在DNA水平鉴定绞股蓝并与乌蔹莓区别的方法

摘要

本发明公开了一种在DNA水平鉴定绞股蓝并与乌蔹莓区别的方法，其特征在于：利用药用植物葫芦科绞股蓝DNA特征性片段SCAR标记克隆测序的结果，设计绞股蓝SCAR标记的特异引物对WJS-T

说明书

技术领域

本发明涉及一种在DNA水平鉴定绞股蓝并与乌蔹莓区别的方法。

背景技术

我国有丰富的药用植物资源，因其种类繁多，各地同名异物或同物异名现象普遍存在；同一品种道地药材与非道地药材，在形态、组织构造等特征的差别不十分明显，但质量有时差异很大，很难识别。即便同一品种，产地不同时其有效成分含量也可能存在差异。在中草药销售中因利益驱动而掺杂使假的情况时有发生，因此中草药的品种及质量鉴定显得尤为重要。

中草药材传统的鉴定方法主要是性状和/或组织显微鉴别，有些根据中草药的有效成分发展了薄层色(光)谱、电泳法、X射线衍射法等。这些方法各有优缺点及其局限性。随着分子遗传标记技术在药用植物学研究领域的渗透及应用，越来越多的植物类药材开始尝试分子水平的遗传分析鉴定。由于植物物种的遗传组成不会随其实物形态、生理及外部条件而变化，是更客观、更可靠的识别标记，能更好地提供中草药的植物基源特征。以PCR为基础的DNA分子标记技术，如low-Cot DNA fingerprinting，RAPD，AP-PCR，PCR-RFLLP，Amplified DNA RFLP等，在中草药材真伪鉴别中发挥了重要的作用。这不仅能对药用植物基源进行遗传特征分析，而且能够逐步积累这些药用植物的遗传分子信息，有利于保护优势物种资源。如著名中药人参(Panax ginseng)与西洋参(Panax quinquefolius)可用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)及DAMD(Directed Amplification of Minisatellite Region DNA)加以鉴别；RAPD也用于区别不同产地来源的黄芪，如韩国黄芪或中国黄芪；用于车前子、积雪草等药用植物基源的聚类及特征分析。国外这方面的研究进展非常快速，已有多项专利。目前，尚未见有关于绞股蓝DNA分子鉴定的方法。

rDNA是编码核糖体rRNA的基因，在植物中以重复连续排列方式存在，包含进化速率不等的编码区、非编码转录区。进化上较保守的18S、5S rRNA已被用于各种真核生物的亲缘关系研究。18S rRNA基因为高度重复序列，约800～10000拷贝，以连续排列方式存在于细胞内。同时18S rRNA基因序列结构、功能十分保守，进化速率较慢，若它们的序列存在变异就能成为一种很好的DNA标记。18S rRNA基因的保守性为进行中草药材的基因鉴定和真伪鉴定打下了良好的分子基础。目前，18S rRNA基因测序技术已被用于人参、三七、山药、大黄、姜黄等的基源鉴别。根据我们查询的已在GenBank中登录的一些植物或苔藓类18S rRNA序列所做的聚类分析，结果表明18S rRNA在同科属植物中进化速率较慢，但在不同科属植物类群中有较大差别，或可作为药用植物分类鉴定的一个很好标记。

绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thrunb.)Mak)为葫芦科绞股蓝属植物。我国绞股蓝资源非常丰富。绞股蓝主要有效成分为皂苷，目前已分离的绞股蓝皂苷有80多种，均为四环三萜达玛烷型，有6种皂苷与人参皂苷结构相同，还有一些经水解可得到人参皂苷。绞股蓝是五加科以外为数不多的含人参皂苷的植物。目前对绞股蓝皂苷的药理作用机制也有了较多研究报道。一些研究发现绞股蓝皂苷可减弱宫颈癌细胞中氨基芴-DNA加合物的形成，抑制人宫颈癌乙酰氨基转移酶的表达；绞股蓝皂苷还能通过抑制iNOS(诱导型一氧化氮合酶)活性及减弱NF-κB介导的iNOS蛋白表达来抑制一氧化氮的合成，作为其发挥治疗作用的机制之一；用绞股蓝皂苷处理人肝癌细胞，能通过上调Bax和Bak、下调Bcl-2、释放线粒体细胞色素C、激活级联反应来诱导细胞凋亡；绞股蓝皂苷还能保护大鼠脑部缺血再灌注区损伤的神经元；可通过改变肝葡萄糖代谢酶活性来降低血糖浓度等等。目前医药市场上对绞股蓝皂苷的需求量也越来越高。

