一种鉴定蛋白质中半胱氨酸数量的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定蛋白质中半胱氨酸数量的方法，特别是公开了一种鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基中半胱氨酸数量的方法。通过该方法可以快速、准确的鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基和等位基因的组成，并且能够确定每个高分子量谷蛋白亚基中含有的半胱氨酸残基的数目。本发明方法可应用于小麦品质改良和高分子量谷蛋白亚基中半胱氨酸残基数量的快速检测，从而发掘和筛选优质亚基，提高品质改良的效率。此外，本发明方法还可以对羽扇豆中盐溶蛋白和水溶蛋白中所含有的半胱氨酸残基数目进行鉴定，进而形成半胱氨酸残基数目鉴定的一套完整的技术体系。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定蛋白质中半胱氨酸数量的方法及其应用，特别是涉及一种 快速鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基中半胱氨酸数量的方法及其在小麦品质改良中的 应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的三大粮食作物之一，其产量仅次于玉米排名第二，我国的 小麦种植面积、总产量和消费量居世界首位。小麦种子营养丰富，富含淀粉、蛋白质、 脂肪、矿物质、钙、铁、硫胺素、核黄素、烟酸及维生素A等，非常符合人体生理需 要，对人体健康十分有益。世界上约有35％的人口以小麦为主食，小麦蛋白是人类重 要的植物蛋白质来源，约占谷物蛋白质的38.4％；而且小麦面粉可以制作面包、馒头、 饼干、蛋糕、面条、油条、油饼、火烧、烧饼、煎饼、水饺、煎饺、包子、馄饨、蛋 卷、方便面、年糕、意式面食等食物；发酵后可制成啤酒、酒精、伏特加等。小麦这 种特殊的和面加工特性主要是由小麦种子贮藏蛋白的结构和特性决定的(Wrigley， Giant proteins with flour power.Nature，1996，381：738-739)。小麦贮藏蛋白是指醇溶蛋 白(gliadins)和麦谷蛋白(glutenins)，这两类蛋白的含量较大，约占种子蛋白的85％， 其中，麦谷蛋白主要决定面团的弹性，而醇溶蛋白则决定面团的延展性(Payne，Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread making quality.Ann. Rev.Plant Physiol.，198738：141-153)。

自然界中，大多数蛋白质都含有半胱氨酸残基，半胱氨酸残基之间可以形成二硫 键，而二硫键对蛋白质的三级和四级结构的稳定性是非常重要的(Thornton，Disulphide bridges in globular proteins.J.Mol.Biol.，1981，151：261-287；Wetzel，Harnessing disulfide-bonds using protein engineering.Trends Biochem.Sci.，1987，12：478-482)。二硫 键可以使蛋白质免受损坏并且可以增加蛋白质的半衰期，因此二硫键可以维持蛋白的 稳定性(Hogg，Disulfide bonds as switches for protein function.Trends Biochem.Sci.，2003， 28：210-214)。由于二硫键对谷蛋白的结构和功能有着非常重要的作用，作物科学研究 工作者对二硫键非常关注。小麦高低分子量谷蛋白亚基就是通过二硫键而形成谷蛋白 聚合体的(Masci S，D’Ovidio R，Lafiandra D，Kasarda DD，Characterization of a low-molecular-weight glutenin subunit gene from bread wheat and the corresponding protein that represents a major subunit of the glutenin polymer.Plant Physiol.，1998，118： 1147-1158)，而聚合体的大小对面粉品质的影响是巨大的(Masci S，Rovelli L，Kasarda DD，Vensel WH，Lafiandra D，Characterisation and chromosomal localization of C-type low-molecular-weight glutenin subunits in the bread wheat cultivar Chinese Spring.Theor. Appl.Genet.，2002，104：422-428)。公认的优质亚基1Dx5就是由于多了一个额外的半胱 氨酸残基导致聚合体变大从而大大提高了面粉的品质。因此，半胱氨酸残基数目对小 麦的品质有着非常重要的影响。检测半胱氨酸残基数目对发现优质亚基及小麦的品质 改良都具有十分重要的作用，但目前国内外还缺乏快速、高效鉴定小麦高分子量谷蛋 白亚基半胱氨酸数量的方法。

