面粉违禁添加剂过氧化苯甲酰快速检测试剂盒及制备方法

摘要

本发明公开了面粉违禁添加剂过氧化苯甲酰快速检测试剂盒及制备方法，该试剂盒由反应试剂、显色剂、阳性对照试剂储备液和标准比色卡组成；反应试剂是浓度100mg/L至300mg/L的亚铁离子酸性水溶液；显色剂是浓度0.5mol/L至0.75mol/L的硫氰酸根水溶液；阳性对照试剂储备液是浓度500mg/L至1500mg/L的过氧化苯甲酰乙醇溶液；标准比色卡包括若干小色块，每个色块对应过氧化苯甲酰浓度。本发明将待测样品按照试剂盒操作方法显色后，对照标准比色卡直接进行定性和半定量分析，整个样品分析过程不需要借助大型分析仪器，简化了操作过程，缩短了分析时间。

说明书

技术领域

本发明涉及快速检测试剂盒及制备方法，具体涉及面粉违禁添加剂过氧化苯甲酰快速检测试剂盒及制备方法。

背景技术

过氧化苯甲酰(Benzoyl Peroxide，BPO)，化学式[C₆H₅C(O)O]₂，是一种有机过氧化物，其对面粉有显著增白作用。1986年，全国食品添加剂标准化技术委员会安全评审通过，将过氧化苯甲酰列入我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760），允许作为面粉处理剂、漂白剂在小麦粉加工中使用，最大使用限量为60mg/kg。但由于过氧化苯甲酰破坏面粉的营养成份，尤其是对面粉中β-胡萝卜素和V_E有较强的破坏作用。过氧化苯甲酰氧化产物苯甲酸的摄入加重了肝脏负担，易引发多种疾病。此外，现有面粉加工工艺很难将过氧化苯甲酰添加均匀，极容易造成过氧化苯甲酰含量局部超标。2011年2月，卫生部等七部门联合发文，自2011年5月1日起，禁止在面粉生产中添加过氧化苯甲酰。

关于面粉中过氧化苯甲酰含量的检测，国标方法为气相色谱法（GB 18415-2001）和高效液相色谱法（GB22325-2008）。该两种方法检出限低、准确度高、重现性好。但这两种方法操作繁琐，耗时长，需要价格昂贵的气相色谱仪或液相色谱仪，不适宜用于面粉中过氧化苯甲酰快速检测和现场分析。

过氧化苯甲酰检测方法在期刊文献中报道较多，主要分为化学定性法、氧化还原滴定法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法、电化学方法和化学发光法。化学定性法和氧化还原滴定法存在的主要缺点是灵敏度和准确度较低。而分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法、电化学方法和化学发光法虽然灵敏度和准确度有所提高，但这些方法存在的共性缺点是样品前处理复杂，样品分析时间长，需要价格昂贵的分析仪器。

过氧化苯甲酰检测方法在专利文献中已有一些报道。中国专利公开号 1776409A，公开了一种检测面粉中过氧化苯甲酰含量的方法，检测原理是利用过氧化苯甲酰能使邻菲啰啉与硫酸亚铁生成的橙红色络合物褪色，其褪色程度与过氧化苯甲酰浓度有相关性。中国专利公开号 101042354A，公开了一种商品小麦粉中过氧化苯甲酰定量分析方法，检测原理是通过色度学原理，利用随着过氧化苯甲酰添加时间的延长，过氧化苯甲酰发挥增白作用，小麦粉中的呈色物质减少，以乙醇浸泡小麦粉所得溶液的颜色变浅，其褪色程度与小麦粉中原始过氧化苯甲酰添加量有相关性。然而上述两种方法需要图像采集器，并需要基于计算机色度识别的过氧化苯甲酰含量测定软件系统，且褪色程度与过氧化苯甲酰浓度相关性不强，检测准确度不高。中国专利公开号 101210907A，公开了一种小麦粉中过氧化苯甲酰的高效液相色谱检测法，该方法检测灵敏度和准确度较高，然而该方法需要对样品进行复杂的前处理操作，样品分析时间较长，需要价格昂贵的高效液相色谱仪。中国专利公开号 101339136A，公开了一种测定过氧化苯甲酰的化学发光体系及方法，检测原理是利用过氧化苯甲酰与鲁米诺反应产生波长为425nm的光辐射，该方法检出限低，灵敏度高，然而该方法需要化学发光仪，反应过程需要二价钴离子作为催化物质，操作步骤复杂。

