GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法与应用

摘要

本发明公开了一种GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法与应用。本发明通过设计常用的外源基因的引物，包括5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因，草丁膦乙酰转移酶基因，草丁膦乙酰转移酶基因，玄参花叶病毒35S启动子，花椰菜花叶病毒35S启动子，胭脂碱合成酶基因终止子，进行PCR和毛细管电泳，根据毛细管电泳的结果进行分析；其中PCR为通过采用通用引物引发靶基因扩增。这种PCR能有效解决多重PCR过程中的扩增偏爱性，提高检测灵敏度；毛细管电泳能提高分辨率；根据扩增产物片段长度判断结果，有助于提高检测特异性。本发明为转基因植物的检测提供了较为可靠和简便的检测方法，所建立的体系可重复性高，经多次试验稳定性好。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种GeXP(GenomeLab eXpress Profiling)多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法与应用。

背景技术

随着转基因作物品种日益增多和全球种植面积不断扩大，转基因食品已成为全球食品消费市场的重要组成部分。转基因食品的安全性尤其是食用安全性，也日益引起人们的关切。随着国际贸易和转基因技术的发展，欧盟和美国、日本等国家先后出台了相应的法律和管理方法，对转基因食品实行强制标识或自愿标识。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。可以看到，对转基因食品的检测已经成为必然的世界趋势。因此我们必须加强对转基因食品检测技术的深入研究。一些外源基因常作为转基因作物的筛选检测基因，如5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)，来源于杆菌草丁膦乙酰转移酶基因(BAR)，草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)，玄参花叶病毒35S启动子(FMV35S)，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)。

目前，国内外对转基因农作物检测技术种类较多，大体分为两种：一是检测是否含有外源的蛋白质，即外源基因的表达产物，主要采用ELISA法；二是检测是否含有外源基因(DNA)，主要有基因芯片法和PCR检测法，其中PCR技术较为成熟，具有快速、简便、灵敏等特点。目前，国内外许多科研单位及相关机构将单重PCR技术应用于转基因作物检测。单重PCR技术的主要局限性在于通量不高，这是由于单基因PCR每次只能检测一个基因或转基因元件，如果要同时检测转基因植物中的外源基因、转基因元件或鉴定外源基因、转基因元件的种类等，需要做多个单PCR，而且需要知道待检片段的序列信息，不仅操作繁琐，费时且成本较高，而且在实际应用中转基因元件种类多，序列不确定，难以逐一检测和鉴定。多重PCR在一定程度上解决了上述问题，可以一次检测和鉴定多个外源基因或转基因元件，提高了检测效率。但多重PCR方法本身还存在一些普遍的问题，如特异性和灵敏度不高；由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，反应动力性也极其复杂；扩增中某几个特定片段优先扩增，其他片段不能扩增出；同时检测的目的基因数量一般小于10个等(多在3-5个基因)，使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目标。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法。该方法能同时检测转植物中的多种转基因成分。

本发明的另一目的在于提供所述GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法，包括以下步骤：

(1)设计外源基因和内源基因的引物，下述引物均为5’-3’；

外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的上下游引物分别为：

EPSPS-F：AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTT

EPSPS-R：GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA；

外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)的上下游引物分别为：

CaMV35s-F：AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCA

CaMV35s-R：GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA；

外源基因胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)的上下游引物分别为：

NOS-F：AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCA

NOS-R：GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA；

外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(BAR)(来源于杆菌Bacillus amyloliquefaciens)的上下游引物分别为：

Bar-F：AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACT

Bar-R：GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG；

外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)的上下游引物分别为：

PAT-F：AGGTGACACTATAGAATACGGAGAGGAGACCAGTTGAG

PAT-R：GTACGACTCACTATAGGGATGGGTGTTTGTGGCTCTGT；

外源基因玄参花叶病毒35S启动子(FMV35S)的上下游引物分别为：

FMV35S-F：AGGTGACACTATAGAATAAAGACATCCACCGAAGACTTA

FMV35S-R：GTACGACTCACTATAGGGAAGGACAGCTCTTTTCCACGTT；

内源基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)的上下游引物分别为：

PEP-F：AGGTGACACTATAGAATAGCTAGTGTAGACCAGTTCTTG

PEP-R：GTACGACTCACTATAGGGACACTCTTGTCTCTTGTCCTC；

内源基因植物大豆凝集素基因(Lectin)的上下游引物分别为：

Lectin-F：AGGTGACACTATAGAATAGCCCTCTACTCCACCCCCATCC

Lectin-R：GTACGACTCACTATAGGGAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG；

