一种快速测定发酵液中透明质酸含量的方法

摘要

本发明涉及发酵液中透明质酸含量测定技术领域使用近红外光谱快速测定发酵液中透明质酸含量的方法：择取发酵条件一致的透明质酸发酵液；隔一定时间测定透明质酸的实际含量，在温度一致条件下，用近红外光谱分析仪测各不同批次发酵液的原始近红外光谱；采用一阶导数+Norris5点平滑的方法对原始近红外光谱进行预处理，在7312.7cm-1-10000cm-1波段范围内，将发酵液中透明质酸的实际含量与预处理后的近红外图谱采用偏最小二乘法进行关联建立数学模型；取待测透明质酸含量的发酵液，测其近红外光谱谱图，根据数学模型预测透明质酸含量。绿色无污染，简便易行，能快速可靠的测定发酵液中透明质酸的含量；误差小。

说明书

技术领域    

本发明涉及发酵液中透明质酸含量测定技术领域，特别涉及一种使用近红外光谱快速测定发酵液中透明质酸含量的方法。

背景技术   

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，具有独特的黏弹性和生理功能，是细胞外基质的主要成分，被广泛应用于医药、美容和保健食品等行业。

含量是透明质酸发酵过程中的一个重要参数，对发酵菌种选育、工艺优化和发酵过程控制具有重要指导意义。目前透明质酸的含量测定方法主要是通过降解后显色，根据光吸收测定其中葡糖醛酸或者氨基葡糖的含量，从而推算透明质酸的含量。这些方法操作比较复杂，耗时耗力，条件苛刻，发酵基质对测定结果干扰严重，并且数据的提供往往滞后于生产过程，不能满足快速分析的需要。

发明内容   

为了解决上述现有技术中测定发酵液中透明质酸含量的方法耗费试剂、操作复杂、发酵基质对测定结果干扰严重等问题，本发明提供了一种能够快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，本发明的方法绿色无污染，简便易行，能快速可靠的测定发酵液中透明质酸的含量。

本发明是通过以下方式实现的：

一种使用近红外光谱快速测定发酵液中透明质酸含量的方法，包括以下步骤：

（1）择取发酵条件一致的不同批次透明质酸发酵液；

（2）每隔一定时间，各取上述不同批次的发酵液，测定其中透明质酸的实际含量，并在温度一致的条件下，采用近红外光谱分析仪测得各不同批次发酵液的原始近红外光谱；

（3）采用一阶导数结合Norris 5点平滑的预处理方法对原始近红外光谱进行预处理，在7312.7 cm^-1-10000cm^-1波段范围内，将发酵液中透明质酸的实际含量与预处理后的近红外图谱采用偏最小二乘法进行关联建立数学模型，形成快速定量发酵液中透明质酸含量的近红外光谱分析数学模型；

（4）取与步骤（1）中发酵条件一致的待测透明质酸含量的发酵液，在与步骤（2）温度一致的条件下，测其近红外光谱谱图，根据步骤（3）的近红外光谱分析数学模型，预测透明质酸含量。

步骤（1）中发酵液中含有蛋白胨2wt%，酵母粉1.5wt%，葡萄糖6wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，硫酸镁0.1wt%，谷氨酸钠0.1wt%，在5吨的发酵罐内，37℃中性条件下进行发酵。

步骤（2）中每隔一定时间优选为两个小时。

步骤（2）中在温度一致的条件下为在4℃条件下。

为了消除与待测样品性质无关的因素对近红外光谱的影响，在全光谱区域考察不同的光谱预处理方法对模型性能的影响，并采用内部交叉验证法对模型主成份数进行选取。采用剩余批次发酵液考察模型的预测能力，以校正集相关系数（R_c），交叉验证均方根误差（RMSECV），验证集相关系数（R_p），预测均方根误差（RMSEP）为评价指标，最终选择一阶导数结合Norris 5点平滑的预处理方法，作为建模的最优预处理方法。

本发明的有益效果：

1、绿色无污染，简便易行，能快速可靠的测定发酵液中透明质酸的含量；

2、误差在允许的范围之内；

3、本发明方法简便易行，适于对发酵液中透明质酸含量进行快速无损无污染的定量分析，为透明质酸的发酵菌种选育、工艺优化和发酵过程控制提供快速的技术数据支持；

4、经过一阶导数Norris5点平滑之后的光谱，消除了基线漂移，强化了谱带特征，克服了谱带重叠，有利于复杂基质中有效信息的提取。

附图说明   

图1为本发明采集的透明质酸发酵液近红外光谱谱图；

图2为本发明获得的光谱在7312.7 cm^-1-10000cm^-1范围内经过一阶导数和Norris 5 点平滑后得到的发酵液近红外光谱谱图；

图3为发酵液中透明质酸含量模型的RMSECV与主成分数关系图；

图4为校正集样品真实值和预测值相关系数图。

具体实施方式

实施例1

（1）首先取发酵条件一致的7个批次的透明质酸发酵液，发酵液中含有蛋白胨2wt%，酵母粉1.5wt%，葡萄糖6wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，硫酸镁0.1wt%，谷氨酸钠0.1wt%，在5吨的发酵罐内，37℃中性条件下进行发酵，发酵周期约24小时；

