一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用。本发明提供了一种来源于芽孢杆菌属Bacillus sp.HJB17的中性植酸酶PhyH，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述中性植酸酶的编码基因PhyH。本发明的植酸酶具有良好的pH稳定性，在碱性范围内依然保持较高酶活；在低温范围具有较高的相对酶活；具有双结构域，N端为一个不完整的BPP植酸酶结构域；C端是一个完整的植酸酶的结构域。总之，本发明获得的PhyH作为一种低温中性植酸酶可以应用于渔业养殖生产；其PhyH-DI结构域可以提高其他植酸酶的催化效率，有助于其改进其他植酸酶的生产和应用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用。

背景技术

myo-肌醇六磷酸(IP₆，myo-inositol hexakisphosphate)又叫做植酸(phytic acid)，是自然界中肌醇磷酸的最常见的形式。植酸的分子式是C₆H₁₈O₂₄P₆，分子量是660.09。

植酸主要以植酸钙镁钾盐的形式广泛存在于植物种子内，也存在于动物有核红细胞内，在土壤、植物以及微生物分泌到胞外的酶中都发现有植酸酶的存在。可想而知，植酸酶对于自然环境中磷的代谢循环有着重要的作用。另外，植酸对绝大多数金属离子都有极强络合能力，络合力与EDTA相似，但比EDTA的应用范围更广。在通常条件下，植酸中的磷酸酯键是非常稳定的，对于植酸的降解一般有两种方法，一是化学方法，但利用化学方法来降解植酸是极其困难的；另一种方法是酶解法，目前我们已知的能够有效降解植酸的只有植酸酶。

目前植酸酶已经广泛的应用于饲料行业，特别是来源于真菌和细菌的组氨酸酸性磷酸酶类(HAP)植酸酶，因其最适pH偏酸和比活高等特点，可以显著的提高它们在鸡和猪的生产性能。如大肠杆菌和曲霉来源地植酸酶已经广泛地应用在动物养殖业。但因为在水产养殖业中的鱼类生长环境和体内温度较低，pH偏中性，导致HAP类植酸酶的应用受到了限制，所以具有中性pH特征的BPP类植酸酶越来越受到关注。但是目前已知BPP类植酸的最大缺点是催化效率低，很难满足实际生产需求。所以获得新型优质BPP植酸酶，提高BPP类植酸酶的催化效率，都将可以大大扩展其实际应用空间，也正是目前急需解决的问题和热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有双结构域的低温中性植酸酶。

本发明的另一目的是提供编码上述双结构域低温中性植酸酶的基因。

本发明的另一目的是提供上述植酸酶N端及C端结构域及其编码基因，其中，N端结构域可以协同提高其他植酸酶的催化效率。

本发明的另一目的是提供包含上述具有双结构域的低温中性植酸酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述具有双结构域的低温中性植酸酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供上述具有双结构域的低温中性植酸酶的应用。

本发明从芽孢杆菌(Bacillus sp.HJB17)(微生物保藏号是：CGMCC No.4868；保藏时间是：2011年05月18号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。100101)中分离得到一种新的具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH。

本发明提供了一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MLVAKKLATKNMFLLGAVSLTLLAMLSGCQAGKFATPISAAVQPLSVNASHFHKVQLAGQDYQLFTTTTALQIRQGNRELAQQAGQFSRLVLQPLDTDALLLAAMDINSNTLFLWRFSTKQTPSLQLLQRRLISSRVVDDLCFYHSTENQQLSLFLLGGRGGADQLLLQQQQQWLAQPVVIRELNIPYDSTACVVDQTAGALYIAEADRAIWRYQAEPEADEGRSLVQVNKPFGQLQGEVKALQTLSDGSLLALEEAPARLLHINSDGQLRSAIAVPALAEASGLAVSMQGNTATAYISTEDAGAVQQLAVVPQAKPERQPKAPVVQLLPTLQTEPASQRGDVMDDPAVWHHPARPELSLILGTDKRAGLDVYNMQGTRVQQLSVGRLNNVDVRYGLNWQGSAHDIAVASLRDDNSLQLFAIDSSGTLHNAGKVATSMSEIYGLCMYHSAQ SNKHYVFVNDKAGLIQQYRIDTDGDHWQGSLVRALQVPSQPEGCVADDIRGLLFVGEEDAAIWRFAAEAEATTTGEAIIRVDGERLVDDIEGITLAEHNGSSYLLVSSQGNDSYLVFDAAPPYTERPHFRIGTNPLLGIDGASETDGVDVTTRSLGPGFEQGAFIVQDGRNRMPEQGQNLKLVPWADILQQLN