上游通用引物为：GF：AGGTGACACTATAGAATA；其中该引物进行荧光标记；

下游通用引物为：GR：GTACGACTCACTATAGGGA；其中该引物进行荧光标记；

所述的荧光标记优选荧光素Cy5；

(2)提取样品的基因组；

(3)进行多重PCR：以步骤(2)得到的基因组为模板，步骤(1)中所述外源基因和内源基因的引物可以自由组合，所述的上游通用引物和下游通用引物为必需引物，进行PCR，得到PCR产物；

(4)毛细管电泳检测PCR产物；

(5)对结果进行分析。

步骤(3)中所述的PCR更优选为根据样本的种属不同，选择引物：

①当样本为大豆时，引物为EPSPS-F、EPSPS-R、CaMV35s-F、CaMV35s-R、NOS-F、NOS-R、Lectin-F和Lectin-R按等摩尔比混合得到的引物A，以及上游通用引物和下游通用引物按等摩尔比混合得到的引物D；

②当样本为菜籽时，引物为Bar-F、Bar-R、PAT-F、PAT-R、FMV35S-F、FMV35S-R、NOS-F、NOS-R、PEP-F和PEP-R按等摩尔比混合得到的引物B，以及上游通用引物和下游通用引物按等摩尔比混合得到的引物D；

③当样本为大豆和菜籽混合物时，引物为EPSPS-F、EPSPS-R、CaMV35s-F、CaMV35s-R、Bar-F、Bar-R、PAT-F、PAT-R、FMV35S-F、FMV35S-R、NOS-F和NOS-R按等摩尔比混合得到的引物C，以及上游通用引物和下游通用引物按等摩尔比混合得到的引物D；

所述PC R的反应体系优选为：每25μl PCR反应体系含：引物A、引物B或引物C 1.25pmol，引物D 12.5pmol，基因组20～500ng；

所述PC R的反应条件优选为95℃10min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，35循环；72℃10min；

步骤(4)中所述毛细管电泳的操作步骤优选为：使用样品上样溶液(SLS，Sample Loading Solution)和DSS(DNA Size Standard)-400按体积比155∶1彻底混匀，然后在上样板的每个孔中加入39μl前述混合液，再取1μl步骤(3)得到的PCR产物加入其中，吹打3～4次，最后在每孔覆盖一滴石蜡油；每孔加入分离缓冲液，进行毛细管电泳；

所述分离缓冲液的加入量优选为250μl；

步骤(4)中所述毛细管电泳的条件为：

毛细管：温度50℃；

变性：90℃，120sec；

注入样品：2.0Kv，30sec；

分离：6.0Kv，35min；

步骤(5)中所述的结果分析为根据横坐标size bp数值大小判断基因，其中：Lectin 155bp、NOS 202bp、CaMV35s 232bp、EPSPS 353bp、Bar 321bp、PAT 161bp、FMV35S 247bp、PEP 285bp。

所述GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法应用于植物中转基因成分的检测，特别是应用于大豆和菜籽中转基因成分的检测。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明通过采用通用引物引发靶基因扩增，能有效解决多重PCR过程中的扩增偏爱性，然后再采用毛细管电泳及荧光标记扩增产物以提高检测灵敏度和分辨率；根据扩增产物片段长度判断结果，有助于提高检测特异性。

(2)本发明为转基因植物的检测提供了较为可靠和简便的检测方法，所建立的体系可重复性高，经多次试验稳定性好。其检测结果与其他检测技术相比，具有更大的可靠性和适应性，简化了检测步骤，提高了检测效率，从而为转基因植物的检测提供更有为效的检测手段。

附图说明

图1是利用本发明所述方法检测转基因大豆得到的结果图。

图2是利用本发明所述方法检测转基因菜籽得到的结果图。

图3是利用本发明所述方法检测转基因大豆和转基因菜籽混合物所得的六个外源基因的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)抽提样本的基因组DNA

取转基因大豆(RRS品系国家标准样品XLSY-ZJY-007，北京兴林盛业科技发展中心)经粉碎后，按照Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification Kit的说明书提取基因组DNA，测定其260nm和280nm的紫外吸光值，计算所提取DNA的浓度和纯度。依据所测浓度将DNA溶液稀释到100ng/μl并置于-20℃备用。

(2)检测基因组DNA的完整性

通过扩增大豆的内源参照基因植物大豆凝集素基因(Lectin)进行PCR反应，PCR的反应体系为25μl，其中含：Ex Taq12.5μl，内源参照基因上、下游引物(即Lectin-F和Lectin-R)各(1μmol/L)2.5μl，DNA模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。PCR的反应条件为：95℃，10min；(95℃30s；58℃1min；72℃30s)×35循环；72℃10min。