（2）根据透明质酸发酵周期，从第10个小时开始每隔2小时收集一次发酵液，在4℃的条件下，采用Thermo Fisher公司的AntarisⅡ近红外光谱仪测得上述发酵液的原始近红外光谱，如图1所示，并采用咔唑比色法测定其中透明质酸的实际含量，详见表1，

表1 发酵液中透明质酸含量

 （3）为了消除与待测样品性质无关的因素对近红外光谱的影响，在全光谱区域考察SG 7点平滑，SG 9点平滑，SG 11点平滑，一阶导数Norris5点平滑、二阶导数Norris5点平滑的光谱预处理方法对模型性能的影响，并采用内部交叉验证法对模型主成份数进行选取。根据理想样品集划分原则，从中选择批次101205、101206、101207、101208、101210的发酵液为校正集样品，使用AntarisⅡ近红外光谱仪自带的TQ Analyst化学计量学软件，将其透明质酸实际含量与其近红外图谱采用偏最小二乘算法进行关联，建立定量数学模型，以校正集相关系数（R_c），交叉验证均方根误差（RMSECV），验证集相关系数（R_p），预测均方根误差（RMSEP）为评价指标。考察结果如表2所示，最终选择一阶导数结合Norris 5点平滑的预处理方法，作为建模的最优预处理方法，如图2所示，经过一阶导数Norris5点平滑之后的光谱，消除了基线漂移，强化了谱带特征，克服了谱带重叠，有利于复杂基质中有效信息的提取。

表2 不同预处理方法的比较

预处理方法RcRMSECVRpRMSEPPCs无处理0.99370.2290.94030.5248SG9点平滑0.99370.2300.94060.5238SG7点平滑0.99370.2300.94070.5238SG11点平滑0.99370.2300.94000.5238一阶导数+Norris5点平滑0.99510.2230.98320.3765二阶导数+norris5点平滑0.99600.2020.98170.4064

采用相关系数法对选取的波段范围为7312.7 cm^-1-10000cm^-1（即限制光谱吸收强度不超过2.5个单位时的光谱范围）进行优化。相关系数r绝对值分别大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9情况下模型的准确度、精密度如表3所示。

表3不同阈值下得到的模型参数

|r|R_cRMSECVR_pRMSEPPCs|r|＞0.50.99510.2230.98320.3765|r|＞0.60.99510.2230.97970.4075|r|＞0.70.99510.2230.97930.4095|r|＞0.80.99490.2270.97940.4105|r|＞0.90.99350.2560.98020.4352全光谱0.99510.2230.98320.3765

可以看出相关系数法对光谱区间选择结果并不明显，发酵液中透明质酸含量的近红外模型仍然适合在7312.7 cm^-1-10000cm^-1范围内全谱段建模。因此最终选择“一阶导数+Norris5点平滑”对光谱进行预处理之后，采用偏最小二乘法在7312.7 cm^-1-10000cm^-1范围内建立发酵液中透明质酸近红外定量分析模型，该模型的R_c=0.9951，RMSECV=0.223。其中建模过程中最佳主成分数选取采用留一法交互验证，结果见图3，最终选择5个主成分数建立模型。

为了提高工作效率，可以根据具体生产情况，针对经常使用到的发酵条件，统一进行模型的建立，形成模型集，备案，根据实际应用的发酵条件，从模型集中找到适用的模型，直接就可得到透明质酸含量的预测值。

验证实验

1、将剩余2个批次发酵液作为验证集，将其光谱与所建立模型进行关联，对模型的预测能力进行验证，验证集样品验证结果见表4。

表4 验证集样品预测结果

从表4中可以得出真实值与近红外预测值的相关系数为R_p=0.9832，预测均方根误差RMSEP=0.376，模型误差在工厂可接受范围内，且在建立好模型后，分析时间缩短为1分钟。

2、重新构建样品集，仍选择5个批次样品为校正集样品、2个批次为验证集样品，其中模型一选择101204、101205、101207、101209、101210为校正集样品，选择101206、101208为验证集样品；模型二选择101204、101205、101207、101208、101210为校正集样品，选择101206、101209为验证集样品，采用一阶导数Norris5点平滑为光谱预处理方式，在7312.7 cm^-1-10000cm^-1范围全光谱建立模型一和模型二，以校正集相关系数（R_c），交叉验证均方根误差（RMSECV），验证集相关系数（R_p），预测均方根误差（RMSEP）为评价指标，考察结果见表5。

表5 模型一致性考察结果

模型R_cRMSECVR_pRMSEPPCs模型一0.99100.2990.99790.2455模型二0.99470.2270.98780.3795

可以看出不同的样本集划分仍能达到一个较优的结果，子模型的一致性能够满足企业生产要求。

图4为本发明所建立的模型中校正集样品真实值和预测值相关系数图。

上面所述的实施案例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。