一种检测急性髓系白血病易感性的试剂盒

摘要

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4(CD44)的单核苷酸多态性（SNP）位点来预测急性髓系白血病的易感性。所述试剂盒，包括荧光定量PCR的常规组件、检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4的rs11821102号单核苷酸多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对。本发明所述试剂盒可以检测DNA的CD44基因上的rs11821102号SNP位点的基因型，从而检测个体急性髓系白血病的易感性，也适用于对胃癌、前列腺癌及卵巢癌的预后检测，更可广泛应用于医疗研究。

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其涉及一种检测急性髓系白血病易感性的试剂盒，通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4 (CD44)的单核苷酸多态性（SNP）位点来预测急性髓系白血病的易感性。

背景技术

血液恶性肿瘤全世界发病例数约为40万，占各种恶性肿瘤的第六位。中国年发新增病例为25万左右，占我国恶性肿瘤的第八位。癌症的发生是一个多因素，多阶段，多基因变异的过程。作为细胞表面的功能的关键分子，CD44参与了肿瘤发生发展的各个重要过程。大量的研究表明，肿瘤免疫调控相关基因的单核苷酸多态可以通过改变这些基因的表达水平的方式，影响这些基因在肿瘤发生、发展中的作用。

SNP（Single nucleotide polymorphism），即单核苷酸多态性，是人类基因组作图的第三代遗传标记，主要是指一类基于单碱基变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组最广泛存在的一类多态性标记，已成为研究基因组多态性和识别、定位疾病相关的一种工具。1996年成功研制了SNP检测的实时荧光定量PCR技术，实现了PCR从定性到定量的飞跃，还实现了判断结果的自动性。可利用荧光定量PCR技术研发检测疾病易感性的试剂盒。

CD44 是细胞表面最重要的透明质酸(HA)受体，通过与HA相互作用促进细胞迁移、诱导信号转导，在多种恶性肿瘤组织都有表达，且与肿瘤生长发展转移相关，是肿瘤负荷和疾病活动度的可靠指标。有研究表明，CD44表达异常可早于Ras、p53等抑癌基因的异常表达，提示其变异可能与Ras基因激活有关，可能是参与肿瘤形成的一个因素。近年来，CD44与血液肿瘤发生、发展、转移、预后、治疗等方面的关系逐渐引起关注。研究发现，CD44表达于所有的AML亚型，与特异性单抗或配体HA结合后可作为信号因子活化细胞功能，这些特性都使其成为AML诱导分化的一个可能靶点（参见：Jia L, Guo J. Cellular & Molecular. Immunology. 2006 3:359-65）。 Gadhoum等发现直接针对CD44细胞表面抗原的特异性单克隆抗体能触发AML1至AML5型白血病细胞的终末分化，抑制其增殖，有些可以引起凋亡（参见：Gadhoum Z, Delaunay J, Maquarre E, Durand L, Lancereaux V, Qi J, Robert-Lezenes J, Chomienne C, Smadja-Joffe F. Leuk Lymphoma. 2004 45:1501-10.）。Charrad等证实CD44与其单克隆抗体结合后能诱导THP-1、 HL-60和NB4细胞终末分化、强烈抑制其增殖、诱导凋亡（参见：Charrad RS, Gadhoum Z, Qi J, Glachant A, Allouche M, Jasmin C, Chomienne C, Smadja-Joffe F. Blood. 2002 99:290-9.）。Johnsson等以基因芯片技术分析了几种对细胞生长抑制剂耐药的细胞系的基因表达全貌，发现在这些细胞系中CD44表达均有改变（参见：Johnsson A, Vallon-Christensson J, Strand C, Litman T, Eriksen J. Anticancer Res. 2005 25:2661-8.）。Artus等发现CD44与其单抗结合能触发一种新的Caspase非依赖性通路，通过释放钙蛋白酶依赖性凋亡诱导因子发挥作用（参见：Artus C, Maquarre E, Moubarak RS, Delettre C, Jasmin C, Susin SA, Robert-Lézénès J. . Oncogene. 2006 25:5741-51.）。Zada等研究发现，CD44的单抗A3D8通过特异性破坏细胞周期、诱导G0/Gl期停滞发挥作用；同时可引起p21表达增加、pRb磷酸化减弱、CDK2/CDK4激酶活性降低。AML原代细胞、HL-60、U937细胞经A3D8作用后，mRNA和蛋白水平的c-jun表达下调，JNK蛋白表达降低、磷酸化的c-jun减少，瞬时转染显示c-jun启动子活性被A3D8抑制；HL-60细胞中c-jun异位过表达能诱导增殖、阻止A3D8的增殖抑制作用，说明CD44与其抗体结合可诱导髓性白血病细胞的细胞周期停滞和增殖停滞，在此过程中，细胞周期和增殖的重要调节器c-jun有重要作用（参见：Zada AA, Singh SM, Reddy VA, Els??sser A, Meisel A, Haferlach T, Tenen DG, Hiddemann W, Behre G. Oncogene. 2003 22:2296-308.）。