PCR结果证实所提取的基因组DNA可作为GeXP多重PCR技术的模板。

(3)GeXP多重PCR技术

将如下引物(均为5’-3’)按等摩尔数混合，得到引物A：

外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的上下游引物分别为：

EPSPS-F：AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTT

EPSPS-R：GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA；

外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)的上下游引物分别为：

CaMV35s-F AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCA

CaMV35s-R：GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA；

外源基因胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)的上下游引物分别为：

NOS-F：AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCA

NOS-R：GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA；

内源基因植物大豆凝集素基因(Lectin)的上下游引物分别为：

Lectin-F：AGGTGACACTATAGAATAGCCCTCTACTCCACCCCCATCC

Lectin-R：GTACGACTCACTATAGGGAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG；

将如下引物按等摩尔数混合，得到引物D：

上游通用引物序列：GF：Cy5-AGGTGACACTATAGAATA

下游通用引物序列：GR：Cy5-GTACGACTCACTATAGGGA。

取200μL PCR管，加入Ex Taq(Takara)12.5μl，上、引物A(1μmol/L)1.25μl，引物D(10μmol/L)1.25μl，DNA模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。将PCR反应管放入PCR仪中，扩增条件为95℃10min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，35循环；72℃，10min。

取反应液1μl进行毛细管电泳：

毛细管电泳的体系为40μl：

SLS(Sample Loading Solution)和DSS(DNA Size Standard)-400按体积比155∶1彻底混匀，得到混合液H；在上样板的每个孔中均分装39μl混合液H，取1μl步骤(3)得到的PCR产物加入其中，吹打3～4次，最后在每孔覆盖一滴石蜡油；每孔加入分离缓冲液，进行毛细管电泳。SLS，DSS-400和分离缓冲液均购自美国贝克曼库尔特有限公司。

毛细管电泳的条件为：

毛细管：温度50℃；

变性：90℃，120sec；

注入样品：2.0Kv，30sec；

分离：6.0Kv，35min；

该步所用仪器为：贝克曼Genomelab Gexp-Genetic Analysis System。

结果如图1所示，可见有4个峰。根据横坐标size bp数值大小判断基因，其中：Lectin 155bp、NOS 202bp、CaMV35s 232bp、EPSPS 353bp。从左到右分别为Lectin、NOS、CaMV 35S、EPSPS基因。可见本发明所提供的方法能准确地从大豆中检测出转基因成分。

实施例2

(1)抽提样本的基因组DNA

取转基因油菜籽(RT73系国家标准样品XLSY-ZJY-005，北京兴林盛业科技发展中心)经粉碎后，按照Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification Kit提取DNA，测定其260nm和280nm的紫外吸光值，计算所提取DNA的浓度和纯度。依据所测浓度将DNA溶液稀释到100ng/μl并置于-20℃备用。

(2)检测基因组DNA的完整性

制备的转基因菜籽通过扩增菜籽的内源参照基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)，证实可作为PCR扩增模板。PCR的反应体系和反应条件同实施例1步骤(2)，区别仅在于将引物改为PEP-F和PEP-R。

(3)GeXP多重PCR技术

将如下引物按等摩尔数混合，得到引物B：

外源基因胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)的上下游引物分别为：

NOS-F：AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCA

NOS-R：GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA；

外源基因杆菌草丁膦乙酰转移酶基因(BAR)的上下游引物分别为：

Bar-F：AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACT

Bar-R：GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG；

外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)的上下游引物分别为：

PAT-F：AGGTGACACTATAGAATACGGAGAGGAGACCAGTTGAG

PAT-R：GTACGACTCACTATAGGGATGGGTGTTTGTGGCTCTGT；

外源基因玄参花叶病毒35S启动子(FMV35S)的上下游引物分别为：

FMV35S-F：AGGTGACACTATAGAATAAAGACATCCACCGAAGACTTA

FMV35S-R：GTACGACTCACTATAGGGAAGGACAGCTCTTTTCCACGTT；

内源基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)的上下游引物分别为：

PEP-F：AGGTGACACTATAGAATAGCTAGTGTAGACCAGTTCTTG

PEP-R：GTACGACTCACTATAGGGACACTCTTGTCTCTTGTCCTC；

将如下引物按等摩尔数混合，得到引物D：

上游通用引物序列：GF：Cy5-AGGTGACACTATAGAATA

下游通用引物序列：GR：Cy5-GTACGACTCACTATAGGGA；

取200μL PCR管，加入Ex Taq(Takara)12.5μl，上、引物B(1μmol/L)1.25μl，引物D(10μmol/L)1.25μl，DNA模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。将PCR反应管放入PCR仪中，扩增条件为95℃10min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，35循环；72℃，10min。

