跨越式滚环等温扩增技术检测苹果汁中酸土脂环酸芽胞的研究

摘要

酸土脂环酸芽胞杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）是一种革兰氏阳性嗜酸耐热菌，是导致苹果汁产品风味品质变劣的主要污染菌。该菌可以引起苹果汁品质下降，从而导致苹果汁生产商严重的经济损失。目前国内还没有相应的检测标准，如何检测该菌的污染已经被认为是果汁行业面临的主要挑战。传统检测方法耗时长、步骤繁琐、灵敏度低，不能够实现对酸土脂环酸芽胞杆菌的快速检测。因此，需要建立一种快速、高效的检测酸土脂环酸芽胞杆菌的方法，对我国果汁行业的健康可持续发展具有重要意义。
　　本研究建立了一种新的检测方法---跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification，SRCA)方法。该方法只需要一对引物，在恒定的温度下就可以完成体外扩增，同时可以通过肉眼观察荧光和沉淀，实现了结果判定的可视化。
　　本研究对酸土脂环酸芽胞杆菌的鲨烯环化酶(Squalane-hopene cyclase，shc)基因设计特异性引物，对SRCA反应体系和反应条件分别进行优化，并确定最优反应体系和反应条件:0.5μM正反向引物，2mM dNTPs，2.0mM Mg2+，2μL10×Thermopol reaction buffer，8UBst DNA聚合酶（大片段），1μL模板DNA，其余用无菌去离子水补足体系至20μL。最优反应条件:首先94℃预变性3min，冰浴2min，然后62℃反应60min，最后80℃保持5min，终止反应。
　　为验证引物的特异性，选取了14株酸土脂环酸芽胞杆菌和44株非酸土脂环酸芽胞杆菌作为试验菌株，扩增结果显示，所有酸土脂环酸芽胞杆菌均为阳性结果，所有非酸土脂环酸芽胞杆菌均为阴性结果。证明本研究所设计的引物特异性良好。
　　本研究对酸土脂环酸芽胞杆菌纯培养物及人工污染样品分别提取模板DNA，进行SRCA反应，并与PCR方法进行比较。结果显示，SRCA方法的凝胶电泳结果判定法和沉淀可视法灵敏度均为4.5×101CFU/mL，荧光可视法的灵敏度为4.5×100CFU/mL，PCR方法的灵敏度为4.5×103CFU/mL;SRCA方法的凝胶电泳结果判定法和沉淀可视法检出限均为7.1×101CFU/mL，荧光可视法的检出限为7.1×100CFU/mL，PCR方法的检出限为7.1×103CFU/mL。可见，SRCA凝胶电泳结果判定法和沉淀可视法的灵敏度和检出限均是PCR方法的100倍，SRCA荧光可视法的灵敏度和检出限是PCR方法的1000倍。可见，与PCR方法相比，SRCA检测酸土脂环酸芽胞杆菌的方法具有明显的优势。
　　本研究分别采用生理生化鉴定方法及SRCA方法对70份苹果汁样品进行检测，并对SRCA方法的敏感性、特异性及符合率进行评价。最终得到SRCA方法的敏感性、特异性及符合率，分别为100％，97.01％，97.14％。
　　本研究成功建立了SRCA检测苹果汁中酸土脂环酸芽胞杆菌的方法。该方法具有检测时间短、操作过程简单、灵敏、成本低等优点。特别适合在基层单位和中小型果汁企业中应用与推广。

目录

声明

摘要

1．1研究目的及意义

1．2国内外研究进展

1．2．1酸土脂环酸芽胞杆菌的简介

1．2．2酸土脂环酸芽胞杆菌检测方法的研究进展

1．3存在的主要问题

1．4本研究的主要内容

1．4．1跨越式滚环等温扩增技术(Saltatory rolling circle amplification，SRCA)

1．5技术路线

2材料与方法

2．1．1试验菌株

2．1．2主要仪器与试剂

2．1．3培养基与果汁样品

2．2试验方法

2．2．1菌株的培养

2．2．2基因组DNA的提取

2．2．3 SRCA引物设计

2．2．4 SRCA预反应体系及反应条件

2．2．5 PCR引物设计

2．2．6 PCR反应体系及反应条件

2．3 SRCA反应条件及反应体系的优化

2．3．1优化反应试验阳性对照和阴性对照设置

2．3．2引物缺省试验

2．3．3反应温度优化

2．3．5引物添加量优化

2．3．6 Mg2+添加量优化

2．3．7 dNTPs添加量优化

2．3．8 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化

2．3．9模板添加量优化

2．3．10 Bst DNA聚合酶大片段添加量优化

2．4引物特异性分析

2．5 SRCA扩增结果分析

2．5．1 SRCA扩增产物测序分析

2．5．2 SRCA扩增产物酶切验证

2．6灵敏度分析

2．6．1 SRCA方法的灵敏度试验

2．6．2 SRCA凝胶电泳法灵敏度

2．6．3 SRCA荧光可视法灵敏度

2．6．4 SRCA沉淀可视法灵敏度

2．6．5 PCR方法的灵敏度

2．7人工污染苹果汁中酸土脂环酸芽胞杆菌的检出限

2．7．1人工污染样品处理

2．7．2 SRCA凝胶电泳法检出限

2．7．3 SRCA荧光可视法检出限

2．7．4 SRCA沉淀可视法检出限

2．7．5 PCR方法的检出限

2．8 SRCA方法的应用

3结果与分析

3．1 SRCA反应条件及反应体系的优化

3．1．1引物缺省试验

3．1．2反应温度优化

3．1．3反应时间优化

3．1．4引物添加量优化

3．1．5 Mg2+添加量优化

3．1．6 dNTPs添加量优化

3．1．7 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化

3．1．8模板添加量优化

3．1．9 Bst DNA聚合酶大片段添加量优化

3．2 SRCA最佳反应体系

3．3引物特异性验证

3．3．1 SRCA凝胶电泳法引物特异性验证

3．3．2 SRCA荧光可视法引物特异性验证

3．3．3 SRCA沉淀可视法引物特异性验证

3．4 SRCA扩增结果分析

3．4．1 SRCA扩增产物的测序分析

3．4．2 SRCA扩增产物的酶切分析

3．5 SRCA的灵敏度分析

3．5．1 SRCA凝胶电泳法灵敏度测定

3．5．2 SRCA荧光可视法灵敏度测定

3．5．3 SRCA沉淀可视法灵敏度测定

3．5．4 PCR凝胶电泳法灵敏度测定

3．6人工污染苹果汁中酸土脂环酸芽胞杆菌检出限

3．6．1 SRCA凝胶电泳法检出限

3．6．2 SRCA荧光可视法检出限

3．6．3 SRCA沉淀可视法检出限

3．6．4 PCR凝胶电泳法检出限

3．7 SRCA方法的应用与评价

4讨论

4．1 SRCA检测酸土脂环酸芽胞杆菌方法的评价

4．2特异性基因的选择

4．3引物设计

4．4 SRCA反应的主要影响因素

4．4．1反应温度

4．4．2 DNA模板

4．4．3引物

4．6 SRCA扩增产物的分析

4．7 SRCA反应注意事项

4．8展望

5结论

参考文献

作者简介

致谢