检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法

摘要

本发明提供一种检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法，该方法包括下列步骤：a、对照溶液的制备；b、供试品溶液的制备；c、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，以各对照品的分子量的对数与其相应保留时间制得标准曲线的线性回归方程，再由标准曲线回归方程分别计算分子量为10000，5000及1000物质的保留时间，以此为限即可计算供试品在各段的累计峰面积值；d、测量最低检出限；e、检测样品基质干扰的影响；f、模拟试验；g、样品的测定。本发明的方法对清开灵注射液产品中的高分子量物质进行检测，对可能带入的高分子量物质进行有效地监控，具有非常重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及中药注射液检测技术领域，具体涉及一种检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法。

背景技术

高分子物质研究是本探索性研究的主要内容，清开灵注射液中的不良反应较多，文献报道的焦点多数是有关高分子量等大分子物质。由于方法的限制，这类高分子量的测定一直没有开展。含有高分子量物质的清开灵注射液产品，从安全性角度考虑，患者在应用时需要进行皮试试验。但是皮试试验仅能对速发型I型变态反应有预测作用，且阳性符合度仅30％，即使皮试试验呈阴性也不能说明以后不发生过敏反应，临床可能出现的变态反应还有II、III、IV型变态反应，这是皮试试验无法预测的。因此，为了确保临床用药的安全有效，对清开灵注射液产品中高分子量物质的含量进行检测，对可能带入的高分子量物质进行有效地监控，从源头上控制临床过敏反应的发生，既可以节约宝贵的临床急救时间，同时也增加了临床医护人员与患者的便利性，减轻了患者的用药痛苦，具有非常重要的意义。

故有必要设计一款新的凝胶色谱测定方法来弥补这些缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的缺陷，提供一种简便易行、耗费少、时间短、准确性和重现性都很好的检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱检测方法。

为达到上述目的，本发明提供一种检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法，该方法包括下列步骤：a、对照溶液的制备：取核糖核酸酶A、人胰岛素、胸腺素α、人生长激素释放抑制因子对照品溶液各1ml，置25ml量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得对照品溶液I；再取对照溶液I 2.5ml，定容至25ml，即得对照溶液II；b、供试品溶液的制备：取供试品溶液10ml，至20ml的超滤离心管中，在10000转/min离心15分钟，取残留物加水定容至1ml，即得；c、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，以各对照品的分子量(MW)的对数与其相应保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程logMW＝a+b tR，再由标准曲线回归方程分别计算分子量为10000，5000及1000物质的保留时间，以此为限即可计算供试品在各段的累计峰面积值；d、测量最低检出限：取对照溶液II分别依次进样25μl、20μl、15μl、10μl、5μl，可发现在进样10μl核糖核酸酶A的峰高与基线噪音的比例约为3∶1，即得最低检出限；e、检测样品基质干扰的影响：分别取对照品溶液II 2ml、3ml、4ml置于5ml量瓶中，用清开灵注射液分别稀释至刻度，依次进样25μl测试，检测样品基质对检测灵敏度的干扰；f、模拟试验：模拟水牛角粉、珍珠母粉的提取工艺，分别在水解2、4、6、8小时取样，检测水解过程中特异蛋白的存在；g、样品的测定：采用供试品溶液的制备方法对10批样品进行检测，注射液的生产工艺控制截取保留相对分子量6000以下的有效物质。

上述步骤中高效液相色谱的条件为：色谱柱为凝胶色谱柱TSK G2000 SWxl柱；流动相为乙腈-0.83％三氟乙酸溶液；检测波长为214±1nm；流速0.70～0.75ml/min。所述供试品溶液色谱图中，选用体积排除色谱先于分子量5800的保留时间的峰作为高分子量物质的峰，按面积归一化法计算，含高分子量物质的量≤1.0％。

