一种用金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法

摘要

本发明的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化植物组织基因组DNA的方法。本发明裂解样品是采用两种裂解液，其中第一种裂解液中含有质量体积比为2％～5％PVP、2％～5％CTAB和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇，第二种裂解液中含有3～6M盐酸胍、体积分数为2％～5％Triton X-100；混匀后于水浴中充分裂解5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA的样品裂解液。该纯化方法操作简便，纯化过程快速，无需分步裂解组织，极大程度的满足对多种植物及其不同部位基因组DNA的提取，具有纯化率高，DNA完整性好、纯度高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用金磁微粒纯化多种类型植物及不同部位的植物组织基 因组DNA的方法。

背景技术

利用带有目的基因的供体植物DNA直接转化受体，筛选目的性状变异后 代，是植物基因工程与分子生物技术在农业上的实际应用。从不同种属的植 物及其不同部位提取出质量较高的基因组DNA进行后续的PCR反应等下游 实验是一个关键环节，建立的方法对提取得到的基因组DNA的纯度及浓度有 较高要求。目前，植物组织基因组DNA提取方法都有很强的针对性，而且大 都只能从新鲜的植物叶片中提取，这样以来会对下游应用带来很大的局限性。

核酸纯化方法大体上可分为两种，一种是酚氯仿抽提液相纯化法，一种 是固相纯化法。酚氯仿抽提法主要通过有机相-水相分配来除去杂质达到纯化 核酸的目的。固相纯化法则通过核酸与固相介质的非特异可逆性结合，从而 达到纯化核酸的目的，其结合方式主要包括吸附结合和离子交换结合。

传统的几种植物基因组DNA提取方法存在一些缺点。如CTAB法和SDS 法需要酚氯仿反复抽提与离心，耗费大量的时间，人力、物力。此外，现有 的植物基因组DNA纯化的文献报道基本上都是针对某种植物的新鲜叶片，如 针对烟草的叶片、番茄叶片等开发的有针对性的方法。因为不同植物的组织 或同一植物的不同组织材料，由于其化学成分、组织结构等差异，在提取基因 组DNA时需选择不同的方法或作一些特殊的处理，这为实验带来极大的不 便。因此，研究通用、快速适于植物不同部位组织基因组DNA的方法也非常 重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用磁性纳米复合材料进行简便、快速纯化植 物组织基因组DNA的方法，以解决背景技术操作复杂、纯化率低、不具有通 用性等问题；可适用于纯化不同植物的组织及同一植物不同组织。

本发明的技术方案：

一种用金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)制备含有基因组DNA的样品裂解液

取植物组织样本，分别加入100～800μl的两种裂解液，其中第一种裂解液 中含有质量体积比为2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲 基溴化铵(CTAB)和体积分数为0.5％～2％β-巯基乙醇，第二种裂解液中含有 3～6M盐酸胍、体积分数为2％～5％Triton X-100；混匀后于水浴中充分裂解 5～30min，再加入10～50μl的10mg/ml RNase溶液，得到含有基因组DNA 的样品裂解液；(“质量体积比”的单位即g/ml，表示溶质的质量与该种裂解 液的体积的比)

2)用氯仿抽提后离心

用0.6ml～1.2ml氯仿在所述样品裂解液中进行样本抽提，然后8000rpm～ 13000rpm离心5min，得到含有基因组DNA的上清；

3)结合

取400～1000μg金磁微粒与含有基因组DNA的上清混合，在结合缓冲液 的作用下，形成含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液；

4)清洗

对含有金磁微粒-基因组DNA复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液， 再加入清洗液混匀，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-基因组DNA复合物；

5)洗脱

将洗脱液与金磁微粒-基因组DNA复合物混匀，使基因组DNA从金磁微 粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为 纯化得到的基因组DNA溶液。

上述步骤1)中所述第一种裂解液中含有质量体积浓度为2％～5％聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和体积分数为 0.5％～2％β-巯基乙醇，第二种裂解液中含有3～6M盐酸胍、体积分数为 2％～5％Triton X-100以及0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl 和0.05～0.2M Tris-HCl。

上述步骤3)中的结合缓冲液优选聚乙二醇与氯化钠的混合溶液，其中氯 化钠的终浓度为1M～3M，聚乙二醇(PEG)的分子量在6000～10000之间， 浓度为10％～30％；也可以选择公知的其他结合缓冲液。

上述步骤5)中所述洗脱液优选含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA、pH ＝8.0的TE溶液或无核酶水。