绞股蓝在长期的自然环境及人工栽培的条件下，逐渐形成了众多品种及栽培类型。根据其鸟足状复叶小叶片数目分，有七叶或五叶绞股蓝；根据其叶片味道分有甜味或苦味绞股蓝。绞股蓝遗传多样性复杂，植物表型及皂苷种类、含量均有一定区别。我们的研究结果表明，七叶绞股蓝叶片的三萜皂苷含量为6.78％，五叶绞股蓝叶片的三萜皂苷含量只有3.69％；绞股蓝叶片的三萜皂苷含量为4.72％，而其茎的含量只有1.85％，广西南部产五叶绞股蓝叶片的三萜皂苷含量为4.1％，而其广西北部产五叶绞股蓝的三萜皂苷含量为3.6％。另外，绞股蓝药材中还存在一些其他植物的混淆品，如葡萄科的乌蔹莓(Cayratia japonica(Thunb.)Gagnep.)等。因此，对绞股蓝进行遗传多样性分析及分子生物学鉴定，对优选皂苷含量高的绞股蓝品种、解决绞股蓝伪品的问题是很有意义的。

发明内容

本发明的目的：为了克服药用植物葫芦科绞股蓝的传统鉴定主要是以性状或/和组织显微鉴别等方法的局限性和复杂性的技术不足，针对葫芦科绞股蓝DNA序列特异性，建立一个更为客观和易行的在DNA水平鉴定葫芦科绞股蓝并与其形态上易混淆的葡萄科乌蔹莓区别的方法。

本发明是这样实现的：

一种在DNA水平鉴定绞股蓝并与乌蔹莓区别的方法，其特征在于：利用药用植物葫芦科绞股蓝DNA特征性片段SCAR标记克隆测序的结果，设计葫芦科绞股蓝SCAR标记的特异引物对，结合葫芦科绞股蓝和葡萄科乌蔹莓植物各自的18S rRNA基因保守区设计引物对做为内参，分别组合成PCR复合体系1和PCR复合体系2进行扩增，对扩增产物进行电泳分析，从而对药用植物葫芦科绞股蓝进行DNA水平鉴定，并与形态上易与绞股蓝混淆的葡萄科乌蔹莓相区别。

以上所述的PCR复合体系1，包含扩增葫芦科绞股蓝SCAR标记359bp片段的引物对WJS-T₁和WJS-T₂，扩增葫芦科绞股蓝18S rRNA 293bp片段的内参引物对WHL-18S-C₁和WHL-18S-C₂，应用降落PCR程序扩增葫芦科绞股蓝DNA，得到两条葫芦科绞股蓝的359bp和293bp区带，建立的过程如下：

