体液中IFI 16的检测

摘要

本发明涉及定性和/或定量测定细胞外形式的干扰素可诱导蛋白16(IFI 16)的方法。

说明书

本发明涉及对胞外形式的干扰素可诱导蛋白16(interferon  inducible protein 16，IFI16)进行定性和/或定量测定的方法。

干扰素可诱导蛋白IFI16属于在人类中被称为HIN200而在鼠类中 被称为lfi200的干扰素(IFN)可激活基因家族。已证实IFI16是参与 抑制细胞周期进程并涉及发炎过程的核磷酸蛋白质。

正常人组织中IFI16表达的免疫组化分析表明它以高度受限制的 模式在某些器官的选定组织内表达。IFI 16表达于CD34+骨髓前体 细胞中并且在单核细胞前体、外周血单核细胞中以及整个淋巴发育过 程中保持高表达。在皮肤、胃肠道、泌尿生殖道以及乳腺组织的腺体 和管道的上皮细胞中均发现有IFI16。此外，来自血液和淋巴管二者 的所有脉管内皮细胞均强烈表达IFI 16。

IFI 16表达可通过干扰素以及通过一串细胞因子和分化剂进行诱 导。在HL-60细胞中，IFI 16被二甲亚砜、视黄酸和1，25二羟基 维生素D3所诱导。IFI 16在HUVEC内皮细胞中被氧化压力和促炎分 子诸如TNF-α和白介素-1β(IL-1β)的刺激。

有数个系列的证据将干扰素(IFNs)和自身免疫病症尤其是SSc和 系统性红斑狼疮(SLE)联系在一起。许多观察资料暗示了IFI 16在系 统性自身免疫疾病中的作用，其中涉及慢性炎症。在来自SSc和SLE 患者的坏死皮肤中表皮所有层内IFI 16表达都大大增加并且普遍检测 到。而且，皮肤炎性渗透物显示出IFI 16阳性染色，指示了它以高水 平表达于淋巴细胞、成纤维细胞和EC中。

此外，在受系统性硬化症(SSc)，系统性红斑狼疮(SLE)和口眼 干燥综合症(Sjogren′s Syndrome)(SjS)侵袭的患者血清中发现了抗 IFI 16的自身抗体。

虽然如此，IFI 16作为分子标记物的可能用途看起来似乎局限于 实体组织样品，因为先前描述的结果显示蛋白质IFI 16是细胞内定 位。因此，先前的检测步骤是用来自患者的实体组织样品进行的。不 过，从病灶组织中采集实体组织样品对患者有不利的影响并且较困难。 此外，由于难以从健康受试者中获取实体组织，因而使得在病灶样品 和健康样品之间比较IFI 16的表达有困难，所以IFI 16作为分子标记 物的用途受到了限制。

至目前为止，评估病理状态下I FH16的可能失调的实验是以实体 组织或培养细胞以及来自组织、循环或培养细胞的提取物来进行的， 因为在现有技术中认为IFI 16是在细胞内活跃的蛋白质并且位于人类 细胞的核仁和核浆内(正如共聚焦显微镜检和核蛋白质的免疫印迹所 显示的)。

至于有关抗-IFI 16自身抗体产生的机制，文献中猜想IFI 16可 能从濒死的细胞中释放(Mondini M.et al.，2006)。细胞死亡的过 程被认为是数种自身抗原的可能来源，最被公认的释放机制是核抗原 在凋亡泡中重定位(由此限制在膜屏障内)并且/或者它们暴露于细胞 膜水平的免疫效应物上。此现象已对数种自身抗原，包括Ro/SSa、 La/SSB和氧化核抗原得到证实(即LeFeber et al.，1984； Casciola-Rosen L.et al.，1994；Saegusa et al.2002)。细胞外 IFI16蛋白与病理状态之间的关联还未公开发表。

然而，基于现有知识，不可能预计到在胞外环境中可能存在可检 测量的胞外形式IFI 16以及所述量的细胞外IFI16会与病理状态相 关。

不过，令人惊讶的是，本发明的发明者已发现可通过简单直接的 分析方法从适当的样品中测定细胞外IFI 16。

因此，第一方面，本发明涉及测定样品中细胞外干扰素可诱导蛋 白16(IFI 16)的体外方法。

具体而言，本发明的发明者发现细胞外IFI 16的存在和/或量增 加是病理状态的指示。因此，本发明适合作为诊断方法用于与正常即 健康对照相比IFI 16的存在增加所相关的任何病理状态。

