一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法

摘要

本发明公开了一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法，该方法使用微波直接从果汁样品中提取DNA，根据GenBank中提供的AlicyclobacillusacidoterrestrisDSM3922

说明书

技术领域

本发明涉及食品工业的一种检测方法，特别涉及一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法。

背景技术

脂环酸芽孢杆菌于1967年由日本学者首次报道，该属细菌嗜热耐酸，生存能力独特，可经受酸性条件下的巴氏杀菌过程而存活，污染果汁及果汁饮料后，发生平盖酸败，污染初期果汁在外观上并无明显变化，一旦条件适宜，该属细菌迅速生长繁殖，产生愈创木酚和卤酚等不良风味物质，导致果汁产品香气损失、口感变差、浊度升高、形成沉淀，在保质期内就发生果汁品质劣变，给果汁业带来了巨大的经济损失，是果汁生产厂家比较棘手的常见污染菌。

由于该属细菌严格嗜酸，在pH7.0条件下不能生长，因此，常规细菌总数检验法导致该菌漏检。Mickey等通过脂环酸芽孢杆菌的形态特征（G⁺、产芽孢、白色、圆形菌落）、生长温度范围等生理生化指标，对1575个柑橘进行脂环酸芽孢杆菌检测，结果在591个柑橘中检测出该菌。目前，对该菌的检验仍以这种传统检测法为主。由于传统检测法存在指标多、程序繁琐、耗时、检测结果滞后等缺点，不能及时向生产线反馈信息以采取相应的防范、控制措施。因此，果汁业急需为其提供一种从原料到产品全程跟踪的快速、特异性的检测方法，以及时指导生产实践。

近年来，PCR检测方法由于其特异性高，检测时间相对缩短等特点而广泛应用于果汁中脂环酸芽孢杆菌的鉴定和检测。Connor等应用Reatime PCR方法，能够较快速、特异地检测出脂环酸芽孢杆菌及一些与它亲缘关系较近的嗜酸菌，并且从理论上计算，可以检测出细胞数<100的脂环酸芽孢杆菌。

国内也有学者建立耐热菌的PCR及QC-PCR快速检测方法，整个检测时间为4h～5h，比传统时间的4d～5d大大缩短，但由于这些方法均不能突破常规的DNA提取，需要提供一定量的菌体，因此不能逾越该菌的分离及富集培养，所需检测时间仍较长，而且所用仪器设备及试剂昂贵，与应用于生产实践仍有一定差距。因此，探索真正的快速，特异，定量的PCR检测方法仍然任重而道远。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法，用于苹果汁生产的在线检测。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法，其特征在于，具体按下列步骤进行：

1）取1ml果汁菌悬液，经10000r/min离心2min，弃上清，加50ul双蒸馏水重悬；

2）重悬后的菌体经微波1000W处理60s，5000r/min离心1min，取上清，得到模板DNA；

3）设计一对SHC引物JLX-F和JLX-R，其中：

引物JLX-F：5'-CGGCACCTGGTCCATTTATC-3'

引物JLX-R：5'-TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；

4）将模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R构成25ul体系进行PCR扩增；

5）1%琼脂糖凝胶电泳检测在648bp处获得目的条带，即得到检测结果。

本发明利用微波技术裂解微生物细胞壁，变性蛋白，并通过离心去除蛋白干扰，突破了常规的微生物DNA提取，仅花费2min即可直接从苹果汁样品中获得符合PCR扩增要求的模板，使整个检测过程由过去的至少48h减少为2h内即可完成，检测限为<100CFU/ml，特异，快速，成本低廉，可以用于苹果汁生产的在线检测。

附图说明

图1是微波不同处理时间提取DNA的PCR扩增效果电泳图；

图2是SHC引物特异性检测电泳图；

图3是扩增电泳图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明使用微波直接从果汁样品中提取DNA，根据GenBank中提供的Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922^T的鲨烯环化酶（Shc）基因序列设计一对特异性引物，分别对引物特异性、微波提取DNA的扩增效果及检测灵敏度进行了研究，经验证，其检测时间缩短，检测成本降低，能够实现苹果汁生产的在线检测。

具体按下列步骤进行：

1）取1ml果汁菌悬液，经10000r/min离心2min，弃上清，加50ul双蒸馏水重悬；

2）重悬后的菌体经微波1000W处理60s，5000r/min离心1min，取上清，得到模板DNA；

3）设计一对SHC引物JLX-F和JLX-R，其中：

引物JLX-F：5'-CGGCACCTGGTCCATTTATC-3'

引物JLX-R：5'-TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；

4）将模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R构成25ul体系进行PCR扩增；

5）1%琼脂糖凝胶电泳检测在648bp处获得目的条带，即得到检测结果。

上述PCR扩增的每个体系含2μl模板DNA，2μlDNTP，2.5μl 10倍buffer，10μmol·l^-1的引物JLX-F和引物JLX-R各1.5μl，以及0.2μl的rTaq DNA聚合酶5U·μl^-1，PCR扩增条件为：94℃预热4min，然后进行30个循环，94℃解链45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后，最后72℃延伸10min。