(1)采用生物信息分析方法，筛选出19条10mer RAPD随机引物，建立RAPD分析体系，找出葫芦科绞股蓝共有的SCAR分子标记J-750；采用筛选出来的19条随机引物，见附表1，进行PCR扩增，分析葫芦科绞股蓝鲜样品(实验用鲜样品来源，见附表2)和干燥样品(实验用干燥样品来源，见附表3)的DNA多态性差异。其中，采用10号引物扩增8份广西境内不同产地来源的葫芦科绞股蓝DNA均出现共有扩增带，长度约为750bp，见附图4。对17份干燥葫芦科绞股蓝药材的DNA样品，也扩增到此特征条带，可做为绞股蓝的一个分子标记，记为J-750，见附图5和附图6。采用分子克隆的方法，分别进行克隆测序，获得8条长度在766～770bp的DNA序列。对获得8份不同来源的葫芦科绞股蓝部分特征DNA序列，长度在766～770bp范围，经采用NCBI的Blast软件分析，获得8份不同来源的葫芦科绞股蓝J-750均为一段新克隆的尚未在NCBI登录的植物DNA序列；对所获得的8份不同来源的葫芦科绞股蓝分子标记J-750的克隆序列，使用Vector NTI软件分析测序结果。结果表明，上述8条序列的一致性在97.4％～99.9％之间，具有高度一致性，见附表4。经酶切位点分析，8条序列均含有11种内切酶的酶切位点，其中序列J1-750、J6-750有一个SspI酶切位点，J3-750、J4-750、J5-750、J7-750、J8-750有二个SspI酶切位点，J2-750有三个SspI酶切位点，其他10种内切酶在8条序列的酶切位点均为单一酶切位点，见附表5。

8份不同来源绞股蓝经10号引物扩增出来的绞股蓝分子标记J-750DNA片段已克隆测序，已在GenBank中登录，并已获登录号，见附表6及核苷酸序列表，但尚未公开。

运用NCBI基因数据库中的Blast程序对葫芦科绞股蓝特征条带进行同源比对分析，结果显示8条序列与GenBank中99个来自其他物种的基因序列有部分相似性，但相似位点片段仅在40-90bp之间，整体同源性小，见附图7～14。说明本发明中的8条葫芦科绞股蓝DNA序列为新序列。

(3)利用Oligo 6软件针对本发明获得的绞股蓝SCAR分子标记J-750设计特异引物对WJS-T₁和WJS-T₂，建立PCR体系扩增葫芦科绞股蓝DNA，扩增得到长度为359bp的特异区带；

附表1：RAPD分析用的19条10mer随机引物序列一览表

附表2：实验用鲜样品来源一览表

(4)根据葫芦科绞股蓝18S rRNA基因保守区设计引物对WHL-18S-C₁和WHL-18S-C₂，建立PCR体系扩增葫芦科绞股蓝DNA，扩增得到一段长度为293bp的葫芦科绞股蓝18S rRNA基因保守区共有带；

(5)将葫芦科绞股蓝SCAR分子标记引物对WJS-T₁和WJS-T₂与18S rRNA基因保守区引物对WHL-18S-C₁和WHL-18S-C₂组合，建立PCR复合反应体系1，采用降落PCR程序扩增葫芦科绞股蓝DNA模板，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析得到两条区带，其中1条为359bp的葫芦科绞股蓝SCAR特异带，另1条为293bp的葫芦科绞股蓝18S rRNA基因区保守带。

附表3：实验用干燥样品来源一览表

附表4：8条不同来源绞股蓝分子标记J-750DNA序列一致性比较一览表

附表5：8条不同来源绞股蓝分子标记J-750DNA序列限制性内切酶酶切位点分析一览表

附表6：8份不同来源绞股蓝分子标记J-750已克隆测序DNA序列一览表

以上所述的PCR复合体系2，包含扩增葫芦科绞股蓝SCAR标记359bp片段的引物对WJS-T₁和WJS-T₂，扩增葡萄科乌蔹莓的18S rRNA 177bp片段的内参引物对WPT-18S-C₁和WPT-18S-C₂，应用降落PCR程序扩增葡萄科乌蔹莓DNA，得到1条葡萄科乌蔹莓的18S rRNA 177bp区带，建立的过程如下：

(1)根据葡萄科乌蔹莓18S rRNA基因保守区设计引物对WPT-18S-C₁和WPT-18S-C₂，建立PCR体系扩增葡萄科乌蔹莓DNA，得到一段长度为177bp的葡萄科乌蔹莓18S rRNA基因保守区共有带；

