以金磁微粒为载体的全血基因组DNA纯化方法研究

摘要

磁性复合微粒是由高分子或无机材料与磁性超细粉末(如铁的氧化物、铁、钴、镍等金属)构成的具有超顺磁性的胶态复合材料。近年来，结合磁性氧化物粒子和胶体金特点，Fe3O4/Au组成的无机·无机磁性复合微粒(简称金磁微粒)成为研究热点。由于具有粒径小，比表面积大，超顺磁性及可修饰生物分子等特性，借助外加磁场的使用，这种新型磁性复合微粒已被用于免疫学检测、酶的固定化、蛋白分离等领域。以课题组自主研制的金磁微粒为载体，本文建立了全血基因组DNA纯化方法，并对相关问题进行系统探讨。 以人全血、猪血、大鼠血液等为样本，通过对纯化过程中裂解条件、结合体系、金磁微粒用量及非特异性吸附杂质的清洗、DNA洗脱等环节的优化，，建立了从哺乳动物全血中纯化基因组DNA的方法。通过紫外吸收检测、电泳分析、PCR扩增等手段对方法的可靠性(包括得率、纯度、批内差、批间差等)进行了评价，证实纯化得到的DNA可满足PCR扩增实验的要求。此外，以鸡血为样本，对纯化体系进行适当的调整，建立了禽类动物全血基因组DNA纯化方法。结果表明：从100μL人全血中可纯化得到基因组DNA为2～5μg，从5μL鸡全血中可得到基因组DNA约20μg，其A260/280值均在1.70～1.90之间，纯化所得DNA分子结构完整；同一批次金磁微粒纯化得到DNA得率批内差小于7％，三个不同批次金磁微粒纯化得到DNA得率的批间差小于20％。整个纯化过程可在50 min内完成，操作简单、不涉及酚，氯仿等有毒试剂，可与国外同类纯化方法相媲美。 在金磁微粒为载体的DNA纯化体系建立过程中，发现存在一定的背景值，即以超纯水替代血样完成的操作过程，其洗脱液在260 nm处亦有较小特征吸收，对比发现国外同类产品也存在不同程度的背景值。据此，对产生背景的主要原因作了分析，结果表明，金磁微粒组成中的表面铁的组分和洗脱液中的EDTA形成金属螯合物的反应可能是导致背景值的主要原因，升高温度可以加速该反应。对比Fe3O4磁粒和金磁微粒，结果表明单纯Fe3O4磁粒的空白背景(在260 nm处吸收峰)是金磁微粒的10倍以上，表明Au对Fe3O4的修饰可以很大程度上降低EDTA对Fe3O4的螯合作用，减少背景的影响。以Tris—HCl作为洗脱液或TE缓冲液的常温洗脱可有效去除该背景值。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1磁性复合微粒介绍

1.1磁性微粒的特性

1.2磁性纳米粒子的合成方法

1.3磁性复合微粒的结构及合成

1.4磁性微粒在生物医学领域中的应用

2 DNA的分离纯化

2.1 DNA分离纯化的步骤

2.2磁性微粒法分离纯化DNA的原理及优势

2.3纯化体系的评定方法

3论文的出发点和主要工作

第二章 金磁微粒为载体的全血基因组DNA纯化体系的建立

1材料与仪器

1.1材料与试剂

1.2主要溶液配制

1.3主要仪器

2实验

2.1磁粒的选用

2.2裂解体系的优化

2.3血样体积的选择

2.4结合体系的优化

2.5清洗方案的选择

2.6洗脱体积的选择

2.7调整方案从鸡血中纯化基因组DNA

3结果与讨论

3.1磁性微粒及用量的确定

3.2裂解体系的优化结果

3.3血样体积的确定

3.4结合体系的确定

3.5清洗方案的确定

3.6洗脱体积的确定

3.7从鸡血中纯化基因组DNA方案的确定

4本章小结

第三章金磁微粒纯化全血基因组DNA的方法评价

1材料与仪器

1.1材料及试剂

1.2主要溶液

1.3主要仪器

2实验

2.1纯化体系的建立

2.2纯化体系的稳定性测试

2.3与其它商品试剂盒对比

2.4纯化体系的PCR验证

3结果与讨论

3.1纯化体系稳定性测试结果

3.2与其它商品试剂盒对比结果

3.3 PCR验证结果

4本章小结

第四章关于金磁微粒260 nm处背景问题的研究

1材料与仪器

1.1材料

1.2主要试剂

1.3主要仪器

2实验

2.1初步认识背景问题

2.2 GoldMag 金磁微粒背景的原因分析

3结果与讨论

3.1背景问题的初步分析

3.2背景原因分析

3.3可能的解决方案

4本章小结

全文小结

参考文献

致谢