上述步骤2)采用氯仿只需进行一次样本抽提。

上述步骤4)中所述清洗液可以采用50％～85％的乙醇。

上述步骤1)中所述水浴的最佳温度为50～65℃。

本发明通过采用两种裂解液搭配使用，无需分步裂解组织，极大程度的 满足对多种植物及其不同部位基因组DNA的提取。

1、本发明使用了两种不同的裂解液——CTAB裂解和胍盐裂解，采用两 种裂解液搭配使用裂解植物组织细胞，可以囊括大部分种类的植物以及不同 部位的植物组织，满足从多种植物不同部位提取高质量的DNA的需求，得到 的DNA纯度高，不含有抑制下游PCR反应的抑制剂。

2、不需要反复抽提与离心，减少了机械使用中的物理性剪切，亦避免了 离心过程对基因组DNA的破坏。

3、不需要分步裂解，步骤简便，时间短，全部过程只需要35～60min左 右(根据不同样本，裂解的时间不同)，从而大大缩短了提取DNA的时间。

4、该纯化方法操作简便，纯化过程快速，得到的基因组DNA质量高成 本低廉；具有纯化率高，DNA完整性好、纯度高等优点。

5、可以适用多种植物基因组DNA的提取，如烟草、番茄、芦荟等；也 可用于同一植物不同组织基因组DNA的提取，如根、茎、叶片，幼苗等组织。

附图说明

图1是本发明提取的基因组DNA的电泳图；

其中泳道M：λHind III；

泳道1：从烟草叶片中提取的基因组DNA；

泳道2：从番茄幼苗中提取的基因组DNA

泳道3：从烟草根中提取的基因组DNA

泳道4：从烟草茎中提取的基因组DNA。

具体实施方式

利用磁性载体进行核酸纯化是近年来发展起来的一种DNA纯化的思路， 即利用具有超顺磁性的纳米或微米级球形颗粒作为固相介质来非特异性的吸 附核酸，在外加磁场的作用下将DNA-磁性微粒复合体与蛋白质、多糖等杂质 分离开来，可省去反复离心、过滤等繁杂的操作，减少了过多的机械剪切作 用对核酸造成的损伤，而当撤去磁场后，磁性微粒很快均匀分散于溶液中。 由于它具有操作简便、纯度高等特点，越来越受到人们的亲睐，并且它易于 实现自动化，满足了样本中大规模建库等高通量操作的需求。

金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面 包裹单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或 磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的 磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃等铁的氧化物粒子， 单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性 纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子 聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe 与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。

以下结合实施例对本发明即金磁微粒纯化植物组织基因组DNA的方法进 一步的说明。

实施例1：用金磁微粒从烟草叶片中纯化基因组DNA的方法

1)植物样本裂解

1.1)取新鲜植物叶片组织100mg用蒸馏水清洗干净，将表面水分擦干，剪 碎后置于2ml离心管中，加入液氮研磨。在组织解冻前加入100μl裂解液1 【2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、 0.5％～2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl， 0.05～0.2M Tris-HCl】和100μl裂解液2(3～6M GuHCl、2％～5％Triton X-100)， 混匀后65℃水浴25min(期间每隔5min颠倒离心管1次)。

1.2)在离心管中加入10μl 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混匀，于37℃水 浴5min，取出离心管。

2)氯仿抽提

在离心管中加入0.7ml氯仿，轻摇5min充分混匀离心管中成分，于室温， 8000rpm～13000rpm离心5min。

3)结合

3.1)充分摇匀金磁微粒，用移液器移取100μl金磁微粒于一新的2ml离 心管中，磁性分离1min，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200μl 结合液，吹吸混匀。

3.2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约200 μl，勿吸取到有机相)于步骤3.1)的离心管中，吹吸混匀，于室温充分结合， 室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。

4)清洗

4.1)在离心管中加入200μl清洗液1，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。

4.2)在离心管中加入200μl清洗液2，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。重复此步骤一次。

5)洗脱

打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。

在离心管中加入100μl洗脱液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH ＝8.0)，移液器吹打混匀，于60℃水浴5min。磁性分离直至上清澄清，上清 即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验 或于-20℃低温保存。

根据紫外分光光度计测得结果显示，从100mg的烟草叶片中可得到 15～30μg的基因组DNA，纯度在1.7～1.9之间。

实施例2：用金磁微粒从番茄幼苗中纯化基因组DNA的方法

1)植物样本裂解

1.1)取新鲜番茄幼苗组织100mg用蒸馏水清洗干净，将表面水分擦干，剪 碎后置于2ml离心管中，加入液氮研磨。在组织解冻前加入200μl裂解液1 【2％～5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、 0.5％～2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl， 0.05～0.2M Tris-HCl】和200μl裂解液2(3～6M GuHCl、2％～5％Triton X-100)， 混匀后65℃水浴25min(期间每隔5min颠倒离心管1次)。

1.2)在离心管中加入10μl 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混匀，于37℃水 浴5min，取出离心管。

