山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法

摘要

本发明提供了一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。所述方法包括：提取样品DNA；针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针；通过实时荧光PCR，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增；根据扩增曲线和Ct值鉴别待测样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。本发明建立的山羊绒、绵羊毛实时荧光PCR鉴别法特异性好、灵敏度高，能够满足轻纺日常检测的要求。

说明书

技术领域

    本发明提供了一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。

背景技术

山羊绒即通常所说的羊绒，是一种珍稀而昂贵的动物纤维。其纤维细度均匀，手感滑糯柔软而细腻，拉力强而富有弹性，素有“软黄金”之称。其羊绒制品具有极高的品质和舒适的服用性能，受到人们的喜爱，价格也很高。生产者为了降低成本，将与山羊绒外观相似的细支绵羊毛或经处理改性的绵羊毛混入织物中，使市场上出现假冒或含量降低的山羊绒纺织品，大大损伤了消费者的利益。因而有效鉴别山羊绒与绵羊毛就显得非常重要。

山羊绒与绵羊毛同属蛋白质纤维，化学性质的差异不大，而仅在鳞片结构及纤维细度上有些差异，目前鉴别方法主要有光学投影显微镜法、溶液法、染色法和扫描电子显微镜法等，但存在误差较大、误判率较高，试样准备繁琐、操作复杂，带有检测者的主观判断，结果欠客观等缺点。山羊绒和绵羊毛的准确、客观鉴别是当前检验工作中迫切需要解决的重要技术难题之一。

近年来，分子生物学检测技术飞速发展，在生物学各个领域已得到广泛应用。由于不同毛类纤维的遗传物质DNA存在差异，因此可利用基于DNA基础上的分子生物学方法（如实时荧光PCR法）来鉴别区分山羊绒和绵羊毛，以达到灵敏、准确、客观的目的。据检索，国外已有采用PCR-RFLP方法来鉴别不同动物毛纤维的报道，但未见有应用其他基于DNA基础上的分子生物学方法（如实时荧光PCR法）的报道。我国虽然是进口羊毛和出口羊绒大国，但是在山羊绒和绵羊毛分子生物学鉴别方法的研究上还是空白。我们首次建立了山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够灵敏、准确地鉴别山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR方法。

本发明采取的技术方案如下：

本发明的一种山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法，所述方法包括：提取样品DNA；针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针；通过实时荧光PCR，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增；根据扩增曲线和Ct值鉴别待测样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。

用于鉴别山羊绒的引物、探针为：12SG-F：5’-CGC CCT CCA AAT CAA TAA-3’、12SG-R：5’-CTA TAG TGT ATC AGC TGC A-3’、12SG-P：5’-FAM-AAA CGT GTT AAA GCA CTA CAT C-TAMARA-3’；用于鉴别绵羊毛的引物、探针为：12SS-F：5’-ATA TCA ACC ACA CGA GAG GAG AC-3’、12SS-R：5’-TAA ACT GGA GAG TGG GAG A-3’、12SS-P：5’-FAM-ACT AAT CCT CAT CCT CAT GC-TAMARA-3’。

所述PCR反应体系为：2×Premix Ex Taq^TM 12.5μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ0.5 μL，10 μmol/L引物、探针各0.75μL，DNA模板5 μL，ddH₂O 4.75μL；鉴别山羊绒的PCR反应条件为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，54 ℃，35 s，40个循环；鉴别绵羊毛的PCR反应条件为：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，52 ℃，35 s，40个循环。

