适冷蛋白酶MCP-01在肉类嫩化中的应用

摘要

本发明涉及适冷蛋白酶MCP-01在肉类嫩化中的应用，属于食品生物技术技术领域。本发明通过如下技术方案完成肉类嫩化：(1)将适冷蛋白酶MCP-01配制成浓度为5～20μg/ml的适冷蛋白酶MCP-01溶液；(2)将待嫩化的肉洗净后，浸入步骤(1)制得的适冷蛋白酶MCP-01溶液中，0～8℃保藏18～30小时。该蛋白酶可在0～4℃下特异性降解肉类结缔组织中的胶原蛋白，在肉类嫩化过程中具有很好的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及适冷蛋白酶MCP-01在肉类嫩化中的应用，属于食品生物技术技术领域。

背景技术

我国是世界上最大的肉类生产国，但高新技术在我国肉制品加工业的应用还较薄弱，精深加工的肉制品很少。在肉的食用品质中，嫩度是消费者最为重视的感官指标之一。肉质柔软细嫩而多汁的肉，消费者比较乐于接受。肉的硬度包括两部分：由肌原纤维变化造成的肌动球蛋白硬度和由于结缔组织变化造成的背景硬度。目前，肉类嫩化的方法有很多，但从效果看来，采用蛋白酶嫩化的方法最为先进。它可以在适当温度下温和地降解肉类蛋白质，从而提高嫩度。方法简便，所用时间短，口感独特，显著提高经济效率，避免不必要的浪费。

目前已用于商业的肉类嫩化酶有植物性蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)、细菌性蛋白酶(枯草杆菌的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、嗜热芽孢杆菌的耐热性蛋白酶)、动物蛋白酶(胰酶、胶原酶)等几大类。这些酶均具有降解胶原蛋白或弹性蛋白的能力。目前研究和应用的所有肉类嫩化酶均为中高温蛋白酶，这些蛋白酶的最适酶活温度都在50℃或以上，在0-4℃下酶活很低，因此一般在40℃以上应用。另外，中高温蛋白酶对热比较稳定，这会使肉类嫩化酶在完成嫩化后难以灭活。适冷胶原蛋白酶在低温和室温下具有较高的酶活，可以在室温下对肉制品进行快速嫩化。而且适冷酶具有热敏感性，在中温条件下就容易失活，从而使嫩化酶在完成嫩化后容易被灭活。适冷胶原蛋白酶的这些特点使其在肉类嫩化中具有很好的应用潜力。因此，适冷胶原蛋白酶在肉制品的嫩化方面中具有广阔的应用前景，但是目前尚没有具有肉类嫩化功能的适冷胶原蛋白酶的报道，也没有商品化的适冷肉类胶原蛋白酶。

公开号为：CN101045933A(申请号：200710013366.2)的中国专利申请公开了一种适冷蛋白酶的基因MCP01及其制备方法，属于生物技术领域。该发明含有深海适冷蛋白酶基因MCP01的2676BP基因组DNA片段，其中含有一个具有2508个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架即是编码蛋白酶MCP-01的基因，由蛋白酶MCP-01的基因MCP01表达的适冷蛋白酶最适酶活温度为35℃左右，最适PH为9.0，可用于低温肉的保鲜、增鲜，乳制品的加工、洗涤剂等行业。但该申请只提到适冷蛋白酶MCP-01具有保鲜、增鲜的作用，并没有提及其在低温肉类嫩化方面的作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供适冷蛋白酶MCP-01在肉类嫩化中的应用。该适冷蛋白酶MCP-01能在肉类保鲜冷藏过程中或常温下对肉类进行嫩化，改善肉类的口感。

适冷蛋白酶MCP-01在肉制品嫩化中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)将适冷蛋白酶MCP-01配制成浓度为5～20μg/ml的适冷蛋白酶MCP-01溶液；

(2)将待嫩化的肉洗净后，浸入步骤(1)制得的适冷蛋白酶MCP-01溶液中，0～8℃保藏18～30小时。

所述步骤(1)的适冷蛋白酶MCP-01溶液浓度为10～15μg/ml。

所述步骤(2)中在0～4℃保藏20～25小时。

上述保藏温度为4℃。

所述步骤(2)中的肉为含有胶原蛋白的各种供人食用的动物组织。

上述适冷蛋白酶MCP-01的制备可通过如下菌株制得：

深海适冷菌假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas)SM9913，2010年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学。菌种保藏号CCTCC NO：M2010336。

上述适冷蛋白酶MCP-01可利用上述菌株通过如下方法制得：

取深海适冷菌假交替单胞菌株SM9913经种子培养后接种于液体发酵培养基中，10～15℃震荡培养55～70小时，初次离心后，上清液加入硫酸铵粉末至终浓度为50～55wt％，二次离心后，沉淀溶于Tris-HCl中，三次离心后，取上清液，2～8℃下聚乙二醇20000超滤浓缩，浓缩液在2～8℃下经柱层析分离，回收酶活峰的峰尖部分，即得适冷蛋白酶MCP-01。