术语“样品”用于此处指以体外评估为目的所获取的生物学样品。 在本发明的方法中，用于测试细胞外IFI 16的样品优选体液样品，例 如，血液、血浆、血清、尿、唾液等。或者，可测试组织样品的上清 液或细胞培养物样品的上清液。优选地，样品制备不涉及任何的细胞 裂解，尤其是没有已知表达IFI 16的细胞例如上皮细胞或内皮细胞的 裂解。样品可依照已知方法来自哺乳动物生物体例如人体，或者来自 哺乳动物例如人的细胞培养物。

在本发明的上下文中，术语“体液”包含各种各样的体液，任选 地为稀释或浓缩的体液。举例而言有血液、血清、血浆、羊水、脑/ 脊髓液、溶液、脑脊液、唾液、咽喉分泌物和其它粘膜分泌物、滑液、 腹水、泪液、淋巴液和尿。优选的，体液是血液、血浆或血清。

依照本发明，IFI 16的检测可包括检测全长的IFI 16或其片段， 尤其是具有IFI 16之免疫学活性的片段，例如，其是免疫学上可检测 的，并且可通过切割例如酶促切割产生，而且可以是病理状态例如发 炎的指示。

术语“测定”和/或“检测”包含定性或定量测定样品中的细胞外 IFI 16。在一个优选的实施方案中，所述测定是定性或半定量测定， 即测定IFI 16的有或无，或者测定IFI 16的浓度是高于或低于阈值。 正如技术熟练人员会认识到的，在是-(有)或否-(无)的检验中， 检验灵敏度常常设置为与阈值符合。阈值可例如从一组健康个体的测 试中确定。优选的，阈值设置为产生90％的特异性，还优选阈值设置 为产生95％的特异性，或者还优选阈值设置为产生98％的特异性。高于 阈值的数值出现可以是例如指示病理状态的存在，具体而言例如自身 免疫和/或炎性疾病的存在。在一个进一步优选的实施方案中，所述测 定是定量测定。在此实施方案中，细胞外IFI 16的浓度和潜在的诊断 问题例如疾病的阶段、疾病的进程或对治疗的反应相关。

优选的，细胞外IFI16的测定包括：

(a)令样品接触至少一种受体，其特异性的结合IFI 16，并

(b)检测该受体与IFI 16的特异结合。

依照本发明，术语“特异结合”描述了受体和IFI 16或其片段之 间特异的相互作用。特异的相互作用可用“钥匙-锁原理”表征。受体 和IFI 16具有互相特异适合的结合或基元，正如与抗体的抗原结合位 点相互作用的抗原决定簇(表位)。

特异性结合IFI 16的受体对IFI16具有至少10⁶1/mol的亲和力， 优选对IFI16的亲和力至少为10⁷1/mol，更优选亲和力至少为10⁸1/mol或者还优选对IFI16的亲和力至少为10⁹1/mol。正如技术熟练 人员应认识到的，术语特异的用于具体指示样品中存在的其它生物分 子不显著结合对IFI 16特异的受体。优选地，与靶标IFI 16之外的 生物分子的结合水平产生的结合亲和力相对于与靶标IFI 16的亲和力 而言分别最多只有10％或更少，只有5％或更少，只有2％或更少， 或者只有1％或更少。特异性结合IFI 16优选受体达到以上关于亲和 力以及关于特异性二者的最低标准。

在依照本发明方法的进一步优选实施方案中，步骤(a)中检测IFI 16与第一受体的特异结合，令样品与针对IFI16的第二受体接触， 所述受体与IFI 16的表位结合并且在第一受体与IFI16结合后仍可接 触。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法涉及使用至少两个 与IFI 16特异结合的受体，其中一个受体是可检测的受体，而另一个 受体则固定在固相上或者携带可允许固定在固相上的基团(例如经由 与所述表面上之结合对的互补成员特异结合)。