测定过程中所述三氟乙酸溶液作为分析纯，所述乙腈作为色谱纯。

葡聚糖凝胶法测定蛋白质分子量的原理，主要是依据凝胶具有分子筛作用，一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝胶内部，很快流出，体积小于孔隙的大分子，则将通过凝胶流出，因此流出较慢。假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，进入凝胶筛孔的程度不同，其洗脱体积决定于分子大小。当蛋白质分子量在一定范围内，蛋白质在葡聚糖凝胶柱上层析的洗脱体积和分子量的对数呈直线关系。

本发明的优点在于：本发明检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法经方法学验证，该方法的灵敏度可达到ppm级，能有效鉴别水牛角及珍珠母中不能完全水解的高分子物质或高分子量，是一种准确、可靠的高分子检查方法。利用所建立的方法对6个企业的18批样品进行了排查，结果样品中可测出分子量在5800以上的成分。本发明简便易行、耗费少、时间短、准确性和重现性都很好，可以确保临床用药的安全有效，对清开灵注射液产品中高分子量物质的含量进行检测，对可能带入的高分子量物质进行有效地监控，从源头上控制临床过敏反应的发生，既可以节约宝贵的临床急救时间，同时也增加了临床医护人员与患者的便利性，减轻了患者的用药痛苦，具有非常重要的意义。本发明采用TSK G2000 SWxl型凝胶柱对清开灵注射液中的高分子物质进行检测，结果在进样体积20μl，检出限为0.08μg下能检出大分子物质，说明本发明建立了一套完整的高分子物质检测方法。

附图说明

附图1为本发明对照溶液与样品混合色谱图；

附图2为本发明最低检出限色谱图；

附图3为本发明分子量对数lgM-出峰时间曲线；

附图4为本发明珍珠母提取液的光谱图；

附图5为本发明水牛角提取液的光谱图。

具体实施方式

下面结合说明书附图，对本发明做进一步说明。

优选的，一种检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法，该方法包括下列步骤：a、对照溶液的制备：如图1所示，取核糖核酸酶A、人胰岛素、胸腺素α、人生长激素释放抑制因子对照品溶液各1ml，置25ml量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得对照品溶液I；再取对照溶液I 2.5ml，定容至25ml，即得对照溶液II；b、供试品溶液的制备：取供试品溶液10ml，至20ml的超滤离心管中，本发明采用Millipore超滤离心管，在10000转/min离心15分钟，取残留物加水定容至1ml，即得供试品溶液；c、测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，以各对照品的分子量(MW)的对数与其相应保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程logMW＝a+b tR，再由标准曲线回归方程分别计算分子量为10000，5000及1000物质的保留时间，以此为限即可计算供试品在各段的累计峰面积值；d、测量最低检出限：如图2所示，取对照溶液II分别依次进样25μl、20μl、15μl、10μl、5μl，可发现在进样10μl核糖核酸酶A的峰高与基线噪音的比例约为3∶1，即得最低检出限为0.04μg；e、检测样品基质干扰的影响：分别取对照品溶液II 2ml、3ml、4ml置于5ml量瓶中，用清开灵注射液分别稀释至刻度，依次进样25μl测试，检测样品基质对检测灵敏度的干扰；f、模拟试验：如图4和图5所示，模拟水牛角粉、珍珠母粉的提取工艺，分别在水解2、4、6、8小时取样，检测水解过程中特异蛋白的存在；g、样品的测定：采用供试品溶液的制备方法对10批样品进行检测，注射液的生产工艺控制截取保留相对分子量6000以下的有效物质。

上述步骤中高效液相色谱的条件为：色谱柱为凝胶色谱柱TSK G2000 SWxl柱；流动相为乙腈-0.83％三氟乙酸溶液(40∶60)；检测波长为214±1nm；流速0.70～0.75ml/min。所述供试品溶液色谱图中，选用体积排除色谱先于分子量5800的保留时间的峰作为高分子量物质的峰；测定过程中所述三氟乙酸溶液作为分析纯，所述乙腈作为色谱纯。