(2)将葡萄科乌蔹莓18S rRNA基因保守区引物对WPT-18S-C₁和WPT-18S-C₂，与葫芦科绞股蓝SCAR分子标记特异引物对WJS-T₁和WJS-T₂组合成PCR复合反应体系2，采用降落PCR程序对葡萄科乌蔹莓DNA模板进行扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到1条177bp的葡萄科乌蔹莓18S rRNA基因保守区带，无葫芦科绞股蓝SCAR片段359bp区带。

本发明中，采用PCR复合体系1或2，扩增鉴定葫芦科绞股蓝，并与葡萄科乌蔹莓区别的信息一览表见附表7：

附表7：PCR复合体系1或2扩增绞股蓝或乌蔹莓DNA模板信息一览表

本发明中，扩增绞股蓝SCAR标记的特异引物对WJS-T₁和WJS-T₂序列，绞股蓝18S rRNA基因内参引物对WHL-18S-C₁和WHL-18S-C₂序列，葡萄科18S rRNA基因内参引物对WPT-18S-C₁和WPT-18S-C₂序列见附表8。

附表8：PCR复合体系1和2所用的引物序列一览表

本发明建立了在DNA水平鉴定绞股蓝并与乌蔹莓区别的方法，在鉴定葫芦科绞股蓝并与植物形态上易与葫芦科绞股蓝相混淆的葡萄科乌蔹莓区别中应用，结果见附图1～3。

本发明的优点及其效果：

1、本发明方法利用葫芦科绞股蓝DNA序列特异性，将扩增葫芦科绞股蓝SCAR标记的特异引物对WJS-T₁和WJS-T₂，葫芦科绞股蓝18S rRNA基因内参引物对WHL-18S-C₁和WHL-18S-C₂组成PCR复合反应体系1，采用降落PCR扩增程序，对葫芦科绞股蓝DNA可扩增出359bp、293bp两条带，而葡萄科乌蔹莓无此两条带；将扩增葫芦科绞股蓝SCAR标记的特异引物对WJS-T₁和WJS-T₂、葡萄科乌蔹莓18S rRNA基因内参引物对WPT-18S-C₁和WPT-18S-C₂组合成PCR复合反应体系2，采用降落PCR扩增程序，对葡萄科乌蔹莓DNA可扩增出一条177bp带，而葫芦科绞股蓝无此177bp带，从而对药用植物葫芦科绞股蓝进行DNA水平鉴定并与形态上易与绞股蓝混淆的葡萄科乌蔹莓相区别。

2、本发明方法克服了药用植物葫芦科绞股蓝的传统鉴定主要是以性状或/和组织显微鉴别等方法的局限性和复杂性的技术不足，针对葫芦科绞股蓝DNA序列特异性，建立一个更为客观和易行的鉴定葫芦科绞股蓝并与其形态上易混淆的葡萄科乌蔹莓区别的方法。

附图说明

图1为葫芦科绞股蓝新鲜样品(J1～J8)和葡萄科乌蔹莓新鲜品DNA，PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2为葫芦科绞股蓝干燥样品(JG1～JG8)和葡萄科乌蔹莓干燥样品DNA，PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图3为葫芦科绞股蓝干燥样品(JG10～JG17)和葡萄科乌蔹莓干燥样品DNA，PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4为10号随机引物对8份绞股蓝鲜品J1～J8的DNA进行RAPD扩增后，产物的电泳泳图；

图5为10号随机引物对绞股蓝干燥品JG1～JG8DNA进行RAPD扩增后，其产物的电泳图；

图6为10号随机引物对绞股蓝干燥品JG9～JG17DNA进行RAPD扩增后，其产物的电泳图；

图7为序列J1-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图；

图8为序列J2-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图；

图9为序列J3-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图；

图11为序列J4-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图；

图10为序列J5-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图；

图12为序列J6-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图；

图13为序列J7-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图；

图14为序列J8-750与GenBank中已知DNA序列比对得到的相似片段分布图。

具体实施例

实施例

1.提取DNA：

采用本发明人改良的CTAB法分别提取葫芦科绞股蓝和葡萄科乌蔹莓DNA。

(1)葫芦科绞股蓝新鲜样品DNA提取

①称取0.5g叶片置于预冷的研钵中，加入液氮研磨成细粉，迅速转移至7ml离心管中，加入3ml预热的1.5×CTAB提取缓冲液，混匀，65℃水浴中保温20min。

②将①步提取液冷却至室温，7500rpm离心10min。取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)进行抽提，混匀，7500rpm离心10min。