其中，该酶包含644个氨基酸和一个终止密码子，前40个氨基酸是信号肽，因此，成熟的植酸酶PhyH的理论分子量为67kDa。

本发明的植酸酶PhyH同时具有双结构域，并有低温活性。

本发明从筛选到Bacillus sp.HJB17中获得的中性植酸酶PhyH，其最适pH值为7.0，在碱性范围内pH 7.0-12.0，活性基本保持不变；最适温度为35℃，并在低温范围内(20-35℃)仍具有60％左右的酶活力。本发明中性植酸酶PhyH包括两个植酸酶结构域：N端的不完整的结构域PhyH-DI和C端的具有完整的典型BPP植酸酶结构域PhyH-DII。其中PhyH-DII和PhyH均具有植酸酶活性。

本发明提供了编码上述双结构域植酸酶PhyH的基因。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2

atgttagtagctaaaaagttagccacaaaaaatatgtttttactcggtgcagtcagtctgacgctgctggccatgctaagcggctgtcaggctggcaagtttgccacacctatatcagctgcagtccaacctttatcggtcaatgccagccacttccataaggtgcagctggccgggcaggattatcagctattcaccacaaccacggccttgcagatccgccagggcaatcgcgagctggcgcagcaagctggccagtttagccgcctggtgctgcagccactggataccgatgcgctgttattggcagcgatggatataaacagtaatactttgtttttatggcgtttttcaacaaagcaaacgcccagcctgcaattgctgcaacgccggttgatcagcagccgggtggtagacgatctgtgcttttaccacagtactgaaaaccagcagctcagcctgtttttactcggtggccgcggaggcgctgatcagctgctgttgcaacagcagcaacagtggctggcgcaaccggtggtaatacgcgagttaaatatcccttatgacagcacggcttgtgtagtggatcagaccgctggtgcgctgtatatcgccgaagctgatcgcgctatctggcgctatcaggccgaacccgaagccgatgagggccgcagtttagttcaggtaaataagccgtttggccagttgcagggcgaagtaaaagcgctgcaaacgttgtctgacggcagcctgctggcgctggaggaagcaccggccagattgttacatattaacagcgacggccagctgcgcagcgccatagctgtcccggcgttggccgaggccagcggtttagcggtcagtatgcagggcaacacggcaacagcctatatcagcactgaggatgccggtgcagtacagcagctagcggtggtgccgcaggcgaagccggagcgtcagcccaaagcgccggtagtccagctgttgccgaccttacagactgagcccgccagtcagcgtggcgatgtgatggatgaccccgcggtgtggcatcatccggcgcggcctgagcttagcctgatcctcggcactgacaaacgcgccggactggatgtgtacaatatgcagggtacgcgcgtgcagcagcttagcgtgggccggttaaataatgtcgatgtgcgctacggcctgaactggcagggtagtgcgcacgatattgccgtagccagtttgcgcgacgacaacagcctgcaactttttgctattgatagcagtggcacgctgcataatgccggtaaggtcgcaaccagcatgagcgagatttacggcctgtgtatgtatcacagtgcacaaagcaataagcattatgtgtttgttaatgataaagccggtttaattcagcagtatcgcatcgacacagacggcgaccactggcagggcagcttagtgcgcgctttgcaggtaccgtcgcaaccggaaggctgtgtggccgatgatatacgcggcctgttatttgtcggcgaagaagatgctgccatctggcgttttgccgctgaagccgaagcgacaaccacaggtgaagcgatcatccgcgttgatggtgagcggctggtcgacgatattgaaggcataacattggcagagcataacggcagcagttatctgttggtatcaagccagggtaatgacagttacctggtgtttgacgccgcgccaccttatacagagcggccgcattttcgtattggcactaacccattactgggcatagatggcgcctctgagactgatggcgttgatgttaccacccgttcgctggggcctggctttgagcagggcgcctttatcgtacaggacggccgtaaccgtatgccggaacagggccaaaaccttaaactggtaccctgggcagatatattgcagcaattaaac