2)氯仿抽提

在离心管中加入0.8ml氯仿，轻摇5min充分混匀离心管中成分，于室温， 8000rpm～13000rpm离心5min。

3)结合

3.1)充分摇匀金磁微粒，用移液器移取100μl金磁微粒于一新的2ml离 心管中，磁性分离1min，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200μl 结合液，吹吸混匀。

3.2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约200 μl，勿吸取到有机相)于步骤3.1)的离心管中，吹吸混匀，于室温充分结合， 室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。

4)清洗

4.1)在离心管中加入200μl清洗液1，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。

4.2)在离心管中加入200μl清洗液2，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。重复此步骤一次。

5)洗脱

打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。

在离心管中加入100μl洗脱液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH ＝8.0)，移液器吹打混匀，于60℃水浴5min。磁性分离直至上清澄清，上清 即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验 或于-20℃低温保存。

根据紫外分光光度计测得结果显示，从100mg的番茄幼苗中可得到 10～20μg的基因组DNA，纯度在1.7～1.9之间。

实施例3：用金磁微粒从烟草根中纯化基因组DNA的方法

1)植物样本裂解

1.1)取新鲜烟草根100mg用蒸馏水清洗干净，将表面水分擦干，剪碎后置 于2ml离心管中，加入液氮研磨。在组织解冻前加入400μl裂解液1【2％～ 5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.5％～ 2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl，0.05～0.2M  Tris-HCl】和400μl裂解液2(3～6M GuHCl、2％～5％Triton X-100)，混匀后 65℃水浴25min(期间每隔5min颠倒离心管1次)。

1.2)在离心管中加入10μl 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混匀，于37℃水 浴5min，取出离心管。

2)氯仿抽提

在离心管中加入0.6ml氯仿，轻摇5min充分混匀离心管中成分，于室温， 8000rpm～13000rpm离心5min。

3)结合

3.1)充分摇匀金磁微粒，用移液器移取100μl金磁微粒于一新的2ml离 心管中，磁性分离1min，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200μl 结合液，吹吸混匀。

3.2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约200 μl，勿吸取到有机相)于步骤3.1)的离心管中，吹吸混匀，于室温充分结合， 室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。

4)清洗

4.1)在离心管中加入200μl清洗液1，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。

4.2)在离心管中加入200μl清洗液2，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。重复此步骤一次。

5)洗脱

打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。

在离心管中加入100μl洗脱液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH ＝8.0)，移液器吹打混匀，于60℃水浴5min。磁性分离直至上清澄清，上清 即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验 或于-20℃低温保存。

根据紫外分光光度计测得结果显示，从100mg的烟草的根中可得到 5～10μg的基因组DNA，纯度在1.7～1.9之间。

实施例4：用金磁微粒从烟草茎中纯化基因组DNA的方法

1)植物样本裂解

1.1)取新鲜烟草茎100mg用蒸馏水清洗干净，将表面水分擦干，剪碎后置 于2ml离心管中，加入液氮研磨。在组织解冻前加入400μl裂解液1【2％～ 5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2％～5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.5％～ 2％β-巯基乙醇、0.005～0.01M乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5～2M NaCl，0.05～0.2M Tris-HCl】和400μl裂解液2(3～6M GuHCl、2％～5％Triton X-100)，混匀后 65℃水浴25min(期间每隔5min颠倒离心管1次)。

1.2)在离心管中加入10μl 10mg/ml的RNase溶液，吹吸混匀，于37℃水 浴5min，取出离心管。

2)氯仿抽提

在离心管中加入0.6ml氯仿，轻摇5min充分混匀离心管中成分，于室温， 8000rpm～13000rpm离心5min。

3)结合

3.1)充分摇匀金磁微粒，用移液器移取100μl金磁微粒于一新的2ml离 心管中，磁性分离1min，弃上清。从磁性分离器上取出离心管，加入200μl 结合液，吹吸混匀。

3.2)从离心机中取出离心管，吸取上清(此步骤尽量小心吸取上清约200 μl，勿吸取到有机相)于步骤3.1)的离心管中，吹吸混匀，于室温充分结合， 室温静置5min，磁性分离2min，弃上清。

4)清洗

4.1)在离心管中加入200μl清洗液1，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。

4.2)在离心管中加入200μl清洗液2，移液器吹吸混匀，磁性分离2min， 尽量弃上清。重复此步骤一次。

5)洗脱

打开离心管盖，将离心管置于磁性分离器上室温晾干5min。

在离心管中加入100μl洗脱液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH ＝8.0)，移液器吹打混匀，于60℃水浴5min。磁性分离直至上清澄清，上清 即为纯化的基因组DNA，将上清转移到另一离心管中，可直接用于后续实验 或于-20℃低温保存。

根据紫外分光光度计测得结果显示，从100mg的烟草的茎中可得到 5～10μg的基因组DNA，纯度在1.7～1.9之间。