灭食品中的微生 物，并对食品中的少量微生物进行抑制，避免其繁殖和水溶性糖蛋白免疫反应，从而达 到防腐保鲜的目的。

目前，乳酸双芽菌的制备工艺复杂，生产中需要经过大量排污反应处理等工艺技术， 且常使用化学合成原料，易产生异味。其防腐剂的制备存在生产成本高(高达25000元/ 吨)，产量低，即以投资额定量为生产核算，投资1000万元，仅可建5000吨/年的生产线。

发明内容

本发明是要解决现有乳酸双芽菌的制备工艺复杂，其防腐剂的制备存在生产成本高 和产量低的问题，提供乳酸双芽菌发酵液的制备方法及利用该发酵液制备乳酸双芽菌发酵 液复合防腐剂的方法。

本发明乳酸双芽菌发酵液的制备方法，按以下步骤进行：一、分别对乳酸乳球菌、 嗜热脂环酸芽孢杆菌、球芽孢杆菌和二芽孢接合酵母进行活化，得四种菌的活化菌液；二、 从四种菌的活化菌液中提取四种菌的菌体；三、将步骤二得到的四种菌的菌体按菌体数量 比1∶1∶1∶1进行混合，然后接种于装有发酵培养基的发酵罐中，接种量为8％～12％，在 发酵温度为29～31℃、摇床速度为100～150r/min的条件下发酵45～50h，得发酵液；四、 将发酵液置于摇床上于100～150r/min培养45～50h，即可完成乳酸双芽菌发酵液的制备。

利用上述乳酸双芽菌发酵液制备乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的方法，按以下步骤 进行：一、按体积份数将1～3份的乳酸链球菌素、1～5份的纳他霉素、1～5份的丙酸、 2～8份的竹叶抗氧化物、2～5份的壳聚糖、2～4份的乙二胺四乙酸二钠、0.2～0.8份的 体积百分比浓度为75％的乙醇、0.2～0.6份的生育酚和75～85份的活化水混合，得到混 合液；二、按体积百分比将75～80份的混合液和20～25份的乳酸双芽菌发酵液混合，在 45～55℃下反应1～3h，即可完成乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的制备。

本发明乳酸双芽菌发酵液的制备工艺简单，不需要经过大量排污反应处理，在生产 过程中无化学合成原料，在发酵过程中有少量培养基残留物，残留物为发酵液的0.75％(即 100kg发酵液，有0.75kg残留物)，在生产过程中不产生三废，不排污，无异味，各种生 产罐内均为封闭式低温发酵和配制，卫生环境整洁，室内空气无污染源，清洗罐用水回收， 排放为零。

本发明方法制备乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的成本低，为15000元/吨；产量高， 投资1000万元，可建6000吨/年的生产线。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任 意组合。

具体实施方式一：本实施方式乳酸双芽菌发酵液的制备方法，按以下步骤进行：一、 分别对乳酸乳球菌、嗜热脂环酸芽孢杆菌、球芽孢杆菌和二芽孢接合酵母进行活化，得四 种菌的活化菌液；二、从四种菌的活化菌液中提取四种菌的菌体；三、将步骤二得到的四 种菌的菌体按菌体数量比1∶1∶1∶1进行混合，然后接种于装有发酵培养基的发酵罐中，接 种量为8％～12％(体积)，在发酵温度为29～31℃、摇床速度为100～150r/min的条件下 发酵45～50h，得发酵液；四、将发酵液置于摇床上于100～150r/min培养45～50h，即 可完成乳酸双芽菌发酵液的制备。

本实施方式乳酸双芽菌发酵液的制备工艺简单，不需要经过大量排污反应处理，在生 产过程中无化学合成原料，在发酵过程中有少量培养基残留物，残留物为发酵液的0.75％ (即100kg发酵液，有0.75kg残留物)，在生产过程中不产生三废，不排污，无异味，各 种生产罐内均为封闭式低温发酵和配制，卫生环境整洁，室内空气无污染源，清洗罐用水 回收，排放为零。