本发明提供了一种具有双结构域的低温中性植酸酶，其N端不完整结构域(41-318aa)PhyH-DI的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，该不完整结构域PhyH-DI的理论分子量是31kDa。。

SEQ ID NO.3：

AVQPLSVNASHFHKVQLAGQDYQLFTTTTALQIRQGNRELAQQAGQFSRLVLQPLDTDALLLAAMDINSNTLFLWRFSTKQTPSLQLLQRRLISSRVVDDLCFYHSTENQQLSLFLLGGRGGADQLLLQQQQQWLAQPVVIRELNIPYDSTACVVDQTAGALYIAEADRAIWRYQAEPEADEGRSLVQVNKPFGQLQGEVKALQTLSDGSLLALEEAPARLLHINSDGQLRSAIAVPALAEASGLAVSMQGNTATAYISTEDAGAVQQLAVVPQAKPE

本发明的中性植酸酶PhyH的N端的不完整的结构域PhyH-DI不能降解植酸(IP₆)。进一步的研究发现，PhyH-DI可以降解低磷底物IP₄，并且可以与PhyH-DII及其他植酸酶协同作用，来提高植酸酶的催化效率。

本发明提供了编码上述不完整结构域值酸酶PhyH-DI的基因。具体地，该基因的序列如SEQ ID NQ.4所示：

SEQ ID NO.4

GCAGTCCAACCTTTATCGGTCAATGCCAGCCACTTCCATAAGGTGCAGCTGGCCGGGCAGGATTATCAGCTATTCACCACAACCACGGCCTTGCAGATCCGCCAGGGCAATCGCGAGCTGGCGCAGCAAGCTGGCCAGTTTAGCCGCCTGGTGCTGCAGCCACTGGATACCGATGCGCTGTTATTGGCAGCGATGGATATAAACAGTAATACTTTGTTTTTATGGCGTTTTTCAACAAAGCAAACGCCCAGCCTGCAATTGCTGCAACGCCGGTTGATCAGCAGCCGGGTGGTAGACGATCTGTGCTTTTACCACAGTACTGAAAACCAGCAGCTCAGCCTGTTTTTACTCGGTGGCCGCGGAGGCGCTGATCAGCTGCTGTTGCAACAGCAGCAACAGTGGCTGGCGCAACCGGTGGTAATACGCGAGTTAAATATCCCTTATGACAGCACGGCTTGTGTAGTGGATCAGACCGCTGGTGCGCTGTATATCGCCGAAGCTGATCGCGCTATCTGGCGCTATCAGGCCGAACCCGAAGCCGATGAGGGCCGCAGTTTAGTTCAGGTAAATAAGCCGTTTGGCCAGTTGCAGGGCGAAGTAAAAGCGCTGCAAACGTTGTCTGACGGCAGCCTGCTGGCGCTGGAGGAAGCACCGGCCAGATTGTTACATATTAACAGCGACGGCCAGCTGCGCAGCGCCATAGCTGTCCCGGCGTTGGCCGAGGCCAGCGGTTTAGCGGTCAGTATGCAGGGCAACACGGCAACAGCCTATATCAGCACTGAGGATGCCGGTGCAGTACAGCAGCTAGCGGTGGTGCCGCAGGCGAAGCCGGAG

本发明提供了上述植酸酶结构域PhyH-DI用于提高植酸酶活性的应用。

本发明提供了PhyH-DII的氨基酸序列，具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.5所示，其理论分子量是36kDa，PhyH-DII可以有效的降解植酸。