发明内容

本发明的目的是：提供一种面粉违禁添加剂过氧化苯甲酰快速检测试剂盒及其制备方法，采用该试剂盒检测过氧化苯甲酰，简单、快速、准确，不需要大型仪器设备，适合现场定性判断和半定量测量，防止过氧化苯甲酰在面粉中的违禁添加，提高面粉质量和保证食品安全。

本发明的技术解决方案是：该过氧化苯甲酰快速检测试剂盒由反应试剂、显色剂、阳性对照试剂储备液和标准比色卡组成。

快速检测试剂盒的制备方法是：所述的反应试剂是亚铁离子的酸性水溶液，亚铁离子的浓度在100 mg/L至300 mg/L，亚铁离子由氯化亚铁、或硫酸亚铁铵、或硫酸亚铁提供，反应试剂的酸性由盐酸或硫酸提供并保持，反应试剂包装在深色或不透光的容器中，用手挤压容器可以逐滴挤出反应试剂；所述的显色剂是硫氰酸根水溶液，硫氰酸根由硫氰酸铵、或硫氰酸钾、或硫氰酸钠提供，硫氰酸根的浓度在0.5 mol/L至0.75 mol/L，反应试剂包装在容器中，容器不限于深色或不透光的容器，用手挤压容器可以逐滴挤出显色剂；所述的阳性对照试剂储备液是过氧化苯甲酰无水乙醇溶液，过氧化苯甲酰的浓度在500 mg/L至1500 mg/L，阳性对照试剂储备液包装在深色或不透光的容器中；所述的标准比色卡包括若干长方形色块，每一个色块代表相应的过氧化苯甲酰浓度。

其中，标准比色卡的制作过程是：配系列不同浓度的过氧化苯甲酰标准溶液，向各个过氧化苯甲酰标准溶液中依次加入一定量的反应试剂和显色剂，发生显色反应，根据反应后颜色的深浅对应过氧化苯甲酰标准溶液浓度，制成标准比色卡。

本发明具有以下优点：

1、试剂盒利用过氧化苯甲酰的强氧化性，将反应试剂中的亚铁离子氧化成三价铁离子，三价铁离子再在酸性溶液中与显色剂中的硫氰酸根发生显色反应，生成橙红色硫氰酸铁配合物，橙红色配合物颜色的深浅与过氧化苯甲酰含量呈相关性，试剂盒显色反应灵敏、反应条件温和、反应速度快、抗干扰能力强、测定结果准确。

2、试剂盒内包含一张标准比色卡，过氧化苯甲酰待测样品溶液按照试剂盒操作方法显色后，对照该标准比色卡，不需要借助大型分析仪器，不需要操作者配制过氧化苯甲酰标准溶液，直接对待测样品进行定性判断和半定量分析，简化了操作过程，缩短了分析时间，用于现场定性判断待测面粉是否添加了违禁添加剂过氧化苯甲酰和现场半定量检测面粉中过氧化苯甲酰含量，是定性判断、快速检测、现场分析的有效手段。

3、试剂盒内的反应试剂和显色剂中各化合物的浓度经过精确计算，对照试剂盒使用方法，操作者进行反应试剂和显色剂移取操作时，不需要借助相关液体移取设备，只需要滴加一滴即可，适合现场定性判断和半定量测量面粉中的过氧化苯甲酰。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术解决方案作进一步描述。