本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液为橙黄色液体，略带竹叶粽子香气。

本实施方式步骤一所述乳酸乳球菌购买自中国科学院微生物研究所普通微生物菌种 保藏管理中心，菌种保藏编号为ACCC 10535r，保藏日期为2001年6月1日。

本实施方式步骤一所述嗜热脂环酸芽孢杆菌购买自中国科学院微生物研究所普通微 生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为ACCC 1022lr，保藏日期为2006年6月8日。

本实施方式步骤一所述球芽孢杆菌购买自中国科学院上海生物化学研究所，菌种保藏 编号为1.1202，保藏日期为2008年5月9日。

本实施方式步骤一所述二孢接合酵母购买自中国广东省微生物研究所，菌种保藏编号 为2.1529，保藏日期为2006年6月5日。

对本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液进行毒理检测：鲁疾控毒检字(2011020号)， 检测报告CNSSL0119(bw)。乳酸双芽菌发酵液，大鼠(磁、雄性)急性经口毒理试验 MTD＞10000mg/kg(bw)；14天的观察期内，动物大体病检未见明显病理改变，未见明 显的急性中毒反应，亦无动物死亡，实验结束时处死动物，进行大体解剖，各脏器未见明 显异常。结果表明该发酵液属无毒级，质量标准：符合Q/LYC01-2010。

本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液进行感官指标检测，结果如表1所示：

表1

本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液进行理化指标检测，结果如表2所示：

表2

本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液进行污染物指标检测，结果如表3所示：

表3

本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液进行微生物指标检测，结果如表4所示：

表4

将本实施方式的乳酸双芽菌发酵液添加到食品中起到杀灭和抑制酵母、霉菌、细菌 的作用。在使用时，可以直接向食品中加入乳酸双芽菌发酵液，也可以将发酵液经喷雾干 燥制成粉剂加入到食品中。

本实施方式所得乳酸双芽菌发酵液对人体安全无害，在消化道内降解为食物的正常成 份，不影响药用抗菌素的作用，杀菌抑菌能力强，具有很强的杀灭和抑制酵母、霉菌、细 菌的作用(对真菌同样具有抑制作用)，经中国食品发酵工业研究院多次试验表明，在添 加量及实验条件完全相同的情况下，对黑曲霉、桔青霉、酿酒酵母、大肠杆菌、枯草芽孢 杆菌、金黄色葡萄球菌等受试菌，乳酸双芽菌的抑菌效果普遍高于山梨酸钾，尤其是对引 起食品腐败的酵母菌，霉菌，细菌作用最强。一般情况下，本实施方式制备的乳酸双芽菌 发酵液添加到食品中的质量百分比浓度为0.1％～0.15％，其抑制霉菌的有效质量百分比浓 度为0.004％～0.08％，抑制细菌的有效质量百分比浓度为0.0012％～0.15％。

本实施方式乳酸双芽菌发酵液添加到食品中的质量百分比浓度为0.3％可杀灭以下菌 属，乳酸双芽菌发酵液添加到食品中的质量百分比浓度为0.1％可抑制以下菌属：假单胞 菌属，微球菌属，芽孢杆菌属，弧菌属，嗜盐杆菌属，霉菌，乳杆菌属，黑曲霉，黄曲霉， 桔青霉，大肠杆菌，普通变形杆菌，干酪乳杆菌，胚芽乳杆菌，需氧芽孢杆菌，革兰氏阴 性菌，革兰氏阳性菌，肉毒梭状芽孢杆菌，志贺氏菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，溶血 性链球菌等；可见本实施方式所得乳酸双芽菌发酵液的抑菌范围广。