SEQ ID NO.5

RQPKAPVVQLLPTLQTEPASQRGDVMDDPAVWHHPARPELSLILGTDKRAGLDVYNMQGTRVQQLSVGRLNNVDVRYGLNWQGSAHDIAVASLRDDNSLQLFAIDSSGTLHNAGKVATSMSEIYGLCMYHSAQSNKHYVFVNDKAGLIQQYRIDTDGDHWQGSLVRALQVPSQPEGCVADDIRGLLFVGEEDAAIWRFAAEAEATTTGEAIIRVDGERLVDDIEGITLAEHNGSSYLLVSSQGNDSYLVFDAAPPYTERPHFRIGTNPLLGIDGASETDGVDVTTRSLGPGFEQGAFIVQDGRNRMPEQGQNLKLVPWADILQQLN

本发明提供了PhyH-DII的核苷酸序列，具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.6所示：

SEQ ID NO.6

cgtcagcccaaagcgccggtagtccagctgttgccgaccttacagactgagcccgccagtcagcgtggcgatgtgatggatgaccccgcggtgtggcatcatccggcgcggcctgagcttagcctgatcctcggcactgacaaacgcgccggactggatgtgtacaatatgcagggtacgcgcgtgcagcagcttagcgtgggccggttaaataatgtcgatgtgcgctacggcctgaactggcagggtagtgcgcacgatattgccgtagccagtttgcgcgacgacaacagcctgcaactttttgctattgatagcagtggcacgctgcataatgccggtaaggtcgcaaccagcatgagcgagatttacggcctgtgtatgtatcacagtgcacaaagcaataagcattatgtgtttgttaatgataaagccggtttaattcagcagtatcgcatcgacacagacggcgaccactggcagggcagcttagtgcgcgctttgcaggtaccgtcgcaaccggaaggctgtgtggccgatgatatacgcggcctgttatttgtcggcgaagaagatgctgccatctggcgttttgccgctgaagccgaagcgacaaccacaggtgaagcgatcatccgcgttgatggtgagcggctggtcgacgatattgaaggcataacattggcagagcataacggcagcagttatctgttggtatcaagccagggtaatgacagttacctggtgtttgacgccgcgccaccttatacagagcggccgcattttcgtattggcactaacccattactgggcatagatggcgcctctgagactgatggcgttgatgttaccacccgttcgctggggcctggctttgagcagggcgcctttatcgtacaggacggccgtaaccgtatgccggaacagggccaaaaccttaaactggtaccctgggcagatatattgcagcaattaaac

本发明通过PCR的方法分离克隆了植酸酶基因phyH，DNA全序列分析结果表明，该基因全长1224bp。将phyH的氨基酸序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，PhyH与来源于Idiomarina loihiensis L2TR的假定植酸酶的具有最高一致性(51％)，PhyH-DI与来源于B.amyloliquefaciens TS-Phy的植酸酶一致性为25％，PhyH-DII与TS-Phy的一致性为49％，与来源于B.subtilis PhyC的一致性为40％，说明phyH是一种新的植酸酶。

本发明还提供了包含上述植酸酶基因phyH的重组载体，命名为pET22b(+)-phyH。将本发明的植酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的植酸酶基因插入到质粒pET22b(+)上的EcoR I和Xho I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET22b(+)-phyH。

本发明还提供了包含上述植酸酶基因PhyH的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种制备中性植酸酶PhyH的方法，包括以下步骤：

1)用上述的载体转化宿主细胞，得到活性菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；

3)回收并纯化所表达的植酸酶PhyH。

本发明还提供了上述植酸酶PhyH的应用。

本发明发现了一种具有双结构域的BPP植酸酶，它由N端的不完整的结构域PhyH-DI和C端的具有完整的典型BPP植酸酶结构域PhyH-DII组成。研究发现，一方面，不完整的结构域PhyH-DI不能降解植酸酶底物IP₆，但是可以降解植酸水解过程中的中间产物IP₄，从而促进植酸底物的完全降解；另一方面，该结构域可以与PhyH-DII等其他植酸酶协同作用，从而提高其他单结构域质酸酶的比活和催化效率，为提高BPP类植酸酶的催化效率提供了一种思路。同时，该酶具有低温活性和良好的碱性稳定性，具有实际应用的潜力。