取反应液1μl进行毛细管电泳：

毛细管电泳的体系为40μl：

SLS(Sample Loading Solution)和DSS(DNA Size Standard)-400按体积比155∶1比例彻底混匀后在上样板的每个孔中均分装39μl的该混合液，取1μl步骤(3)得到的PCR产物加入其中，吹打3～4次，最后在每孔覆盖一滴石蜡油；每孔加入分离缓冲液，进行毛细管电泳。

毛细管电泳的条件为：

毛细管：温度50℃

变性：90℃，120sec

注入样品：2.0Kv，30sec

分离：6.0Kv，35min

该步所用仪器为：贝克曼Genomelab Gexp-Genetic Analysis System。

结果如图2所示，可清晰观察到5个峰，根据横坐标size bp数值大小判断基因，其中：NOS 202bp、Bar 321bp、PAT 161bp、FMV35S 247bp、PEP 285bp。从左到右分别为PAT、NOS、FMV35S、PEP和Bar基因。可见本发明所提供的方法能准确地从菜籽中检测出转基因成分。

实施例3

(1)抽提样本的基因组DNA

取转基因大豆和转基因油菜籽经粉碎后，按照Promega公司的WizardGenomic DNAPurification Kit提取DNA，测定其260nm和280nm的紫外吸光值，计算所提取DNA的浓度和纯度。依据所测浓度将DNA溶液稀释到100ng/μl并置于-20℃备用。

(2)检测基因组DNA的完整性

以转基因大豆和转基因菜籽的核酸混合液作为模板，同时用大豆和菜籽的两个内源参照基因(植物大豆凝集素基因Lectin和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因PEP)进行PCR扩增，证实混合液可作为PCR扩增模板。PCR的反应体系和反应条件同实施例1步骤(2)，区别仅在于引物为Lectin-F、Lectin-R、PEP-F和PEP-R。

(3)GeXP多重PCR技术

将如下引物按等摩尔数混合，得到引物C：

外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)的上下游引物分别为：

CaMV35s-F AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCA

CaMV35s-R：GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA；

外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的上下游引物分别为：

EPSPS-F：AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTT

EPSPS-R：GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA；

外源基因胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)的上下游引物分别为：

NOS-F：AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCA

NOS-R：GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA；

外源基因杆菌草丁膦乙酰转移酶基因(BAR)的上下游引物分别为：

Bar-F：AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACT

Bar-R：GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG；

外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)的上下游引物分别为：

PAT-F：AGGTGACACTATAGAATACGGAGAGGAGACCAGTTGAG

PAT-R：GTACGACTCACTATAGGGATGGGTGTTTGTGGCTCTGT；

外源基因玄参花叶病毒35S启动子(FMV35S)的上下游引物分别为：

FMV35S-F：AGGTGACACTATAGAATAAAGACATCCACCGAAGACTTA

FMV35S-R：GTACGACTCACTATAGGGAAGGACAGCTCTTTTCCACGTT；

将如下引物按等摩尔数混合，得到引物D：

上游通用引物序列：Cy5-AGGTGACACTATAGAATA

下游通用引物序列：Cy5-GTACGACTCACTATAGGGA；

取200μL PCR管，加入Ex Taq(Takara)12.5μl，上、引物C(1μmol/L)1.25μl，引物D(10μmol/L)1.25μl，DNA模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。将PCR反应管放入PCR仪中，扩增条件为95℃10min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，35循环；72℃，10min。

取反应液1μl进行毛细管电泳：

毛细管电泳的体系为40μl：

SLS和DSS-400按体积比155∶1比例彻底混匀后在上样板的每个孔中均分装39μl的该混合液，取1μl步骤(3)得到的PCR产物加入其中，吹打3～4次，最后在每孔覆盖一滴石蜡油；每孔加入分离缓冲液，进行毛细管电泳；

毛细管电泳的条件为：

毛细管：温度50℃；

变性：90℃，120sec；

注入样品：2.0Kv，30sec；

分离：6.0Kv，35min；

该步所用仪器为：贝克曼Genomelab Gexp-Genetic Analysis System。

结果如图3所示，可清晰观察到6个峰，根据横坐标size bp数值大小判断基因，其中：NOS 202bp、CaMV35s 232bp、EPSPS 353bp、Bar 321bp、PAT 161bp、FMV35S 247bp。从左到右分别为PAT、NOS、CaMV35S、FMV35S、Bar和EPSPS基因。可见本发明所提供的方法能准确地从大豆和菜籽混合物中检测出转基因成分。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。