此优选实施方案涉及例如利用夹心ELISA之机械原理优势的方 法。此原理是本领域技术人员普遍已知的。此外，在实施例1和3中 描述了相应的方法。

可检测受体可携带可检测的标记基团。进行受体标记的方法是本 领域所已知的。或者，可检测受体基团可以经由另一个包含可检测标 记基团的第三受体被特异识别。

所述标记基团的优选实例是放射性或荧光标记基团。

进一步优选的标记基团包括酶标记基团，例如碱性磷酸酶、过氧 化物酶、[β]-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、脲酶和氯霉素乙酰转移酶。 除商品化的检测试剂盒之包装单之外，适当的实例以及对利用酶反应 进行检测之必需底物的使用是本领域技术人员所已知的。所述的商品 化试剂盒经常包含识别特异物种之抗体的抗体，例如抗小鼠的，并且 发射信号的酶被偶联其上。因此，相应的抗体是第三受体的实例，它 识别第二抗体的特异标记，即是它的Fc部分。

所述受体可选自以下组：肽、多肽、低分子量物质、抗体或其片 段或衍生物和适配子。在优选的实施方案中，所述受体是抗体或其抗 原结合片段。

术语“肽”通常指长达30个氨基酸的氨基酸链。

术语“多肽”指通常包含多于30个氨基酸的肽并且包括蛋白质。

术语“低分子量物质”或小分子指与以上定义之大分子相比分子 复杂性较低的分子。在文献中，术语“低分子量物质”没有以统一的 形式使用。在WO 89/03041和WO 89/03042中，分子量不超过7000 g/mol的分子被描述为小分子。不过，通常规定为分子量在50和3000 g/mol之间，不过更经常是在75和2000g/mol之间且最经常是在100 和1000g/mol之间的范围。本领域技术人员可从以下文件中获知实 例(WO86/02736，WO97/31269，U.S.Pat.No.5,928,868，U.S.Pat. No.5,242,902，U.S.Pat.No.5,468,651，U.S.Pat.No.5,547,853， U.S.Pat.No.5,616,562，U.S.Pat.No.5,641,690，U.S.Pat. No.4,956,303和U.S.Pat.No.5,928,643)。低分子量物质可以是 有机或无机类型的。

依照本发明，术语“抗体”包含多克隆血清以及单克隆抗体。

单克隆抗体及其产生方法是本领域技术人员所已知的。这些是以 和Milstein(1975)首先描述的方法为基础的。其中，此方 法详述于Harlow和Lane的实验室手册中(Antibodies，A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory；(1988)；第 6章)。根据此定义，双特异性抗体、合成抗体以及这些抗体的片段或 衍生物也包括在内。这些包括片段诸如Fab、Fv或scFv以及这些抗体 或抗体片段的化学修饰衍生物。

原则上，适配子是本领域内技术人员从现有技术中可获知的。

优选的，依照本发明的方法是ELISA、EIA或RIA。适当的方法原 则上是本领域内技术人员从Harlow和Lane(文献同上)以及Rehm(文 献同上)中已知的。

到目前为止已知为细胞内蛋白质的IFI16在细胞外环境中被发现 这一令人惊讶的结果使得可能在组织样品培养物上清液、体液样品或 细胞培养物上清液样品中分析IFI 16。利用本发明的方法，IFI 16 可以简便快速的方式被检测并因此用作诊断参数。

细胞外IFI16与病理状况的关系至今尚未公开。因此，没有迹象 表明测定体液内的细胞外IFI16可能评估病理状况。令人惊讶的是， 在本发明中发现测定体液样品中细胞外IFI 16的存在和/或量可以评 估病理状况，尤其是自身免疫和/或炎性疾病。具体而言，本发明的发 明者发现，通过检测来自个体之细胞外液体样品中的IFI 16可能可靠 的判断这些病理状况，即当使用细胞外IFI 16蛋白作为标记物时在疾 病诊断中不需要组织和活组织检查样品。还更出乎意料的是发现个体 体液中检测到细胞外IFI 16水平升高与自身免疫或炎性疾病相关。

基于IFI 16显著存在于SSc、SLE、SjS和类风湿性关节炎(RA) 患者体液中而在健康受试者体液中仅勉强可检测到的令人惊讶的结 果，本发明方法特别可用作为针对自身免疫疾病的诊断工具。

IFI 16在炎症发作中被赋予了特殊的角色，即当其在内皮细胞内 过表达时，上调了数种促炎细胞因子的表达并且涉及TNF-α和IFN 信号传导。

因此，利用本发明方法检测患者体液中的IFI 16对于炎性疾病也 特别重要(包括自身免疫性疾病)，并可能对细菌和病毒感染疾病(AIDS， 脑膜炎，HCV感染)、过敏症、移植反应、心血管和肿瘤疾病等等也很 重要。此外，这些对于在炎性细胞因子(例如干扰素-α)治疗下的患 者的应答反应的测定也很重要。