本发明首先所要解决的技术问题是针对BPP类植酸酶催化效率低的现状，提供一种性质优良的、适合于在鱼类饲料中应用新的植酸酶。本发明的植酸酶最适pH为7.0，在pH 7.0～12.0都的稳定性好；最适温度35℃，在20-35℃保持60％以上的酶活，并且在0℃还有20％的酶活。其低温和pH中性的特性，可使其在鱼类饲料中应用。本发明发现了不完整的结构域PhyH-DI可以降解IP₄，并可以与完整的结构域PhyH-DII协同作用，来提高双结构域植酸的催化效率。通过融合表达，发现这种协同作用同样适用于其它的植酸酶。

附图说明

图1重组植酸酶的表达和纯化，其中，1 PhyH未纯化 2 PhyH-DII未纯化3 PhyH-DI未纯化 4 PhyH(67kDa) 5 PhyH-DII(36kDa) 6 PhyH-DI(31kDa)

图2重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的钙离子浓度影响。

图3重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的最适pH。

图4重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的pH稳定性。

图5重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的最适温度。

图6重组植酸酶PhyH的热稳定性。

图7重组植酸酶PhyH-DII的热稳定性。

图8融合表达载体构建图。

芽孢杆菌(Bacillus sp.HJB17)(微生物保藏号是：CGMCC No.4868；保藏时间是：2011年05月18号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；100101)

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从芽孢杆菌(Bacillus sp.HJB17)(微生物保藏号是：CGMCCNo.4868；保藏时间是：2011年05月18号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；100101)中分离得到一种新的具有双结构域的低温中性植酸酶，大肠杆菌表达载体pET22b(+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。细菌基因组提取试剂盒购自天根公司。

3、培养基：

大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 芽孢杆菌Bacillus sp.HJB17产酶特性

新疆天上一号冰川冻土样品经植酸酶筛选培养基培养(低磷培养基LPM)后，按常规稀释平板，分别在4，20，37℃进行培养。然后将生长出的具有透明圈单菌落划平板分纯，并将有活性菌株进行鉴定，经16S鉴定后该菌株为芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp.HJB17。

低磷培养基LPM的配方如下：

酪蛋白胨1g；大豆蛋白胨0.45g；葡萄糖4g；谷氨酸盐0.5g；氯化钠5g；MgCl₂1.7mM；MgSO₄1.4mM；KCl，0.47mM；CaCl₂0.3mM；溶于900mL 50mMpH 7.5Tris-HCl中，定容至1000mL，分装，灭菌15min待用。

Bacillus sp.HJB17的最适生长条件是37℃，pH 7.0。在37℃检测到该菌具有植酸酶活性(0.33±0.05U·mL^-1)。

实施例2 芽孢杆菌Bacillus sp.HJB17植酸酶编码基因phyH的克隆

提取芽孢杆菌Bacillus sp.HJB17基因组DNA，采用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)，具体操作间说明书。根据BPP植酸酶基因的保守区序列设计合成了简并引物BPP-F和BPP-R：BPP-F：5′-GACGCAGCCGAYGAYCCNGCNITNTGG-3′和BPP-R：5′-CAGGSCGCANRTCIACRTTRTT-3′。以Bacillus sp.HJB 17总DNA为模板进行PCR扩增。得到一约180bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1 植酸酶PhyH的TAIL-PCR特异性引物

  引物名称  引物序列(5′---3′)  引物长度(bp)  USP-1  ACCGGCCCACGCTAAGCTGCTG  22  USP-2  CTGCTGCACGCGCGTACCCTGC  22  USP-3  TCAGGCTAAGCTCAGGCCGCGC  22  DSP-1  TCATCCGGCGCGGCCTGAGCTTAG  24  DSP-2  TAGCCTGATCCTCGGCACTGACAAACGC  28  DSP-3  GCGTGCAGCAGCTTAGCGTGGG  22