发明内容

近年来，随着生物质谱技术的发展，不同质谱技术已成为鉴定小麦谷蛋白亚基 的一种强大工具(Zhang Y，Li X，Yan Y，Xiong X，An X，Zhang Q，Pei Y，Gao L，Hsam SLK，Zeller FJ，Molecular characterization of two novel x-type HMW glutenin genes from Aegilops tauschii and implications for the evolution of Glu-D1-1 alleles.Genetics， 2008，178：23-33；Qian Zhang，Yanmin Dong，Xueli An，Aili Wang，Yanzhen Zhang， Xiaohui Li，Xianchun Xia，Zhonghu He，Yueming Yan：Characterization of HMW glutenin subunits in common wheat and related species by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS).Journal of Cereal Science，2008，47：252-261；Li Liu，Aili Wang，Rudi Appels，Junhong Ma， Xianchun Xia，Ping Lan，Zhonghu He，Frank Bekes，Yueming Yan，Wujun Ma，A MALDI-TOF based analysis of high molecular weight glutenin subunits for wheat breeding.Journal ofCereal Science，2009，50：295-301)。和以往的传统方法相比，质谱 更精确、更灵敏快速。

本发明的目的在于建立一种稳定、快速的质谱方法，从而可以对待测蛋白中的 半胱氨酸残基的数目，特别是对小麦高分子量谷蛋白亚基中的半胱氨酸残基的数目 进行鉴定的方法。通过该方法，可以快速、准确的鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基和 等位基因的组成，并且能够确定每个高分子量谷蛋白亚基中含有的半胱氨酸残基的 数目。

上述待测蛋白来自小麦或羽扇豆。

本发明方法的原理：4-乙稀吡啶可以结合半胱氨酸从而阻止半胱氨酸形成二硫 键，因此，一个4-乙稀吡啶可以和一个半胱氨酸结合。在提取谷蛋白亚基时，一组 样品加入4-乙稀吡啶，另一组样品不加4-乙稀吡啶，然后进行质谱鉴定。谷蛋白亚 基增加的分子量和该亚基所含有的半胱氨酸数目相关，即高分子量谷蛋白亚基每含 有一个半胱氨酸残基，其分子量会相应的增加大约105.14Da(即一个4-乙稀吡啶 的分子量)。

因此，首先要通过质谱获得同一种蛋白在两种处理(用4-乙稀吡啶处理和未用 4-乙稀吡啶处理)下的分子量分别是多少，然后用4-乙稀吡啶处理过的分子量减去 未用4-乙稀吡啶处理的分子量，最后再除以105，得到的结果就是该待测蛋白中所含 有的半胱氨酸残基的数目。

所述待测蛋白来自小麦时，本发明方法包括样品制备、质谱鉴定及数据处理分 析与半胱氨酸数目确定，具体包括以下步骤：

(1)样品制备

取小麦Bumper的面粉15mg两份，分别放入1.5ml离心管中；加入体积百分含 量为70％的乙醇1ml，涡旋30min，12000rpm离心10min，去上清。再分别加入体 积百分含量为55％的异丙醇1ml，65℃水浴30min，12000g离心10min，去上清。然 后用滤纸吸干残余上清，上述步骤重复3次。再加入0.1ml含DTT的溶液A(DTT 和溶液A质量百分比为1∶100)，其中溶液A的组成为，异丙醇∶1M Tris-HCl(pH8)∶ 双蒸水＝50∶8∶42(体积比)；涡旋混匀，65℃水浴30min。

然后，12000g离心10min，第一份样品取上清，用40％体积百分含量的丙酮室 温沉淀过夜；第二份样品加入0.1ml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液 A的体积百分比为1.4∶98.6)，涡旋混匀，65℃水浴30min；12000rpm离心10min； 取上清用40％体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都12000rpm 离心10min，弃上清，加入0.1ml含DTT的溶液A(DTT和溶液A质量百分比为1∶ 100)，65℃水浴30min；第一份样品取上清用40％体积百分含量的丙酮室温沉淀过 夜；第二份样品再加入0.1ml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液A的 体积百分比为1.4∶98.6)，涡旋混匀，65℃水浴30min；12000rpm离心10min；取上 清用40％体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都12000rpm离心 10min，弃上清，干燥沉淀10min，加入70μl色谱级乙腈溶液(其中含有终浓度为 0.1％的TFA)，溶解4小时以上，将得到的上清液采用混合上样法进行质谱分析。

(2)质谱鉴定

采用AppliedBiosystems公司生产的质谱仪器4800，质谱参数为激光强度2,500， 质量范围65-95kDa，加速电压25kV，板极电压92％，尺度0.3％，延迟时间1,000 ns。对获得的蛋白质质量谱利用软件进行数据处理分析。

半胱氨酸残基数目的计算：利用样品制备中4-乙稀吡啶处理和未处理的蛋白质 分子量的变化，计算高分子量谷蛋白亚基中半胱氨酸残基的数目。

本发明方法的应用价值：

(1)不仅可以得到蛋白中含有的半胱氨酸残基数目，而且可以得到该蛋白的分 子量，从而用来鉴定等位基因组成和小麦品种以及实现杂交早期世代优质亚基的快 速筛选与选择，大大提高小麦品质改良的效率。