本发明建立的山羊绒、绵羊毛实时荧光PCR鉴别法特异性好、灵敏度高，能够满足轻纺日常检测的要求。

附图说明

图1为优化前的山羊、绵羊成分的实时荧光PCR结果；其中A. 绵羊成分；B. 山羊成分。

图2为实时荧光PCR反应体系的优化结果，其中A. 绵羊成分；B. 山羊成分。

图3为绵羊成分的灵敏度测定结果，其中A. DNA系列稀释内参基因；B. DNA系列稀释绵羊成分；C. 含量内参基因；D. 含量绵羊成分。

图4为山羊成分的灵敏度测定结果，其中A.DNA系列稀释内参基因；B. DNA系列稀释山羊成分；C. 含量内参基因；D. 含量山羊成分。

图5为供试材料中山羊绒、绵羊毛的实时荧光PCR鉴别结果；其中A. 内参基因；B. 绵羊成分；C. 山羊成分。

具体实施方式

1  试验材料

兔毛，自行收集。浅绿色毛衣料、深墨绿色毛衣料、灰色毛衣料、肉色毛衣料（标牌显示：70％绵羊毛和30％山羊绒）、墨绿色毛衣料（标牌显示：70％绵羊毛和30％山羊绒）、灰色格子西装布料、灰色男西服布料、蓝色毛衣料（标牌显示：纯山羊绒）、黑白灰三色毛衣料（标牌显示：73.9%绵羊毛、11.6%山羊绒和14.5%驼绒）均由本单位轻纺实验室收集。紫色羊绒衫料、驼毛由参加“第八届CU系列纤维细度仪应用研讨会暨目光统一交流会”代表馈赠。紫羊绒、貉子毛由国家纺织科学研究院国家纺织制品质量监督检验中心张艳研究员馈赠。其中墨绿色毛衣料、蓝色毛衣料、紫色羊绒衫料经张艳老师用纤维细度仪鉴定，墨绿色毛衣料和蓝色毛衣料同时含有绵羊毛和山羊绒，而紫色羊绒衫料的山羊绒含量很高（超过96%），仅含少量绵羊毛。山羊绒取自内蒙农家同一头山羊，绵羊毛取自山东农家同一头绵羊，洗净、晾干、去杂质。

2  主要试剂

组织和毛发DNA提取试剂盒[与DNA IQ^TM系统结合使用]为Promega公司产品。Premix Ex Taq^TM（Perfect Real Time）（2×）为宝生物工程（大连）有限公司产品。

3.  主要仪器与设备

电子天平、涡旋仪、瞬时离心机、超净工作台、微孔干浴器、1.5mL磁力架、实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司的7500）。

4.  引物、探针

1，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，用TE溶液（pH8.0）稀释至10μmol/L，-20℃保存备用。

 

表1  实时荧光PCR所用的引物、探针

5  DNA的提取

将样品剪碎，经分析研磨机打散、混匀，再用剪刀剪断至纤维长度为2-3mm；称取5mg于1.5mL离心管中，加100μL DTT和75μL蛋白酶K，56℃温浴过夜；加350μL裂解液，颠倒几次混匀；瞬离，吸取上清液于新的1.5mL离心管中，加7μL 完全悬浮的DNA IQ^TM树脂，高速涡旋振荡3s，室温温浴10min；高速涡旋振荡2s，将管子放在磁分离架上；小心去除所有溶液，加入100μL裂解液，高速涡旋振荡2s，将管子放在磁分离架上；去除所有的裂解液，加入100μL 1×洗涤液，高速涡旋振荡2s，将管子放在磁分离架上，重复洗涤3次，尽可能去除洗涤液；打开盖子，空气中干燥5min；加入70μL洗脱液，高速涡旋振荡2s，65℃温浴5min；取出管子，高速涡旋振荡2s，放在磁分离架上，小心吸取DNA溶液。

6  实时荧光PCR鉴别法

6.1  山羊、绵羊成分实时荧光PCR扩增的特异性试验

以ddH₂O，兔毛、山羊绒、绵羊毛DNA为模板，进行山羊、绵羊成分实时荧光PCR扩增的特异性试验。PCR反应体系为：Premix Ex Taq^TM（Perfect Real Time）（2×）12.5μL，10μmol/L引物、探针各0.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μL，DNA模板5 μL，ddH₂O 5.5μL。PCR反应条件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，退火温度，35 s，40个循环。结果如图1所示，山羊、绵羊成分均显示出很好的特异性，仅绵羊毛显示出绵羊成分的扩增曲线，山羊绒显示出山羊成分的扩增曲线。         

6.2   山羊、绵羊成分的反应体系的优化

反应体系中除Premix Ex Taq^TM（Perfect Real Time）（2×）12.5μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μL，DNA模板5 μL外，其他成分如表2所示。