所述种子培养为在固体培养基中12～15℃培养48～70小时后；再于液体培养基中12～15℃震荡培养20～30小时；固体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份琼脂，人工海水100份，pH为7.0～7.2；

液体培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份琼脂，人工海水100份，pH为7.0～7.2。

所述初次离心条件为：10000g，2～8℃离心15分钟；二次离心条件为：8000g，2～8℃离心10分钟；三次离心条件为：10000g，2～8℃离心20分钟。

所述Tris-HCl的浓度为20mmol/l，pH 8.5；所述层析柱为Sephardex G100层析柱。

所述液体发酵培养基组分如下，均为重量份：

豆饼粉3.5～4.0份、玉米粉2.0～2.5份、麸皮2.0～2.5份、Na₂HPO₄0.3～0.4份、KH₂P040.04～0.05份、水100份。

本发明的优良效果在于：

(1)本发明所述适冷蛋白酶MCP-01在0℃时仍能保持最适温度下酶活力的12.5％，在低温冷藏条件下(0-4℃)以及室温下能够提高肉制品的嫩度；该蛋白酶可在0～4℃下特异性降解肉类结缔组织中的胶原蛋白，在肉类嫩化过程中具有很好的应用潜力。

(2)适冷蛋白酶MCP-01的热稳定性较差，在中高温条件下很容易失活，从而使酶在完成嫩化后容易被灭活；该酶随着温度的提高，自溶速度增加，从而当肉类烹制加工后，该酶会完全失活，因而不会造成对肉类的污染。

(3)适冷蛋白酶MCP-01能较好的保持肉制品的新鲜色泽和持水性。

附图说明

图1、纯化的适冷蛋白酶MCP-01的毛细管电泳检测图；

图2、温度对适冷蛋白酶MCP-01降解牛肌腱不可溶胶原蛋白活力的影响；

图3、适冷蛋白酶MCP-01处理对牛胸肌剪切力的影响的柱状图；

图4、不同的嫩化酶处理对牛胸肌失水率的影响的柱状图；

其中：对照、未添加任何蛋白酶；MCP-01、添加适冷蛋白酶MCP-01；Bromelain、添加菠萝蛋白酶；Papain、添加木瓜蛋白酶；

图5、不同的嫩化酶处理对牛胸肌色泽影响的照片；

其中：Control、未添加任何蛋白酶；MCP-01、添加适冷蛋白酶MCP-01；Bromelain、添加菠萝蛋白酶；Papain、添加木瓜蛋白酶。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例中所述深海适冷菌假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas)SM9913，2010年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国.武汉.武汉大学，菌种保藏号CCTCC NO：M2010336。

人工海水素购自中国海洋大学海水素厂，弹性蛋白购自Sigma公司，鱼不可溶胶原蛋白为采用Song等的方法(Song，E.，Kim，S.Y.，Chun，T.，Byun，H.-J.，and Lee，Y.M.(2006)Biomaterials 27，2951-2961)从鱼皮中提取，牛肌腱不可溶胶原蛋白购自WorthingtonBiochemical Co.，牛酸溶I型胶原蛋白购自Sigma公司，牛II型胶原蛋白购自Sigma公司，牛IV型胶原蛋白购自Sigma公司。

实施例1

深海适冷菌假交替单胞菌株SM9913制备适冷蛋白酶MCP-01的方法，步骤如下：

1.液体种子的制备

以蛋白胨1份，酵母粉0.5份、1.5份琼脂，人工海水100份，pH为7.0～7.2，(均为重量份)配制固体培养基。培养基灭菌，冷却后，在试管斜面上划线接种深海适冷菌假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas)SM9913，12～15℃培养48～70小时。将上述菌种接种装有150ml液体培养基的500ml三角瓶中(配方同固体培养基，不添加琼脂)，12～15℃，200转震荡培养24小时，用作液体种子。

2.液体深层发酵制备适冷蛋白酶制剂

以豆饼粉3.5～4.0份、玉米粉2.0～2.5份、麸皮2.0～2.5份、Na₂HPO₄0.3～0.4份、KH₂PO₄0.04～0.05份和水100份，均为重量份，配制液体发酵培养基。培养基灭菌，按5～7％重量百分比接种步骤1制备的液体种子，通风、搅拌、控制转速200rpm，15℃培养60小时。

3.适冷蛋白酶MCP-01的分离纯化

将上述发酵产酶培养基4℃，10,000g离心15分钟，上清液在冰浴中缓慢搅拌加入硫酸铵粉末至终浓度为55wt％，8000g离心10分钟。沉淀溶于pH 8.5，20mmol/l Tris-HCl中，于4℃，10000g离心20分钟，取上清液，装于超滤袋，4℃下用聚乙二醇20000浓缩，浓缩液经Sephardex G100柱层析分离，回收酶活峰的峰尖部分。所有的操作均在15℃以下进行。分离的蛋白酶用毛细管电泳检测纯度(如图1)，命名为适冷蛋白酶MCP-01。