③取②步离心上清，加入1/10体积的1×CTAB提取缓冲液和等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，混匀，7500rpm离心10min。

④取③步离心上清，加入等体积的1×CTAB沉淀缓冲液，轻缓颠倒至形成絮状沉淀。若无明显沉淀析出，则于65℃水浴中保温30min，7500rpm离心10min。

⑤将④步离心沉淀物用0.5mlNaCl(1mol/L)溶解，离心除去不溶物。DNA溶液中加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，于-20℃冰箱中静置15min，8000rpm离心10min。

⑥将⑤步离心沉淀物用1ml70％乙醇洗涤两次，于通风厨中自然挥干后用100～200μl灭菌三蒸水充分溶解后作为DNA样品贮备液，于-20℃下保存备用。

(2)葡萄科乌蔹莓新鲜样品DNA提取

在以上提取方法的基础上加以改进。改进之处主要是对样品进行预处理：样品加入10％PVP粉末(W/W)在液氮中共同研磨；磨碎后的粉末平均分成两份迅速转移至7ml离心管中，每管加入3ml冰预冷的不含CTAB的清洗缓冲液清洗，并加入2％β-巯基乙醇，充分混匀，7500rpm离心10min，弃掉上层液体，此步骤重复1～2次。在用清洗缓冲液处理过的粉末中加入1.5ml预热的1.5×CTAB提取缓冲液，30μlβ-巯基乙醇(终浓度为2％)，上下颠倒混匀后再在65℃水浴中保温20min。离心后将两管的上层提取液合并成一管，再用等体积的氯仿异戊醇进行抽提。接下来的步骤同葫芦科绞股蓝新鲜样品DNA提取。

2.RAPD扩增体系：

PCR反应体系含10×Buffer2.5μl，25mmol/L Mg²⁺2μl，10μM 10碱基随机引物各1μl，ExTaqDNA聚合酶1U，模板DNA60ng左右。RAPD-PCR扩增程序为：94℃预变性3min，然后按94℃变性50s，37℃退火50s，72℃延伸120s，进行40个循环，最后72℃延伸10min，产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见附图4～6。

3.葫芦科绞股蓝J-750SCAR标记DNA条带的克隆及测序：

分别采用附表1的8份新鲜不同来源的葫芦科绞股蓝提取的DNA为模板，用10号引物扩增得到约750bp的DNA片段。用胶回收试剂盒回收纯化，将纯化后的DNA片段与pMD18-TVector载体连接，转化JM109感受态细胞，通过蓝白筛选得到阳性重组体，用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。将阳性克隆送测序公司测序，结果见附表6。

4.DNA序列分析：

使用VectorNTI软件分析测序结果。8个不同来源的绞股蓝序列一致性结果见附表4；序列中的限制性酶切位点见附表5。运用NCBI基因数据库中的Blast程序对葫芦科绞股蓝特征条带进行同源性比对，结果见附图7～14。

5.葫芦科绞股蓝DNA水平鉴定，与乌蔹莓区别：

(1)按附表9的组成，分别制备PCR复合体系1和PCR复合体系2。

附表9：PCR复合体系1和PCR复合体系2的组成表

(2)按附表10的条件采用降落PCR反应程序进行PCR扩增。

附表10：PCR扩增条件表

PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果见附图1、附图2和附图3。

注：8份不同来源绞股蓝分子标记J-750已克隆测序DNA序列见序列表