患者体液样品中IFI 16的检测或定量有可能得到有关患者某些 临床特征的结论。

获得所述样品的方法是本领域技术人员所已知的。任选的，本发 明的方法此外还包括在每一方法步骤之前或之后的一步或数步清洗步 骤。这些清洗步骤用于使非特异性反应(假阳性或假阴性检测)最小 化并且可以提高所述方法的灵敏度。合适的清洗缓冲液及其组成原则 上是本领域技术人员所已知的。优选生理学缓冲溶液。

本发明方法的一个优选实施方案此外还包括在接触第一受体之前 的步骤(a′)或(a″)：(a′)标记样品中所含蛋白质；或(a″)标记第 一受体。

样品中所含蛋白质和/或第一受体可被例如化学标记，例如通过将 被标记的化学基团或标记物与蛋白质中所含半胱氨酸的游离氨基偶 联。所述被标记的化学基团的例子是包含特殊的可检测放射性同位素 的基团。例如荧光染料也可用作标记物。适当的标记物的其它例子是 核酸。然后可用合适的引物在聚合酶链式反应(PCR)中检测样品中以所 述方式标记的蛋白质或受体的存在。

此外，可能在生理学上标记蛋白质，即通过已标记分子的代谢整 合进行。为此目的，将细胞与例如放射性标记的代谢物一起保温。此 保温期间，来源于这些细胞的生物合成并且其中掺入了已标记代谢物 的蛋白质被标记上。此方法适于例如标记由抗体产生细胞所分泌的抗 体。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述受体在接触疑似包含 IFI 16的样品之前被固定于表面上。

依照本发明方法的另一实施方案，所述受体在接触疑似包含IFI 16的样品之后被固定于表面上。

受体可以各种方式被固定。适当的方法取决于多种因素，诸如受 体的类型或所述表面的材料。固定可以通过共价或通过吸附达到。依 照本发明方法的一个优选实施方案，所述受体是蛋白质，尤其优选抗 体。还优选使用肽或有机分子作为受体。

对于蛋白质型受体的固定化而言，使用方法被描述为其中受体经 由被动吸附被直接固定于表面上。通常，适当的表面由聚合塑料材料 (例如聚苯乙烯，聚乙烯，乳胶)组成并且以例如微量滴定板或多孔 板、膜或球状“珠子”(颗粒形式的交联聚合体)用于此目的(Lowman， Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26(1997)，401-24)。

在本发明方法的一个进一步优选的实施方案中，所述表面材料选 自琼脂糖、乳胶、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯、硝酸纤维素和硅。进一 步优选地，本发明方法中的所述表面是膜、珠子、芯片或平板。

珠子的例子有琼脂糖珠子或乳胶珠子，其上任选地结合了配体， 所述配体促进受体固定于所述表面上。这样的配体是例如促进抗体经 由抗体Fc部分结合于表面上的蛋白A或蛋白G。受体与载体材料的结 合还可通过共价化学偶联反应(例如，酰肼偶联)实现。将受体经由配 基固定于表面上的另一例子是使用生物素和亲和素或链霉亲和素。

芯片的例子是众多不同或相同的受体可系统性的固定其上的硅 板。它可以分析样品中的众多不同参数或针对一个或数个参数分析众 多不同的样品，例如在不同组织样品、体液样品或细胞培养物上清液 样品中IFI 16或该蛋白片段的鉴定和/或定量。

上述平板的例子有微量滴定板或多孔板。优选的，这些板具有6， 12，24，48，96，128，356，1024或更多个孔。在实施例1中，描述 了其中使用96孔板的方法。

依照本方法的一个进一步优选的实施方案，它在检测特异结合的 步骤之前进一步包含步骤(b′)：(b′)将珠子与第一受体和IFI 16的 复合物一起沉淀。

珠子可以重力方式从样品中沉淀。这可以通过例如离心来加速。 适当的方法是本领域技术人员所已知的，例如可从Rehm，Der  Experimentator：Proteinbiochemie/Proteomics，Spektrum  Akademischer Verlag，2002获知。