rs11821102是位于第18号染色体CD44基因启动子区域的一个T>G多态。其在世界人群的频率分布，T占0.62，G占0.38左右。中国人群的分布T占0.45，G占0.25左右。现有技术中，并没有CD44基因启动子区域的T>G多态与急性髓系白血病易感性相关性的研究报道，也没有通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4 (CD44)的单核苷酸多态性（SNP）位点来预测急性髓系白血病的易感性的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测急性髓系白血病易感性的试剂盒。

本发明的原理为：发明人通过分子生物学研究表明，丝裂原活化蛋白激酶激酶4 (CD44)的rs11821102位点上T>G的替代可增加CD44基因启动子与核蛋白的结合，增加CD44基因的表达；通过大规模人群的急性髓系白血病病例对照研究，CD44基因启动子区域的T>G多态与急性髓系白血病发生相关，并且呈基因剂量-反应关系，即使在调整年龄、性别、吸烟、肿瘤家族史等多种混杂因素后，这种相关性仍然存在；同时，发明人的研究还显示rs11821102与散发性肠癌及鼻咽癌的发生相关，均表现为rs11821102基因型为G时肿瘤发生率降低。因此这个SNP的多态可用于评估个体急性髓系白血病的易感性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测急性髓系白血病易感性的试剂盒，包括：检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4 (CD44)的rs11821102号单核苷酸多态性（SNP）位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR的常规组件；其中，所述特异性引物对包括有义引物序列SEQ ID NO:1和反义引物序列SEQ ID NO:2，具体如下所示：SEQ ID NO:1有义引物序列：5’-CCACAAAGCAGAAAGAAGAAGAAAA-3’，Tm值为60℃；SEQ ID NO:2反义引物序列：5’-GGGAATAGTGCAGAAAGTTGACATC-3’，Tm值为58℃；

所述特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列，具体如下所示：SEQ ID NO:3野生型探针序列：5’-CAGAGTTGATCTGTAGAAT-3’，Tm值为66 ℃；SEQ ID NO:4突变型探针序列：5’-TTAGACAGAGTTGATCTATAGA-3’，Tm值为67 ℃。

上述技术方案中，所述特异性引物是针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点的DNA引物对；优选地，本试剂盒包括具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对。特异引物对可用常规的合成技术合成。本领域技术人员能理解，本发明的引物不限于这对引物。

上述技术方案中，所述特异性荧光探针是针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点而设计，能特异性检测rs11821102这个急性髓系白血病一个基因型的DNA探针对；优选地，本试剂盒包括具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的荧光探针对。特异荧光引物对可用常规的合成技术合成。本领域技术人员能理解，本发明的引物不限于这对荧光探针。所有可用于荧光定量PCR检测CD44基因上的rs11821102号SNP位点的探针均在本发明范围内。

上述技术方案中，所述荧光定量PCR的常规组件包括：Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl₂溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；所述荧光定量PCR的常规组件的成分及其制备方法均为现有技术。

具体地，一种检测急性髓系白血病易感性的试剂盒，每10μl的PCR体系中包括：10μM特异性引物对两条各0.225μl，5μM特异性荧光探针两条各0.1μl；（5unit/μl）Taq DNA聚合酶0.02μl；20mM dNTP混合液0.1μl；25 mM MgCl₂溶液0.5μl；5×荧光定量PCR反应缓冲液2μl；去离子水补足；上述试剂盒的保存温度为-20℃。