(2)可以对普通小麦及其近缘种的高分子量谷蛋白亚基进行半胱氨酸残基数目 的检测，从而对进一步研究二硫键的功能提供帮助。

(3)可以用来大规模的检测小麦及其近缘种中谷蛋白亚基中半胱氨酸残基的数 目，从而快速筛选新的谷蛋白候选优质亚基，本发明方法比基因鉴定更快速、更准 确。

本发明正是利用了质谱的精确性，从而发明了一种利用质谱技术鉴定小麦高分 子量谷蛋白亚基中半胱氨酸数量的方法，可应用于小麦品质改良和高分子量谷蛋白 亚基中半胱氨酸数量的快速检测，从而发掘和筛选优质亚基，提高品质改良的效率。 此外，本发明方法还可以对羽扇豆中盐溶蛋白和水溶蛋白中所含有的半胱氨酸残基 数目进行鉴定，进而形成半胱氨酸残基数目鉴定的一套完整的技术体系。

附图说明

图1为普通小麦品种Bumper中高分子量谷蛋白亚基用4-乙稀吡啶处理和未处理 的质谱比较图谱；

图2为普通小麦品种Shan229中高分子量谷蛋白亚基用4-乙稀吡啶处理和未处 理的质谱比较图谱；

图3为羽扇豆用4-乙稀吡啶处理和未处理的盐溶蛋白中的半胱氨酸残基数目鉴 定图谱；

图4为羽扇豆用4-乙稀吡啶处理和未处理的水溶蛋白中的半胱氨酸残基数目鉴 定图谱。

具体实施方式

本发明中涉及的实验材料如下：普通小麦品种Ajana，Banks，Bullaring，Bumper， Calingiri，Chara，EGA Blanco，Endure，IGW2944，IGW3240，Pugsley，M12，M25， M26，Shan 229，Wanmai 33，Halberd、羽扇豆(王轲，普通小麦及其近缘种谷蛋白编 码基因的分子克隆与系统进化研究，首都师范大学博士学位论文，2011)，上述生物材 料由首都师范大学遗传与生物工程实验室繁育和保存。

实施例1、小麦高分子量谷蛋白亚基中半胱氨酸残基数量的鉴定

1、小麦高分子量谷蛋白亚基的提取与样品制备

取小麦Bumper的面粉15mg两份，分别放入1.5ml离心管中；加入体积百分含 量为70％的乙醇1ml，涡旋30min，12000rpm离心10min，去上清。再分别加入体 积百分含量为55％的异丙醇1ml，65℃水浴30min，12000g离心10min，去上清。然 后用滤纸吸干残余上清，上述步骤重复3次。再加入0.1ml含DTT的溶液A(DTT 和溶液A的质量百分比为1∶100)，其中溶液A的组成为，异丙醇∶1M Tris-HCl(pH8)∶ 双蒸水＝50∶8∶42(体积比)；涡旋混匀，65℃水浴30min。

然后，12000g离心10min，第一份样品取上清，用40％体积百分含量的丙酮室 温沉淀过夜；第二份样品加入0.1ml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液 A的体积百分比为1.4∶98.6)，涡旋混匀，65℃水浴30min；12000rpm离心10min； 取上清用40％体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都12000rpm 离心10min，弃上清，加入0.1ml含DTT的溶液A(DTT和溶液A质量百分比为1∶ 100)，65℃水浴30min；第一份样品取上清用40％体积百分含量的丙酮室温沉淀过 夜；第二份样品再加入0.1ml含4-乙烯基吡啶的溶液A(4-乙烯基吡啶和溶液A的 体积百分比为1.4∶98.6)，涡旋混匀，65℃水浴30min；12000rpm离心10min；取上 清用40％体积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都12000rpm离心 10min，弃上清，干燥沉淀10min，加入70μl色谱级乙腈溶液(其中含有终浓度为 0.1％的TFA)，溶解4小时以上，将得到的上清液采用混合上样法进行质谱分析。

质谱结果如图1所示。其中，图1A为普通小麦品种Bumper中高分子量谷蛋白 亚基用4-乙稀吡啶处理的质谱，图1B为普通小麦品种Bumper中高分子量谷蛋白亚 基未用4-乙稀吡啶处理的质谱。