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德公司测序。拼接后phyH基因全长1224bp，编码664个氨基酸和一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为67kDa。将phyH序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，PhyH与来源于Idiomarina loihiensis L2TR的假定植酸酶的具有最高一致性(51％)，PhyH-DI与来源于B.amyloloquefaciens TS-Phy的植酸酶一致性为25％，PhyH-DII与TS-Phy的一致性为49％，与来源于B.subtili PhyC的一致性为40％，说明phyH是一种新的植酸酶。经比对和结构分析，该植酸酶具有两个植酸酶结构域：N端的不完整结构域PhyH-DI和C端具有典型植酸酶结构的结构域PhyH-DII。

实施例3 重组植酸酶的制备

PhyH的重组与纯化：

将去除信号肽的编码植酸酶的基因phyH和表达载体pET22b(+)同时进行双酶切(EcoRI+XhoI)后，过夜连接，转化至TransI感受态中，获得含有Bacillus sp.HJB 17BPP植酸酶基因phyH的重组质粒pET22(+)-phyH，然后经测序正确的重组质粒pET22(+)-phyH转化至BL21(DE3)。

取含有质粒的BL21(DE3)菌株，接种于300mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养约2h后，加入1mM IPTG和1mM CaCl₂，置于30℃220rpm进行诱导，约8h后测定胞内和胞外的植酸酶活力。在胞内胞外均检测到植酸酶的活性，并且胞内要高于胞外。经过镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明，重组植酸酶得到了表达并达到电泳纯(图1)。

PhyH-DII的重组与纯化：

根据植酸酶phyH-DII蛋白编码基因序列设计表达引物，并引入酶切位点EcoRI和XhoI，将基因phyH-DII和pET22(+)同时双酶切，过夜连接，转化BL21(DE3)获得正确的pET22(+)-phyH-DII重组质粒。将含有正确重组质粒的菌株进行诱导，条件为37℃，IPTG(1mM)，在诱导8小时后，在上清和胞内均检测到植酸酶酶活。将上清酶液和和胞内酶液进行收集，通过镍柱纯化，在NTA200的洗脱液中的蛋白达到了电泳纯(图1)，收集酶液进行下一步的活性分析。

实施例4 重组植酸酶的活性分析

将纯化后的蛋白用有0.1mol/L的pH7.0的Tris缓冲液稀释，取50μL稀释酶液加底物4mmol/L植酸钠950μL(用0.1mol/L的pH4.5的醋酸缓冲液配制)用，37℃反应30min，加1mL 10％TCA终止反应，加2mL显色液(10g四水合钼酸铵+32mL硫酸+73.2g硫酸亚铁，加水定容至1L)。对照则加酶液后先加TCA混匀，再加底物。显色后700nm下测其OD值，计算酶活。

实施例5 重组植酸酶PhyH的性质测定

1、钙离子对重组植酸酶PhyH和PhyH-DII的影响

将纯化后的植酸酶PhyH和PhyH-DII在1.5mmol/L pH 7.0的植酸钠底物中加入不同浓度的CaCl₂(0-5.0mM)，在37℃中测定酶活性，研究Ca²⁺浓度对酶活性的影响。结果表明，PhyH和PhyH-DII的最适钙离子浓度为1mM，高浓度的钙离子浓度对PhyH影响不大，但是抑制了PhyH-DII的活性(图2)。

2、重组植酸酶PhyH的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组植酸酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物植酸钠用不同pH的0.2mol/L缓冲液中37℃下进行植酸酶活力测定。结果(图3)表明，重组酶PhyH的最适pH为7.0，在pH6.0-8.0有80％以上的相对酶活性。植酸酶于上述各种不同pH的缓冲液中在37℃处理120min，再在pH7.0缓冲液体系中70℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图4)表明植酸酶在37℃处理时，PhyH在碱性范围内pH 7.0-12.0之间均很稳定，在此pH范围内处理120min后剩余酶活性在90％以上。而在60℃高温度条件下，在最适pH 7.0附近，处理120min，酶活对高浓度的钙离子有依赖性。