在本发明方法的一个进一步优选的实施方案中，受体和IFI 16 之间特异结合的检测包括样品的凝胶电泳分离和此外任选地蛋白质印 迹分析。适当的方法是本领域技术人员所已知的，例如可从Rehm(出 处同前)获知。此外，相应的方法参阅实施例2和4。

本发明的方法优选自动进行。这可能通过例如自动加样机并用于 优化过程的自动分析来实现。

此外，本发明涉及利用体液或细胞培养物上清液样品，如上所述， 用于检测细胞外的IFI 16。优选的，阳性检测指示了病理状况的存在， 尤其是炎性和/或自身免疫性疾病的存在。

此外，本发明的方法还包含测定至少一个另外的诊断标记物，例 如，指示自身免疫和/或炎性疾病的诊断标记。在一个优选的实施方案 中，所述至少一个另外的诊断标记物是抗-IFI16-自身抗体。

数个诊断标记物的测定可对单一样品或单一样品的不同等份试样 或多个不同样品平行进行。然后独立地分析诊断标记物的浓度，例如， 利用针对每一标记物的独特阈值，或它们可联合起来进行分析。

最后，本发明涉及适于诊断用途的试剂盒，包含：

(i)至少一个受体，它特异结合IFI 16，和(ii)更多的试剂盒 组分，例如缓冲剂、盐、试剂和/或使用说明。

试剂盒的优选实施方案包含两种受体，其中一种受体是可检测的 受体而一个受体是固定的或可以被固定的受体。

此外，本发明将通过以下附图和实施例进行详细的解释，但并不 局限于此。

附图说明

图1：IFI16夹心ELISA的示意图。

图2：IFI16夹心ELISA的灵敏度和线性。用多克隆兔抗-IFI16 抗体包被ELISA微量滴定板。随后，用PBS-Trit on(PBS-T；PBS中 含0.25％Triton X100)漂洗平板30分钟，用PBS-T/BSA 3％(PBS-TB) 在37℃饱和自由结合位点。在用PBS-T漂洗之后，随后保温(1小 时)，用稀释于含5％FCS的PBS-T中的纯化6His-IFI16蛋白作为标 准。BSA用作阴性对照。样品用PBS-T漂洗3次，在每一情形下加入 单克隆小鼠抗-IFI16抗体并在室温保温1小时。在用PBS-T漂洗4次 之后，随后在每一情形下用稀释于PBS-TB的100μl HRP-缀合抗小 鼠抗体进行保温(1小时，室温)。在3个漂洗步骤之后，通过与四 甲基联苯胺(TMB)一起保温来显现IFI 16蛋白/抗体复合物并用终止 溶液停止。用微量滴定板读数仪检测450nm的吸收。用图2使用了逐 步增高浓度之纯化6His-IFI16的标准曲线进行测定浓度。检测值的线 性指示在1至15.6ng/ml的范围。

图3：检查自身免疫病患者和健康受试者中的循环IFI 16。

利用ELISA测定SSc(99)，SLE(30)，SjS(20)，RA(30)患者 和患C型肝炎病毒感染患者(HCV，30)以及健康受试者(CTRLS，54)血 清中的循环IFI 16浓度。

用多克隆兔抗-IFI16抗体包被ELISA微量滴定板。随后，用 PBS-Triton(PBS-T；PBS中含0.25％Triton X100)漂洗平板30分 钟，用PBS-T/BSA 3％(PBS-TB)在37℃饱和自由结合位点。在用 PBS-T漂洗之后，随后与稀释至终体积100μl的5μl不同血清样 品一起保温(1小时)。用稀释于含5％FCS的PBS-T中的纯化 6His-IFI16蛋白作为标准。BSA用作阴性对照。样品用PBS-T漂洗3 次，在每一情形下加入单克隆小鼠抗-IFI16抗体并在室温保温1小时。 在用PBS-T漂洗4次之后，随后在每一情形下用稀释于PBS-TB的100 μl HRP-缀合抗小鼠抗体进行保温(1小时，室温)。在3步漂洗之 后，通过与四甲基联苯胺(TMB)一起保温来显现IFI 16蛋白/抗体复 合物并用终止溶液终止。用微量滴定板读数仪检测450nm的吸收。用 图2中使用逐步增高浓度之纯化6His-IFI16的标准曲线进行浓度确 定。检测的线性为血清中20至400ng/ml IFI 16。浓度在线性范围 之外(＜20ng/ml或＞400ng/ml)的血清分别作图为具有0ng/ml或 400ng/ml。