本实施方式所得乳酸双芽菌发酵液对食品的酸碱性稳定，适应各种酸碱度的食品，如 猪肉、牛肉制品，水产品，鱼类制品，腌制酸菜、泡菜，未腌制的辣白菜，腌黄瓜、萝卜 干等，酱制品(黄豆酱、东北大酱、农家酱、蚕豆酱等)，蔬菜类，调味品(酱油、生抽、 老抽、料酒、黄油、米酒等)，干调香料类，果脯蜜饯馅料，饮品类、豆制品类，米制品 类及淀粉糕点类，在奶制品中添加乳酸双芽菌发酵液的质量百分比浓度不得超过1％；可 见本实施方式所得乳酸双芽菌发酵液的使用量小，应用范围广。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中分别对乳酸乳 球菌、嗜热脂环酸芽孢杆菌、球芽孢杆菌和二芽孢接合酵母进行活化的方法为：将浓度为 0.05～0.15g/kg的乳酸乳球菌菌液按8％～12％(体积)的接种量接种于培养基A中，将 浓度为0.1～0.2g/kg的嗜热脂环酸芽孢杆菌菌液按8％～12％(体积)的接种量接种于培 养基B中，将浓度为0.05～0.15g/kg的球芽孢杆菌菌液按8％～12％(体积)的接种量接 种于培养基C中，将浓度为0.2～0.4g/kg的二芽孢接合酵母菌液按8％～12％(体积)的 接种量接种于培养基D中，然后于28～32℃恒温培养箱中培养45～50h，即完成活化； 其中每200mL培养基A由2g葡萄糖、1g牛肉膏、1g乳糖、2g蛋白胨、1g酵母提取物 和余量的蒸馏水组成；每5000mL培养基B由2000mL溶液a、2000mL溶液b和1000mL 蒸馏水组成，所述2000mL溶液a由6g磷酸二氢钾、4g酵母膏和余量的蒸馏水组成，所 述2000mL溶液b由0.2g硫酸锌、0.4g氯化钴、0.6g硼酸、0.06g钼酸钠和余量的蒸馏水 组成；每1000mL培养基C由10g棉籽精粉、0.6g牛肉浸膏和余量的蒸馏水组成；培养 基D为麦芽汁。其它与具体实施方式一相同。

本实施方式所述培养基B中的溶液a和溶液b单独灭菌。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中从四种菌 的活化菌液中提取四种菌的菌体的方法为：将四种菌的活化菌液分别离心，乳酸乳球菌活 化菌液、嗜热脂环酸芽孢杆菌活化菌液和球芽孢杆菌活化菌液于2500～3500r/min离心 25～35min，二芽孢接合酵母活化菌液于2500～3500r/min离心10～20min，然后分别收 集四种菌体，再采用0.4mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液洗涤四种菌体3～5次，离心 收集菌体，即得到四种菌的菌体。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中接种 量为8％。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中接种 量为12％。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中接种 量为9％～11％。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中接种 量为10％。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中发酵 温度为29℃。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中发酵 温度为31℃。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中发酵 温度为30℃。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤三中摇 床速度为110～140r/min。其它与具体实施方式一至十之一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是：步骤三中摇 床速度为120r/min。其它与具体实施方式一至十之一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤三中 发酵46～49h。其它与具体实施方式一至十二之一相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是：步骤三中 发酵48h。其它与具体实施方式一至十二之一相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一至十四之一不同的是：步骤三中 每2000mL发酵培养基由20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、4g NH₄NO₃、0.4g MgSO₄·7H₂O、 0.01g MgSO₄、0.01g FeSO₄·7H₂O、0.2g CaCl₂·2H₂O、6g酵母膏、0.6g多胨和余量的蒸馏 水组成。其它与具体实施方式一至十四之一相同。

本实施方式所述发酵培养基灭菌后，用1mol/L的半碳酸钠无菌溶液调节为pH值至 9.7。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是：步骤四中 将发酵液置于摇床上于110～140r/min培养46～49h。其它与具体实施方式一至十五之一 相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式一至十五之一不同的是：步骤四中 将发酵液置于摇床上于120r/min培养48h。其它与具体实施方式一至十五之一相同。

具体实施方式十八：本实施方式乳酸双芽菌发酵液的制备方法，按以下步骤进行： 一、分别对乳酸乳球菌、嗜热脂环酸芽孢杆菌、球芽孢杆菌和二芽孢接合酵母进行活化， 得四种菌的活化菌液；二、从四种菌的活化菌液中提取四种菌的菌体；三、将步骤二得到 的四种菌的菌体按菌体数量比1∶1∶1∶1进行混合，然后接种于装有发酵培养基的发酵罐 中，接种量为10％(体积)，在发酵温度为30℃、摇床速度为120r/min的条件下发酵48h， 得发酵液；四、将发酵液置于摇床上于120r/min培养48h，即可完成乳酸双芽菌发酵液的 制备。