4.适冷蛋白酶MCP-01的性质测定

4.1底物特异性

(1)Bradford法测定步骤3制备的适冷蛋白酶MCP-01的蛋白浓度。(Bradford法为本领域惯用技术，也可参考如下网址中的资料http://wenku.baidu.com/view/7b3eb1d4195f312b3169a521.html)。

(2)测定酶对不可溶胶原蛋白的降解效率，不可溶胶原蛋白包括鱼不可溶胶原蛋白和牛肌腱不可溶胶原蛋白。酶活单位定义为每小时降解底物产生1nmol的L-亮氨酸所需要的酶量。具体步骤为：称取5mg的不可溶胶原蛋白，加入1ml浓度为10μg/ml的MCP-01酶液，置于40℃水浴中反应5h。反应中不断晃动反应液，以保证不可溶底物与酶液的充分接触。

(3)测定酶对可溶性底物降解效率，酶活单位定义为每分钟降解底物产生1nmol的L-亮氨酸所需要的酶量。具体步骤为：用50mM Tris-HCl(含0.36mM CaCl₂，pH 7.5)配制不同的可溶底物溶液，包括牛酸溶I型胶原蛋白、牛II型胶原蛋白、牛IV型胶原蛋白，置于40℃水浴中反应30min。

(4)上述步骤(2)(3)反应结束后，10,000g离心10min。取上清20μl加入100μl茚三酮-柠檬酸钠溶液，沸水浴20min显色，冷却后加入500μl正丙醇，于600nm处测定吸光值。

(5)测定酶对弹性蛋白底物的降解效率，称取5mg的弹性蛋白加入250μl浓度为10μg/ml的MCP-01酶液，置于40℃水浴中反应60分钟，10,000g离心10min终止反应；取上清于595nm处测定吸光值。

(6)结果表明适冷蛋白酶MCP-01能够特异性降解各种类型胶原蛋白，而对弹性蛋白没有降解作用(结果如表1所示)。

4.2最适酶活温度测定

以牛肌腱不可溶胶原蛋白为底物，50mM Tris-HCl(含0.36mM CaCl₂，pH 7.5)为缓冲体系，分别在0、10、20、30、40、50、55、60、70、80℃条件下测定胶原蛋白酶MCP-01的酶活，以确定酶的最适反应温度。测定酶活的具体方法为：

称取5mg的牛肌腱不可溶胶原蛋白，加入1ml浓度为10μg/ml的适冷蛋白酶MCP-01酶液，不同温度下反应5小时，10,000g离心10min。取上清20μl加入100μl茚三酮-柠檬酸钠溶液，沸水浴20min显色，冷却后加入500μl正丙醇，于600nm处测定吸光值，定义最高酶活温度下的酶活力为100％。结果表明该酶的最适酶活温度60℃，在0℃下仍保持了12.4％的相对活性，在70℃酶活力显著下降如图2所示。

实施例2

适冷蛋白酶MCP-01在肉制品嫩化中的应用，步骤如下：

(I)将步骤3制得的适冷蛋白酶MCP-01配制成浓度为10μg/ml和100μg/ml的适冷蛋白酶MCP-01溶液；

(II)将牛胸肌肉洗净后，浸入步骤(I)制得的适冷蛋白酶MCP-01溶液中，4℃保藏20小时。

结果表明添加适冷蛋白酶MCP-01在4℃下作用20小时的牛胸肌肉剪切力显著下降，而未添加适冷蛋白酶的对照组牛胸肌肉剪切力下降不明显。(如图3)。

牛胸肌肉分别与用相同浓度的菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶在4℃下处理20小时，然后测定失水率。定义失水率为：

与商品化应用的木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对比可知，肉制品的持水性更好，色泽也更新鲜，结果如图4，图5所示。

本发明所述的适冷蛋白酶MCP-01，可以嫩化各种新鲜或冷藏储存的动物身上各部位可供食用的含有胶原蛋白的肉类组织。

结果分析

从一株深海适冷菌假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas sp.SM9913)分离得到的适冷蛋白酶MCP-01，分子量约60kDa(图1)，具有很高的胶原蛋白降解活性，能特异性降解各种可溶和不可溶的胶原蛋白(表1)。通过测定MCP-01降解胶原蛋白的最适温度(图2)表明适冷蛋白酶MCP-01是一个适冷胶原蛋白酶，在低温下具有很高的胶原蛋白活性，高温下不稳定。我们研究了MCP-01对肉制品的嫩化能力和嫩化机制，并与目前商品化的木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行了比较。结果表明，适冷蛋白酶MCP-01在4℃下能显著降低肉类剪切力(图3)，与木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶相比，并能较好的保持肉制品的新鲜色泽及含水量(图4，图5)。这些结果表明，MCP-01有可能开发成一种新型适冷肉类嫩化酶，用于肉制品的低温嫩化，在肉制品低温嫩化中具有应用价值。

表1MCP-01对不同胶原蛋白底物的催化降解效率