在一小部分患者血清(54％至84％之间)中可检测到IFI 16血清蛋 白质，而所有健康受试者中的IFI 16血清浓度均在测定法的检测界 限之下。

图4：细胞上清液中细胞外IFI16的鉴定。将人的角质形成细胞 暴露于剂量为200，400或800J/m2(分别为UV 200，UV 400或UV 800) 的UVB照射或模拟照射(NT)下，然后保温16或24小时(分别为16h 或24h)。收集上清液并如实施例2中所述用TCA沉淀细胞外蛋白质。 利用抗-IFI16多克隆抗体进行的免疫印迹分析显示在暴露于剂量400 和800J/m²的UVB照射的细胞上清液中存在细胞外IFI 16。将提取 自表达细胞内IFI16的人角质形成细胞(TE)的总细胞蛋白质用作 IFI16免疫印迹的阳性对照。

图5：具有改善的线性的IFI 16夹心ELISA的灵敏度和线性。

用多克隆兔抗-IFI16抗体包被ELISA微量滴定板。随后，漂洗平 板并用PBS/0,05％Tween-20/3％BSA(PBS-TB)在室温饱和自由结合位 点1小时。漂洗之后，继续保温(1小时，室温)，用稀释于含5％FBS 的PBS/0,05％Tween-20/1％BSA(PBS-TD)中的纯化6His-IFI16蛋白 作为标准。BSA用作阴性对照。将样品漂洗并在每一案例中加入单克 隆小鼠抗-IFI16抗体并在室温保温1小时。漂洗之后，随后与HRP- 缀合抗小鼠抗体进行保温(1小时，室温)。漂洗之后，通过与四甲 基联苯胺(tetramethyl benzidine，TMB)一起保温来显现IFI 16蛋 白/抗体复合物并用终止溶液终止。用微量滴定板读数仪检测450nm 的吸收。用图5使用逐步增高浓度之纯化6His-IFI16的标准曲线进行 浓度确定。检测的线性指示在1至32ng/ml的范围内。

图6：用具有改善线性的IFI16ELISA测量自身免疫病患者和健康 受试者中的循环IFI 16。

利用ELISA测定SSc(50)，SLE(50)，SjS(51)，RA(50)，抗 磷脂综合症(pAPS，80)患者和患C型肝炎病毒感染患者(HCV，82)以 及健康受试者(CTRLS，50)血清中的循环IFI 16浓度。所测试的组代 表了与图3中所测试的不同的患者。

用多克隆兔抗-IFI16抗体包被ELISA微量滴定板。随后，漂洗平 板并用PBS/0,05％Tween-20/3％BSA(PBS-TB)在室温饱和自由结合位 点1小时。漂洗之后，接着与处于终体积100μl PBS/0,05％Tween-20/1％BSA(PBS-TD)中的5μl不同血清样品一起 保温(1小时，室温)。用稀释于含5％FBS的PBS-T中的纯化 6His-IFI16蛋白作为标准。BSA用作阴性对照。漂洗样品，在每一情 形下加入单克隆小鼠抗-IFI16抗体并在室温保温1小时。漂洗之后， 随后用稀释于PBS-TD的HRP-缀合抗小鼠抗体进行保温(1小时，室温)。 漂洗之后，通过与四甲基联苯胺(TMB)一起保温显现IFI 16蛋白/抗 体复合物并用终止溶液停止。用微量滴定板读数仪测量450nm的吸收。 用图5使用了逐步增高浓度之纯化6His-IFI16的标准曲线进行浓度确 定。测量的线性在血清中为20至640ng/ml IFI 16的范围内。浓度 在线性范围之外(＜20ng/ml或＞640ng/ml)的血清分别作图为具有 0.1ng/ml或640ng/ml。单一的灰色水平线代表了每个组的平均IFI 16浓度。

IFI 16阳性的阈值设置为对照群体的95％(117ng/ml)，且以浅 灰色连续水平线表示。低于X轴的数字代表了各组中所含IFI16血清 浓度高于阈值水平的患者百分数。在20％至80％的部分SSc，SLE，SjS， RA和HCV患者血清中可检测到IFI 16血清蛋白高于阈值，而在健康 受试者中则只有6％。只有1％的pAPS患者其循环IFI 16是阳性的。