优化结果如图2所示，绵羊成分、山羊成分都是体系5的扩增效果最好，荧光信号最强，Ct值较小。因此选用体系5为扩增山羊、绵羊成分的实时荧光PCR反应体系。

表2  优化反应体系中其他成分的用量

6.3   灵敏度测定

将山羊绒、绵羊毛DNA分别进行10倍系列稀释，范围为1~10⁵倍，分别取5μL进行内参基因、山羊成分、绵羊成分的扩增。另外将山羊绒和绵羊毛按重量比配制，获得山羊绒含量分别为0.1%、1%、10%，绵羊毛含量分别为0.1%、1%、10%共6个样品，用试剂盒提取DNA，各取5μL进行内参基因、山羊成分、绵羊成分的扩增。用优化好的反应体系[Premix Ex Taq^TM（Perfect Real Time）（2×）12.5 μL，10 μmol/L引物、探针各0.75 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μL，DNA模板5 μL，ddH₂O 4.75 μL]进行灵敏度的测定，结果如图3~4、表3所示。

对于内参基因，均可检测到经10⁵倍稀释的山羊绒、绵羊毛DNA（图3A、图4A）。对于绵羊成分，可检测到经10⁴倍稀释的绵羊毛DNA（图3B）和含量为0.1%的绵羊毛（图3D）。而对于山羊成分，可检测到经10⁵倍稀释的山羊绒DNA（图4B）和含量为0.1%的山羊绒（图4D），且Ct值明显小于相同处理的绵羊成分（表3），这表明山羊成分的灵敏度要比绵羊成分高些。灵敏度测定结果表明，建立的山羊绒、绵羊毛实时荧光PCR鉴别法的灵敏度已足够满足轻纺专业的检测要求。

表3  灵敏度测定试验的Ct值

注：“－”表示Ct值＞40，即阴性结果。

6.4   供试材料中山羊绒、绵羊毛的实时荧光PCR鉴别

内参基因的反应体系同6.3，PCR反应条件中退火延伸温度为60℃。检测结果如图5、表4所示。除ddH₂O外，所有样品的内参基因均显示出扩增曲线，且Ct值在18~26之间，表明均提取到DNA及DNA中不含抑制实时荧光PCR反应的因子。供试材料中，ddH₂O、兔毛、驼毛、貉子毛均未显示出山羊、绵羊成分的扩增曲线。浅绿色毛衣料、深墨绿色毛衣料、灰色毛衣料、灰色格子西装布料、灰色男西服布料仅绵羊成分为阳性，表明这些样品中含有绵羊毛。而肉色毛衣料、墨绿色毛衣料、蓝色毛衣料、黑白灰三色毛衣料、紫色羊绒衫料、紫羊绒的绵羊成分、山羊成分均为阳性，表明这些样品中同时含有绵羊毛和山羊绒。其中肉色毛衣料、墨绿色毛衣料、黑白灰三色毛衣料、紫色羊绒衫料的检测结果与标牌显示的成分相同。而标牌显示为纯山羊绒的蓝色毛衣料、含少量绵羊毛的紫色羊绒衫料均检测有绵羊毛，这与用纤维细度仪鉴定结果一致。紫羊绒中混杂了绵羊毛。

表4  供试材料中山羊绒、绵羊毛的实时荧光PCR鉴别的Ct值

注：“－”表示Ct值＞40，即阴性结果。

7  结论

建立的山羊绒、绵羊毛实时荧光PCR鉴别法特异性好、灵敏度高，满足轻纺日常检测的要求。实时荧光PCR法具有准确、灵敏、客观等优点，可作为一种全新的山羊绒、绵羊毛鉴别方法。

<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法

<160> 6

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12SG-F

<400> 1

cgccctccaa atcaataa 18

 

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12SG-R

<400> 2

ctatagtgta tcagctgca 19

 

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12SG-P

<400> 3

aaacgtgtta aagcactaca tc 22

 

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12SS-F

<400> 4

atatcaacca cacgagagga gac 23

 

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12SS-R

<400> 5

taaactggag agtgggaga 19

 

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 12SS-P

<400> 6

actaatcctc atcctcatgc 20