3、植酸酶PhyH的最适温度及热稳定性测定方法如下：

PhyH和PhyH-DII的最适温度为35℃，在20-35℃保持60％以上的酶活，并且在0℃还有20％的酶活(图5)。同时PhyH和PhyH-DII对钙离子有一定的依赖性，1mM是钙离子的最佳浓度。在热稳定性方面，钙离子显著地增强了植酸酶的稳定性，完整的结构域PhyH在10mM钙离子的保护下，60℃处理1小时，还保持90％的相对酶活(图6)，PhyH-DII的热稳定性稍差，在10mM钙离子的条件下，60℃处理1小时，可以保持70％的相对酶活(图7)。

4、植酸酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的植酸钠为底物，在Tris盐酸缓冲液(pH7.0)缓冲液体系中，35℃下测定酶活性，计算出其在35℃下的K_m值。经测定，以植酸钠为底物时在35℃的K_m值分别为4.43±0.55和1.82±0.23mg/mL，最大反应速度V_max分别为24.82和15.93μmol/min·mg。

5、PhyH-DI的底物特异性

将PhyH-DI同时作用于植酸和相应的低磷肌醇磷酸，分别是1mM的D-Ins(2)P1，D-Ins(1，4)P2，D-Ins(1，3，4)P3，D-Ins(1，3，4，5)P4，Ins(1，3，4，5，6)P5 or InsP₆，在100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.0)缓冲液体系中，37℃下反应30min，测定其磷酸释放量。结果表明，PhyH-DI虽然不能降解植酸IP₆，但是可以降解d-Ins(1，3，4，5)P4，对其他低磷肌醇磷酸也没有降解能力，这是首次发现不完整的植酸酶结构域具有降解IP₄的能力(表2)。这种水解能力可以保障其与其他植酸酶共作用时加强对植酸底物的彻底水解.

表2 PhyH-DI的底物特异性

 底物名称 比活(U·mg^-1) D-Ins(2)P₁ ND^a D-Ins(1，4)P₂ ND D-Ins(1，3，4)P₃ ND D-Ins(1，3，4，5)P₄ 4.28±0.56Ins(1，3，4，5，6)P₅ NDInsP₆ ND

^aND指未检测到酶活。

6、PhyH-DI与单结构域植酸酶的协同作用

将PhyH-DI与BPP类的植酸酶进行协同作用实验，它们是来源于Pedobacternyackensis的PhyP，来源于Bacillus.subtilis 168的168phy和HAP类的来源于大肠杆菌的植酸酶APPa。首先将单结构域的植酸酶37℃单独作用一段时间(5min或120min)，置于沸水中煮5min使第一个酶失活，然后加入PhyH-DI 37℃反应120min，然后用三氯乙酸终止并加入显色液，在OD₇₀₀下测定无机磷的释放量。结果表明：PhyH-DI确实可以与单结构域的植酸酶产生协同的作用(表3)，通过以这些植酸酶作用后产生的中间产物为底物进行降解，从而提高单结构域植酸酶的催化能力。

同时，我们对比了双结构域PhyH与两个结构域PhyH-DI和PhyH-DII的降解能力，即25nmol PhyH与25nmol的PhyH-DI和25nmol PhyH-DII的混合酶或者是50nmol PhyH-DII在37℃同时反应120min后，分别测定其无机磷释放量。结果表明：双结构域的PhyH的催化能力要远远高于单独结构域累计之和，并且高于两倍分子的PhyH-DII，这说明了双结构域植酸酶可能形成了某种特殊的催化机制(如超结构域)，从而更有效地对植酸进行降解。

表3、PhyH-DI与单结构域的植酸酶的协同作用

^a两个酶单独作用时的无机磷释放量之和。

^b实际测定值与理论值的比值。

7、融合蛋白的构建及PhyH-DI结构域的协同作用

我们将PhyH-DI与其他的单结构域的植酸酶进行融合表达(图8)，并且测定融合蛋白的动力学参数。结果发现，PhyH-DI同样可以提高单结构域植酸酶的降解效率(表4)，从而验证PhyH-DI提高催化效率的普遍性意义。

表4、PhyH、PhyH-DII及融合表达蛋白的动力学参数