本实施方式步骤一中分别对乳酸乳球菌、嗜热脂环酸芽孢杆菌、球芽孢杆菌和二芽 孢接合酵母进行活化的方法为：将浓度为0.1g/kg的乳酸乳球菌菌液按10％(体积)的接 种量接种于培养基A中，将浓度为0.15g/kg的嗜热脂环酸芽孢杆菌菌液按10％(体积) 的接种量接种于培养基B中，将浓度为0.1g/kg的球芽孢杆菌菌液按10％(体积)的接种 量接种于培养基C中，将浓度为0.3g/kg的二芽孢接合酵母菌液按10％(体积)的接种量 接种于培养基D中，然后于30℃恒温培养箱中培养48h，即完成活化；其中每200mL培 养基A由2g葡萄糖、1g牛肉膏、1g乳糖、2g蛋白胨、1g酵母提取物和余量的蒸馏水组 成；每5000mL培养基B由2000mL溶液a、2000mL溶液b和1000mL蒸馏水组成，所 述2000mL溶液a由6g磷酸二氢钾、4g酵母膏和余量的蒸馏水组成，所述2000mL溶液 b由0.2g硫酸锌、0.4g氯化钴、0.6g硼酸、0.06g钼酸钠和余量的蒸馏水组成；每1000mL 培养基C由10g棉籽精粉、0.6g牛肉浸膏和余量的蒸馏水组成；培养基D为麦芽汁。

本实施方式步骤二中从四种菌的活化菌液中提取四种菌的菌体的方法为：将四种菌 的活化菌液分别离心，乳酸乳球菌活化菌液、嗜热脂环酸芽孢杆菌活化菌液和球芽孢杆菌 活化菌液于3000r/min离心30min，二芽孢接合酵母活化菌液于3000r/min离心15min，然 后分别收集四种菌体，再采用0.4mol/L、pH值为7.5的磷酸盐缓冲液洗涤四种菌体3次， 离心收集菌体，即得到四种菌的菌体。

本实施方式乳酸双芽菌发酵液的制备工艺简单，不需要经过大量排污反应处理，在 生产过程中无化学合成原料，在发酵过程中有少量培养基残留物，残留物为发酵液的 0.75％(即100kg发酵液，有0.75kg残留物)，在生产过程中不产生三废，不排污，无异 味，各种生产罐内均为封闭式低温发酵和配制，卫生环境整洁，室内空气无污染源，清洗 罐用水回收，排放为零。

具体实施方式十九：本实施方式利用乳酸双芽菌发酵液制备乳酸双芽菌发酵液复合 防腐剂的方法，按以下步骤进行：一、按体积份数将1～3份的乳酸链球菌素、1～5份的 纳他霉素、1～5份的丙酸、2～8份的竹叶抗氧化物、2～5份的壳聚糖、2～4份的乙二胺 四乙酸二钠、0.2～0.8份的体积百分比浓度为75％的乙醇、0.2～0.6份的生育酚和75～85 份的活化水混合，得到混合液；二、按体积百分比将75～80份的混合液和20～25份的乳 酸双芽菌发酵液混合，在45～55℃下反应1～3h，即可完成乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂 的制备。

本实施方式制备的复合防腐剂在使用时直接添加到食品中，添加量为0.1g/kg。

步骤一所述活化水是由二级反渗透水处理设备制得。

乙醇是在GB2760-2007中规定了食品加工中允许使用的助剂。

壳聚糖作为被膜剂的使用，是在GB2760-2007功能中规定的增稠剂，被膜剂。

生育酚作为抗氧化剂使用，是在GB2760-2007功能中规定的抗氧化剂。

本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂，在食品中添加同样剂量比化学防 腐苯甲酸钠的有效保质期高10倍，比山梨酸钾有效保质期高6倍。