图7：正经历细胞死亡的细胞的上清液中细胞外IFI 16的鉴定。

用不同剂量(分别为200，400和800J/m²)的UVB-照射人的角质 形成细胞单层，用2μM阿霉素(Doxorubicin)(Doxo)和80μM依 托泊苷(Etoposide)(VP-16)进行处理，或者不处理。在处理16小 时后，收集上清液并分离用于测定细胞外IFI 16，而残余的细胞则被 裂解用于测定PARP的细胞内裂解形式(正经历细胞死亡的测定)。如 实施例4所述用TCA 25％浓缩收集的上清液。将每个样品等量的总细 胞蛋白质和等体积的浓缩上清液在SDS-PAGE(7,5％of NEXT GEL Amresco，OH，USA)上分离并转移至硝酸纤维素膜(Biorad，CA，USA) 上。用抗-IFI16多克隆抗体进行的免疫印迹分析表明在暴露于剂量 400和800J/m²UVB照射的细胞的上清液中存在细胞外IFI 16。此 现象通常不与细胞损伤相关，因为它在由于暴露于药理学细胞毒药物 诸如阿霉素(Doxorubicin)和依托泊苷(Etoposide)而经历化学诱 导之细胞死亡的角质形成细胞中未观察到(正如通过一个公认的坏死 和凋亡细胞死亡标志即PARP裂解所证实的)(Cepeda V.et al.， Recent Pat Anticancer Drug Discov.2006Jan；1(1)：39-53))。

实施例1 IFI 16 ELISA

以下缓冲液用于开发的IFI 16ELISA：PBS-T(PBS中含0.25％ Triton X100)；和PBS-TB(PBS中含0.25％Triton X100和3％BSA)。

用100μl/孔的抗-IFI16多克隆抗体包被96-孔ELISA平板 (Nunc-Maxisorb Plates)(4℃保温16小时)。平板用PBS-T漂洗 并用PBS-TB室温封闭至少30分钟。将孔中液体吸出并成对的分别加 入稀释于含5％FBS之PBS-TB中的100μl标准品(6His-IFI16)或 加入100μl适当稀释度的样品(用PBS-TB稀释)在37℃保温1小 时。将所述孔用PBS-T漂洗4次并与稀释于PBS-TB中的100μl抗 IFI 16单克隆小鼠抗体在37℃保温1小时。随后，将孔用PBS-T漂 洗3次并与1∶500稀释于PBS-TB中的100μl缀合了过氧化物酶 (HRP)的兔抗小鼠抗体(GE HealthCare，USA)一起在37℃保温1小 时。随后，将孔用PBS-T漂洗3次并与100μl四甲基联苯胺 (SureBlue-TMB，KPL，USA)一起保温，然后用100μl终止液(TMB StopSolution，KPL，USA)终止。在微量滴定板读数仪(Tecan)上测定 450nm的吸收，以620nm作为参照。利用标准曲线计算样品中的IFI 16浓度。该方法显示线性范围为1至15.6ng/ml IFI 16/孔。不同 次检验法之间的结果差异为9,7％(检验之间CV％＝9,7％)。

实施例2

细胞上清液中IFI 16的蛋白质印迹分析

将培养于无血清培养基(Epilife，Cascade Biologies，USA)中的 人原代角质形成细胞上清液用三氯乙酸(TCA)进行沉淀。用免疫印迹 分析被沉淀的蛋白质。

将细胞培养于无血清培养基(Epilife，Cascade Biologies，USA) 中，然后暴露于不同剂量(200至800J/m²)的紫外线B照射(UVB) 或模拟照射下。照射16和24小时后，收集上清液并5000g离心10 分钟以去除细胞碎片。然后将TCA加入上清液中至终浓度为25％v/v， 将样品冰置10分钟并在4℃以14000g离心10分钟。将蛋白质沉淀用 100％丙酮漂洗3次，风干并重悬于Laemmli样品缓冲液中。在95°变 性5分钟后，将样品加到7.5％聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳。

将迁移的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。将该膜用TBS-5％BSA封 闭，然后通过将膜与抗-IFI16兔多克隆抗体一起在4℃保温过夜来检 测细胞外的IFI 16。用TBS-0.05％-Tween20(TBS-T)漂洗3次后，将 膜与HRP-缀合的抗兔二抗(GE Healthcare，USA)一起室温保温1小时。 用TBS-T漂洗后，将膜与ECL(GE HealtCare)一起保温然后用GelDoc 图像分析仪(BioRad，USA)获取化学发光信号。