实施例1：试剂盒制备

1. 制备反应试剂：准确称取0.140 g六水合硫酸亚铁铵((NH₄)₂Fe(SO₄)₂×6H₂O)于100 ml容量瓶中，加水溶解，再加入10 mol/L的盐酸溶液2 ml，用水稀释至刻度，即为反应试剂；将反应试剂包装在深色或不透光的容器中，用手挤压容器可以逐滴挤出反应试剂；

2. 制备显色剂：准确称取6.074 g硫氰酸钾（KSCN）于100 ml容量瓶中，加水溶解，再用水稀释至刻度，即为显色剂；将显色剂包装在容器中，容器可以是但不限于深色或不透光的容器，用手挤压容器可以逐滴挤出显色剂；

3. 制备阳性对照试剂储备液：准确称取0.1 g过氧化苯甲酰于100 ml容量瓶中，加无水乙醇溶解，再用无水乙醇稀释至刻度，即为阳性对照试剂储备液；将阳性对照试剂储备液包装在深色或不透光的容器中；

4. 制备标准比色卡：用无水乙醇分别配制浓度为0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的过氧化苯甲酰标准溶液，取15支规格为10 ml的比色管，在各比色管中分别加入上述过氧化苯甲酰标准溶液1 ml、反应试剂一滴（约40 ul）、显色剂一滴（约40 ul），50 ℃水浴反应10 min，相机拍摄各比色管内溶液照片，根据各比色管内溶液颜色对应过氧化苯甲酰标准溶液浓度制成标准比色卡。

实施例2：试剂盒制备

1. 制备反应试剂：准确称取0.356 g四水合氯化亚铁（FeCl₂×4H₂O）于1000 ml容量瓶中，加水溶解，再加入10 mol/L的盐酸溶液20 ml，用水稀释至刻度，即为反应试剂；将反应试剂包装在深色或不透光的容器中，用手挤压容器可以逐滴挤出反应试剂；

2. 制备显色剂：准确称取3.806硫氰酸铵（NH₄SCN） 于100 ml容量瓶中，加水溶解，再用水稀释至刻度，即为显色剂；将显色剂包装在容器中，容器可以是但不限于深色或不透光的容器，用手挤压容器可以逐滴挤出显色剂；

3. 制备阳性对照试剂储备液：准确称取0.125 g过氧化苯甲酰于250 ml容量瓶中，加无水乙醇溶解，再用无水乙醇稀释至刻度，即为阳性对照试剂储备液；将阳性对照试剂储备液包装在深色或不透光的容器中；

4. 制备标准比色卡：用无水乙醇分别配制浓度为0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L的过氧化苯甲酰标准溶液，取11支规格为10 ml的比色管，在各比色管中分别加入上述过氧化苯甲酰标准溶液1 ml、反应试剂一滴（约40 ul）、显色剂一滴（约40 ul），50 ℃水浴反应10 min，相机拍摄各比色管内溶液照片，根据各比色管内溶液颜色对应过氧化苯甲酰标准溶液浓度制成标准比色卡。

实施例3：试剂盒制备

1. 制备反应试剂：准确称取0.149 g 七水合硫酸亚铁(Fe(SO₄)₂×7H₂O) 于100 ml容量瓶中，加水溶解，再加入10 mol/L的硫酸溶液2 ml，用水稀释至刻度，即为反应试剂；将反应试剂包装在深色或不透光的容器中，用手挤压容器可以逐滴挤出反应试剂；

2. 制备显色剂：准确称取6.080 g硫氰酸钠（NaSCN） 于100 ml容量瓶中，加水溶解，再用水稀释至刻度，即为显色剂；将显色剂包装在容器中，容器可以是但不限于深色或不透光的容器，用手挤压容器可以逐滴挤出显色剂；

3. 制备阳性对照试剂储备液：准确称取0.15 g过氧化苯甲酰于100 ml容量瓶中，加无水乙醇溶解，再用无水乙醇稀释至刻度，即为阳性对照试剂储备液；将阳性对照试剂储备液包装在深色或不透光的容器中；