对本实施方式制备的乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂进行毒理检测：鲁疾控毒检字 (2011020号)检测报告CNASL0119。乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂，大鼠急性经口毒 性试验MTD＞10000mL/kg(bw)。14天的观察期内，动物大体病检未见明显病理改变(未 见明显的急性中毒反应，异无动物死亡，试验结束时处死动物，进行大体解剖，各器脏未 见明显异常)。结果表明该复合防腐剂属于实际无毒级。

乳酸链球菌素的CNS号为17.019，纳他霉素的CNS号为10.030，丙酸的CNS号为 17.029、17.005或17.006，竹叶抗氧化物的CNS号为04.019，壳聚糖的CNS号为20.026， 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)为GB2760-2007规范性附录C表C.1生产加工助剂，乙醇为 GB2760-2007规范性附录C表C.1生产加工助剂，生育酚(Dl-a-生育酚、维生素E)的 CNS号04.016。

具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式十九不同的是：步骤一中按体积份 数将2份的乳酸链球菌素、2～4份的纳他霉素、2～4份的丙酸、4～6份的竹叶抗氧化物、 3～4份的壳聚糖、3份的乙二胺四乙酸二钠、0.4～0.6份的体积百分比浓度为75％的乙醇、 0.3～0.5份的生育酚和78～82份的活化水混合。其它与具体实施方式十九相同。

具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式十九不同的是：步骤一中按体积 份数将2份的乳酸链球菌素、3份的纳他霉素、3份的丙酸、5份的竹叶抗氧化物、3.5份 的壳聚糖、3份的乙二胺四乙酸二钠、0.5份的体积百分比浓度为75％的乙醇、0.4份的生 育酚和80份的活化水混合。其它与具体实施方式十九相同。

具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式十九不同的是：步骤一中按体积 份数将2.5份的乳酸链球菌素、2份的纳他霉素、3份的丙酸、5份的竹叶抗氧化物、3.5 份的壳聚糖、3份的乙二胺四乙酸二钠、0.5份的体积百分比浓度为75％的乙醇、0.5份的 生育酚和80份的活化水混合。其它与具体实施方式十九相同。

具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式十九至二十二之一不同的是：步 骤二中按体积百分比将76～79份的混合液和21～24份的乳酸双芽菌发酵液混合。其它与 具体实施方式十九至二十二之一相同。

具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式十九至二十二之一不同的是：步 骤二中按体积百分比将78份的混合液和22份的乳酸双芽菌发酵液混合。其它与具体实施 方式十九至二十二之一相同。

具体实施方式二十五：本实施方式与具体实施方式十九至二十二之一不同的是：步 骤二中按体积百分比将77份的混合液和23份的乳酸双芽菌发酵液混合。其它与具体实施 方式十九至二十二之一相同。

具体实施方式二十六：本实施方式与具体实施方式十九至二十五之一不同的是：步 骤二中在45℃下反应1h。其它与具体实施方式十九至二十五之一相同。

具体实施方式二十七：本实施方式与具体实施方式十九至二十五之一不同的是：步 骤二中在55℃下反应3h。其它与具体实施方式十九至二十五之一相同。

具体实施方式二十八：本实施方式与具体实施方式十九至二十五之一不同的是：步 骤二中在50℃下反应2h。其它与具体实施方式十九至二十五之一相同。

具体实施方式二十九：本实施方式利用乳酸双芽菌发酵液制备乳酸双芽菌发酵液复合 防腐剂的方法，按以下步骤进行：一、按体积份数将2.5份的乳酸链球菌素、2份的纳他 霉素、3份的丙酸、5份的竹叶抗氧化物、3.5份的壳聚糖、3份的乙二胺四乙酸二钠、0.5 份的体积百分比浓度为75％的乙醇、0.5份的生育酚和80份的活化水混合，得到混合液； 二、按体积百分比将78份的混合液和22份的乳酸双芽菌发酵液混合，在48℃下反应2h， 即可完成乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的制备。

本实施方式制备乳酸双芽菌发酵液复合防腐剂的方法成本低，为15000元/吨；产量 高，投资1000万元，可建6000吨/年的生产线。