本发明同时要求保护上述的试剂盒检测通过荧光定量PCR法检测丝裂原活化蛋白激酶激酶4 的rs11821102号单核苷酸多态性位点基因型的应用。

采用上述检测急性髓系白血病易感性的试剂盒检测待测DNA的CD44基因上的rs11821102号SNP位点的基因型，其中，PCR反应条件为50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min，再进行40~55个PCR循环：92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；反应结束后在；采用荧光定量PCR仪读取荧光量，区分基因型：被检测DNA的CD44基因上的rs11821102号SNP位点携带有G时，为急性髓系白血病易感型。

由于上述技术方案的使用，本发明和现有技术相比，具有以下优点：

由于本发明所述试剂盒中包含的特异性引物对是针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点的DNA引物对；所述的特异性荧光探针是针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点的DNA探针对；因此，可以检测DNA的CD44基因上的rs11821102号SNP位点的基因型，从而检测个体急性髓系白血病的易感性，也适用于对胃癌、前列腺癌及卵巢癌的预后检测，更可广泛应用于医疗研究。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例一

一种检测急性髓系白血病易感性的试剂盒，包括：检测CD44基因上的rs11821102号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；

所述检测CD44基因上的rs11821102号SNP位点的特异性引物对的序列如序列表SEQ ID NO：1所示，有义引物序列的Tm值为60 ℃，反义引物序列的Tm值为58 ℃；所述检测CD44基因上的rs11821102号SNP位点的特异性荧光探针对的序列如序列表SEQ IDNO：2所示，野生型探针序列的Tm值为66 ℃，突变型探针序列的Tm值为67 ℃；

所述的特异性引物，能特异性扩增出包含针对CD44基因上的rs11821102号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。

以供检测一人份使用试剂盒为例，该试剂盒中各物质的含量为：10μM特异性引物对两条各0.225μl，5μM特异性荧光探针两条各0.1μl；（5unit/μl）Taq DNA聚合酶0.02μl；20mM dNTP混合液0.1μl；25 mM MgCl₂溶液0.5μl；5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；去离子水4.1μl。

在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min，再进行40~55个PCR循环：92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。反应结束后在ABI 7900HT型荧光定量PCR仪读取荧光量。

步骤3：基因型分析及确定基因型

采用ABI 7900HT型荧光定量PCR仪自带软件SDS（Sequence Detection Systems）V2.3判读基因型，自动分析结果。被检测DNA的CD44基因上的rs11821102号SNP位点携带有G时，为急性髓系白血病易感型。

实施例二

步骤1：DNA的提取

对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问卷表。常规方法抽取被检测者EDTA抗凝血5ml。用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA。

步骤2：基因分型检测

使用实施例一所述试剂盒，对被检测者DNA的CD44基因上的rs11821102号SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定该位点的基因型。

步骤3：指导人们主动预防急性髓系白血病

通过对被检测者基因型的分析，出具基因分型检测报告和对被检测者个体化健康指导报告。基因分型检测报告详细说明了被检测者急性髓系白血病易感程度的高低以及患病概率大小。个体化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问卷调查结果，评估被检测这急性髓系白血病遗传易感的相对风险。同时制定出针对被检测者的个性化健康行动方案，包括在饮食习惯、生活方式生活的改进建议等，并为被检测者普及预防急性髓系白血病的健康知识。

实施例三：

通过我们设计的方法对314例急性髓系白血病患者和615例正常对照进行基因分型后，将所得数据绘制成表1：

表1、CD44基因rs11821102单核苷酸多态与乳腺癌风险

由表1可见：携带CD44 rs11821102 AA基因型的个体比携带CD44 rs11821102 GG基因型的个体罹患急性髓系白血病的风险要高3.05倍，携带CD44 rs11821102 AG基因型的个体比CD44 rs11821102 GG基因型的个体罹患急性髓系白血病的风险要高1.68倍（趋势检验差异均具有显著性，P < 0.05）。

核苷酸和/或氨基酸序列表

<110>  苏州大学

<120>  一种检测急性髓系白血病易感性的试剂盒

<160>  4

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  1

ccacaaagca gaaagaagaa gaaaa                                              25

<210>  2

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  2

gggaatagtg cagaaagttg acatc                                              25

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  3

cagagttgat ctgtagaat                                                     19

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工合成

<400>  4

ttagacagag ttgatctata ga                                                 22