本发明实施例的具体操作步骤为：1、最低检出限：取对照品溶液II分别依次进样25μl、20μl、15μl、10μl、5μl，可发现在进样10μl核糖核酸酶A的峰高与基线噪音的比例约为3∶1，即得最低检出限为0.08μg。2、样品基质干扰的影响：分别取对照品溶液II 2ml、3ml、4ml置5ml量瓶中，用清开灵注射液分别稀释至刻度，依次进样25μl，依法测试，结果此时能检出的限度为0.16μg。这说明由于样品基质的干扰使检测灵敏度降低一半。3、分子量对数与出峰时间曲线：由最低检出限中的各对照出峰时间及其分子量(见表1)，可绘制分子量对数-出峰时间曲线，见图3。以各对照品的分子量(MW)的对数与其相应保留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程logMW＝24.71-3.412 tR，再由标准曲线回归方程计算分子量为10000、5000及1000物质的保留时间分别为11.06min、12.09min及14.49min，以此为限即可计算供试品在各段的累计峰面积值。4、准确度和重复性试验：取同一批参芪扶正注射液10mL于20ml的超滤离心管中，共6份，再加入1mL对照品溶液I，在10000转/min离心15-20分钟，取残留物加水定容至1ml，即得供试品溶液。取上述供试品溶液和对照品溶液I各20μl，进样测定。根据供试品溶液与对照品溶液中核糖核酸酶A与人胰岛素的峰面积比值，计算回收率。结果表明：核糖核酸酶A的平均回收率约为90％，RSD(n＝6)为4.33％；人胰岛素的平均回收率约为72％，RSD(n＝6)为5.86％，说明该方法对以上两种成分测定的准确度和重复性良好。由于本超滤离心管的截流分子量为10000，人胰岛素分子量为5800，这可能是回收率偏低的原因。由于胸腺素α和人生长激素释放抑制因子分子量较小且样品基质干扰明显，故未能计算两者的回收率。

表1为由最低检出限中的各对照出峰时间及其分子量，可绘制分子量对数-出峰时间曲线，如图3所示。

表1：各对照品分子量及出峰时间

本发明检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法测定蛋白质分子量的原理，主要是依据这种凝胶具有分子筛作用，一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝胶内部，很快流出，体积小于孔隙的大分子，则将通过凝胶流出，因此流出较慢。假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，进入凝胶筛孔的程度不同，其洗脱体积决定于分子大小。当蛋白质分子量在一定范围内，蛋白质在葡聚糖凝胶柱上层析的洗脱体积和分子量的对数呈直线关系。若用已知分子量的标准蛋白质在一定型号葡聚糖凝胶柱上层析，精确测其洗脱体积，并以洗脱体积Ve对分子量的对数lgM作图，可获得一条标准曲线。未知分子量的蛋白质在相同条件下层析，根据其洗脱体积即可在标准曲线上求得分子量。

本发明检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法相对于习知的方法来说，具有如下优点：本发明检测清开灵注射液中高分子量物质的凝胶色谱测定方法经方法学验证，该方法的灵敏度可达到ppm级，能有效鉴别水牛角及珍珠母中不能完全水解的高分子物质或高分子量，是一种准确、可靠的高分子检查方法。利用所建立的方法对6个企业的18批样品进行了排查，结果样品中可测出分子量在5800以上的成分。本发明简便易行、耗费少、时间短、准确性和重现性都很好，可以确保临床用药的安全有效，对清开灵注射液产品中高分子量物质的含量进行检测，对可能带入的高分子量物质进行有效地监控，从源头上控制临床过敏反应的发生，既可以节约宝贵的临床急救时间，同时也增加了临床医护人员与患者的便利性，减轻了患者的用药痛苦，具有非常重要的意义。本发明采用TSK G2000 SWxl型凝胶柱对清开灵注射液中的高分子物质进行检测，结果在进样体积20μl，检出限为0.08μg下能检出大分子物质，说明本发明建立了一套完整的高分子物质检测方法。

综上所述实施例不过是本发明的优选最佳实施方案，不可理解为对本发明的保护范围限定，对于本领域的技术工作人员根据本发明本实施例所做的不超出本发明技术方案的调整和改动，应该认为落在本发明的保护范围内。