2、谷蛋白亚基中半胱氨酸残基数量的鉴定

(1)仪器设备：采用AppliedBiosystems公司生产的质谱仪器4800。

(2)质谱参数：激光强度2,500，质量范围65-95kDa，加速电压25kV，板 极电压92％，尺度0.3％，延迟时间1,000ns。

(3)数据处理与半胱氨酸残基数量确定：利用软件进行数据处理分析。半胱氨 酸残基数目的计算：从图1中可以看出，小麦Bumper中1Dx5亚基加入4-乙稀吡啶 后分子量增加了517.67Da；而其它的用4-乙稀吡啶处理的x-型和y-型HMW-GS比 未用4-乙稀吡啶处理的分子量分别增加大约400Da和700Da，这些结果说明，1Dx5 亚基含有5个半胱氨酸残基，其它的x-型和y-型HMW-GS中的半胱氨酸残基的数 目分别为4和7个。这些结果与已知的结果一致，说明了该方法的可靠性。

实施例2、利用17个已知亚基组成的小麦品种对本发明方法进行验证

1、小麦高分子量谷蛋白亚基的提取与样品制备

取Ajana，Banks，Bullaring，Bumper，Calingiri，Chara，EGA Blanco，Endure， IGW2944，IGW3240，Pugsley，M12，M25，M26，Shan229，Wanmai33，Halberd 等17个不同品种的小麦种子，取样及样品制备和质谱鉴定等同实施例1。

小麦品种Shan229的质谱结果如图2所示。其中，图2A为普通小麦品种Shan229 中高分子量谷蛋白亚基用4-乙稀吡啶处理的质谱，图2B为普通小麦品种Shan229 中高分子量谷蛋白亚基未用4-乙稀吡啶处理的质谱。

17个不同小麦品种的质谱结果如表1和表2所示。

表117个已知高分子量谷蛋白亚基组成的小麦品种中Glu-A1和Glu-B1位点编码 的高分子量谷蛋白中半胱氨酸残基数目检测结果

表217个已知高分子量谷蛋白亚基组成的小麦品种中Glu-D1位点编码的高分子量 谷蛋白中半胱氨酸残基数目检测结果

2、数据分析

从表1中可以看出，不管是含有2个和5个半胱氨酸残基的特殊的1Bx20亚基 和1Dx5亚基，还是含有4个半胱氨酸残基的其他所有的常规高分子量谷蛋白亚基， 用4-乙稀吡啶处理过的高分子量谷蛋白亚基增加的分子量都与其自身所含有的半胱 氨酸残基数目相对应，即高分子量谷蛋白亚基每含有一个半胱氨酸残基其分子量就 会相应的增加大约105.14Da。

实施例3、利用羽扇豆中盐溶蛋白和水溶蛋白中的半胱氨酸残基数目对本发明方 法进行验证

1、样品的提取与制备

盐溶蛋白：取两份15mg羽扇豆的粉末，其中一份样品加入0.2ml 0.5M的NaCl 溶液，涡旋振荡30分钟，然后向另一份样品中加入0.2ml含4-乙烯基吡啶的0.5M 的NaCL溶液(4-乙烯基吡啶和0.5M的NaCl溶液的体积百分比为1.4∶98.6)，涡旋 混匀，65℃水浴30min，12000rpm离心10min；取上清用80％体积百分含量的丙酮 室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都12000rpm离心10min，弃上清，干燥沉淀 10min，加入70μl色谱级乙腈溶液(其中含有终浓度为0.1％的TFA)，溶解4小时以 上，将得到的上清液采用混合上样法进行质谱分析。

水溶蛋白：取两份15mg羽扇豆的粉末，其中一份样品加入0.2ml蒸馏水，涡 旋振荡30分钟，然后向另一份样品中加入0.2ml体积百分比浓度为1.4％的4-乙烯基 吡啶水溶液，涡旋混匀，65℃水浴30min，12000rpm离心10min；取上清用80％体 积百分含量的丙酮室温沉淀过夜；过夜沉淀后两份样品都12000rpm离心10min，弃 上清，干燥沉淀10min，加入70μl色谱级乙腈溶液(其中含有终浓度为0.1％的TFA)， 溶解4小时以上，将得到的上清液采用混合上样法进行质谱分析。

2、图谱分析

根据用4-乙稀吡啶处理和未处理的蛋白质分子量的差值计算出每个亚基所含有 的半胱氨酸残基数目。结果如图3和图4所示。其中，图3A为羽扇豆用4-乙稀吡啶 处理的盐溶蛋白的质谱，图3B为羽扇豆未用4-乙稀吡啶处理的盐溶蛋白的质谱。图 4A为羽扇豆用4-乙稀吡啶处理水溶蛋白的质谱，图4B为羽扇豆未用4-乙稀吡啶处 理的水溶蛋白质谱。

图3A和3B之间只有用方框标注出来的亚基的分子量之差约为100Da，而其它 亚基分子量的变化很小在误差范围内，故而只有第一个亚基含有1个半胱氨酸残基， 其它两个亚基不含有半胱氨酸残基。

图4A和4B之间对应所有亚基的分子量之差均约为100Da，故而，所有亚基都 含有1个半胱氨酸残基。