4. 制备标准比色卡：用无水乙醇分别配制浓度为0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、14 mg/L、16 mg/L、18 mg/L的过氧化苯甲酰标准溶液，取11支规格为10 ml的比色管，在各比色管中分别加入上述过氧化苯甲酰标准溶液1 ml、反应试剂一滴（约40 ul）、显色剂一滴（约40 ul），50 ℃水浴反应10 min，相机拍摄各比色管内溶液照片，根据各比色管内溶液颜色对应过氧化苯甲酰标准溶液浓度制成标准比色卡。

实施例4：试剂盒使用

本实施例选用实施例1制备的试剂盒，说明试剂盒使用

1. 过氧化苯甲酰样品溶液制备：准确称取M g（0.5 ≤ M ≤ 1.5）待测面粉于锥形瓶、或烧杯、或离心管等容器中，然后向容器中加入V ml（5 ≤ V ≤ 15）无水乙醇，轻摇容器10 min或超声提取2 min，使待测面粉充分分散于无水乙醇中，通过静置方法或过滤方法或离心方法，获得1 ml以上无水乙醇溶液，即为过氧化苯甲酰样品溶液；

2. 试剂盒检测：

（1）制备阳性对照试剂工作液：准确移取阳性对照试剂储备液1 ml于100 ml容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，即为阳性对照试剂工作液；

（2）取3支试管或3支规格为10 ml的比色管，分别作为样品测定管、阴性对照管和阳性对照管，移取过氧化苯甲酰样品溶液1 ml于样品测定管中；

（3）向阴性对照管加入无水乙醇1ml；

（4）向阳性对照管加入1 ml 阳性对照试剂工作液；

（5）分别向样品测定管、阴性对照管和阳性对照管中加入一滴反应试剂（约40ul）；

（6）分别向样品测定管、阴性对照管和阳性对照管中加入一滴显色剂（约40ul）；

（7）样品测定管、阴性对照管和阳性对照管均在50 ℃水浴中反应10 min；

（8）将阴性对照管与标准比色卡比较，若过氧化苯甲酰浓度大于1 mg/L，则提示此次样品测定管测定结果不准确；

（9）将阳性对照管与标准比色卡比较，若过氧化苯甲酰浓度不等于10 mg/L，则提示此次样品测定管测定结果不准确；

（10）若阴性对照管与标准比色卡比较，过氧化苯甲酰浓度小于1 mg/L，同时阳性对照管与标准比色卡比较，过氧化苯甲酰浓度等于10 mg/L，则将样品测定管与标准比色卡比较，并在此基础上进行定性判断和半定量分析。

试剂盒检测操作表如下：                                                

3. 结果计算：

（1）定性判断待测面粉中是否添加了过氧化苯甲酰

若样品测定管与标准比色卡比较，得出样品溶液中过氧化苯甲酰浓度大于1 mg/L，初步定性判断待测面粉中添加了过氧化苯甲酰。

（2）半定量检测待测面粉中过氧化苯甲酰含量

待测面粉中过氧化苯甲酰含量（mg/kg）=

4. 质量控制：

为保证测试结果准确，试剂盒测定方法中设置阴性对照管和阳性对照管；按照本试剂盒使用方法，若阴性对照管对照标准比色卡，过氧化苯甲酰浓度大于1 mg/L，则说明试剂盒已经失效或者提示操作者测定操作过程中出现不符合操作规范的现象，比如锥形瓶、试管、比色管、移液管等未清洗干净，所用的无水乙醇被污染或者纯度不足，样品溶液制备时被污染等；按照本试剂盒使用方法，若阳性对照管对照标准比色卡，过氧化苯甲酰浓度不等于10 mg/L，则说明试剂盒已经失效或者提示操作者测定操作过程中出现不符合操作规范的现象，比如锥形瓶、试管、比色管、移液管等未清洗干净，所用的无水乙醇被污染或者纯度不足，样品溶液制备时被污染等。

需要说明的是：上述实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当了解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。