实施例3具有改善线性的IFI 16 ELISA

以下缓冲液用于开发的IFI16 ELISA：PBS-TB(PBS中含0.05％ Tween-20和3％BSA)以及PBS-TD(PBS中含0.05％Tween-20和1％ BSA)。

用100μl/孔的抗-IFI16多克隆抗体包被96-孔ELISA平板 (Nunc-Maxisorb Plates)(4℃保温16小时)。平板用漂洗缓冲液 (Wash Solution Concentrate，KPL，USA)漂洗并用PBS-TB室温封闭 至少1小时。漂洗孔并成对的分别加入稀释于含5％FBS之PBS-TD中 的100μl标准(6His-IFI16)或加入100μl适当稀释度的样品 (用PBS-TD稀释)在室温保温1小时。漂洗所述孔并与100μl抗IFI 16单克隆小鼠抗体(稀释于PBS-TD中)在室温保温1小时。随后， 将孔漂洗并与1∶500稀释于PBS-TD中的100μl缀合了过氧化物酶 (HRP)的兔抗小鼠抗体(GE HealthCare，USA)一起在室温保温1小时。 随后，将孔漂洗并与100μl四甲基联苯胺(SureBlue-TMB，KPL， USA)一起保温，然后用100μl终止液(0.6N H₂SO₄)终止。在微量滴 定板读数仪(Tecan)上测定450nm的吸收，以620nm作为参照。利用 标准曲线计算样品中的IFI 16浓度。该方法显示线性范围为1至32 ng/ml的IFI16/孔。阈值设置为对照种群的95％。呈现出IFI16浓 度高于阈值的受试者被认为其循环IFI16的存在是阳性。

实施例4

正经历细胞死亡之细胞的上清液中的IFI 16的蛋白质印迹分析

将培养于无血清培养基(Epilife，Cascade Biologies，USA)中的 人原代角质形成细胞的上清液用三氯乙酸(TCA)进行沉淀。用免疫印 迹分析被沉淀的蛋白质。

将细胞培养于无血清培养基(Epilife，Cascade Biologies，USA) 中，然后暴露于不同剂量(200至800J/m²)的紫外线B照射(UVB) 下或用2μM阿霉素(Doxorubicin)(Doxo)或80μM依托泊苷 (Etoposide)(VP-16)处理或用模拟照射。处理16小时后，收集上 清液并以5000g离心10分钟以去除细胞碎片。然后将TCA加入上清 液中至终浓度为25％v/v，将样品冰置10分钟并在4°以14000g离 心10分钟。将蛋白质沉淀用100％丙酮漂洗3次，风干并重悬于Laemmli 样品缓冲液中。

作为经由UVB照射和Doxo或VP-16处理诱发的进行中细胞死亡的 对照，还测定了所暴露的角质形成细胞中的细胞内PARP裂解。为此将 黏附细胞裂解于RIPA缓冲液(50mM Tris-cl pH 7.4，150mM NaCI， 1％NP40，0.25％脱氧胆酸钠，1mM PMSF，1X完全小型蛋白酶抑制剂 混合液(Roche)，1X磷酸酶抑制剂混合液(Pierce))中。

在95°变性5分钟后，将样品加到7.5％聚丙烯酰胺凝胶上进行 凝胶电泳。

将迁移的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。将该膜用 TBS/0.05％Tween20/5％BSA封闭，然后通过将含有上清液样品的膜与 抗-IFI16小鼠单克隆抗体(克隆1G7，Santa Cruz，CA，USA)一起保 温来检测细胞外的IFI 16。通过将含有细胞提取物样品的膜与兔抗- PARP裂解抗体(GTX24830，CeneTex，CA，USA)一起保温来检测PARP 的细胞内裂解形式。用TBS/0.05％Tween20(TBS-T)漂洗3次后，将膜 分别与HRP-缀合的抗小鼠或抗兔二抗(GE Healthcare，USA)一起室温 保温1小时。用TBS-T漂洗后，将膜与ECL(GE HealtCare)一起保温， 然后用GelDoc图像分析仪(BioRad，USA)获取化学发光信号。