以下是具体的相关实验：

（一）微波提取DNA的模板质量及扩增效果

1、微波处理时间对DNA质量及扩增效果的影响

表1 微波处理时间对DNA质量的影响

注：菌悬液的浓度为2.46×10⁵cfu/ml

从表1列出的微波处理不同时间所提取DNA的OD_260/280看，所有处理的OD_260/280均在1.80～2.20之间，说明所得DNA无蛋白污染。当菌悬液浓度为2.46×10⁵CFU/ml，微波功率为1000W，处理时间为60s时，提取DNA的浓度为247.9 ng/μl。随着微波处理时间延长，DNA的浓度略有降低，说明微波功率为1000W时，处理60s，脂环酸芽孢杆菌细胞均已裂解，释放出DNA，且蛋白质因微波处理变性经离心步骤除去，所得DNA质量符合扩增模板的要求。

（2）微波提取DNA的PCR扩增效果

图1是微波不同处理时间提取DNA的PCR扩增效果，其中标记1表示ZR Genomic DNA Kit 提取DNA；标记2-9分别表示微波处理30s，60s，90s，120s，150s，180s，210s，240s提取的DNA，标记10表示对照，标记M表示Takara DNA Marker DL2000。

不同微波处理时间所提DNA经SHC引物JLX-F（5'-CGGCACCTGGTCCATTTATC-3'）和引物JLX-R（5'-TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'）扩增后，均在648bp处获得目的条带，与ZR Genomic DNA Kit试剂盒所提DNA扩增效果相差不明显，条带清晰，无杂带。另外，对照组无相应条带出现，说明果汁成分对微波提取果汁中脂环酸芽孢杆菌DNA及扩增均无干扰，因此，可以用于果汁生产的脂环酸芽孢杆菌的在线检测。

（二）SHC引物扩增特异性检测

PCR扩增采用25ul体系，每个体系含2μl模板DNA，2μlDNTP，2.5μl 10倍buffer，10μmol·l^-1的引物JLX-F和引物JLX-R各1.5μl以及0.2μl的rTaq DNA聚合酶（5U·μl^-1）。PCR扩增条件为：94℃预热4min，然后进行30个循环，94℃解链45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环结束后，最后72℃延伸10min，扩增效果如图2显示，所有的酸土脂环酸芽孢杆菌属，DSM 3922^T，TAB10，TAB11，TAB12，TAB13，TAB14，TAB92，TAB93，TAB94，TAB95和TAB96均在648bp产生特异、清晰条带，而其它非酸土脂环酸芽孢杆菌属的7株细菌，均无条带出现。说明SHC引物JLX-F和JLX-R可以用来检测酸土脂环酸芽孢杆菌具有很强的特异性。

图2是SHC引物特异性检测电泳图；图中的标记M表示：Takara DNA Marker DL2000；标记C表示对照；标记1-18分别表示；酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3922^T，TAB10，TAB11，TAB12，TAB13，TAB14，TAB92，TAB93，TAB94，TAB95，TAB96，大肠杆菌（ACCC 10503）；变形杆菌ACCC 01427，枯草芽孢杆菌ACCC01854，炭疽芽孢杆菌CMCC 63001，沙门氏菌sp.ACCC 01319，产气杆菌ACCC 02650，金黄色葡萄球菌ACCC 01332。

（三）微波提取DNA的质量与菌悬液浓度的关系及SHC引物灵敏度检测：

表2 菌悬液浓度对所得DNA质量的影响

注：原菌悬液的浓度为2.46×10⁵ CFU/ml，微波处理时间均为30s。

果汁培养物中菌悬液浓度为2.46×10⁵CFU/ml时，停止培养，吸取1ml菌悬液，将菌悬液10倍梯度稀释后，吸取1ml不同稀释度的菌悬液，按照前述方法预处理后，微波处理60s提取DAN。表2数据显示，未经稀释的原菌悬液，所得DNA浓度为247.9 ng/μl，10倍梯度稀释后，所得DNA浓度也呈10倍梯度下降趋势，从10倍、100倍，1000倍稀释后的1ml菌悬液中提取的DNA浓度分别为37.2 ng/μl、5.9 ng/μl，3.9 ng/μl，所得DNA的OD_260/280和OD_260/230数据稳定。但稀释度继续增大时，OD_260/280数据出现异常，所得DNA浓度也很低。从图3的扩增效果图可以看到，当稀释至1000倍时，菌悬液浓度为2.46×10²CFU/ml，微波处理仍可以提到质量较好的模板DNA。

图3给出了微波提取DNA的扩增效果及检测灵敏度，图中的标记M表示：Takara DNA Marker DL2000，1表示对照，2-8分别是A.acidoterrestris DSM 3922^T果汁培养物10倍梯度稀释（0-10^-6）。