一种管道化鸡冠提取玻璃酸钠(透明质酸钠)的制备方法

摘要

本发明公开一种管道化鸡冠提取玻璃酸钠(透明质酸钠)的制备方法，该方法以鸡冠为原料，经过加热病毒灭活，加热去脂，组织消化，季铵盐分离，乙醇提纯、除菌、真空干燥制得无菌玻璃酸钠(透明质酸钠)。本发明制得产品质量稳定，纯度高，收率可达到千分之六以上，成本大幅下降。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及从动物组织中(鸡冠)提取玻璃酸钠(透明质酸钠)的制备方法。

背景技术

玻璃酸钠(透明质酸钠)是存在于鸡冠和动物结缔组织中的一种高分子多糖体，它是从动物结缔组织中萃取精制获得的，具有良好的保水性和润滑性的玻璃酸或玻璃酸钠(透明质酸钠)。目前已广泛用作化妆品的主要原料和眼科手术用的粘弹剂、骨关节腔的润滑剂，以及妇科、外科手术中的防粘连剂。为了达到适用于上述各领域的目的，就需要制取高纯度的玻璃酸钠(透明质酸钠)。

发明内容

本发明涉及一种管道化鸡冠提取玻璃酸钠(透明质酸钠)的制备方法，包括以下步骤：

1)鸡冠中病毒灭活的处理

鸡冠中病毒在68～98℃灭活，灭活时间为1～4小时。

2)鸡冠中脂肪的处理

将绞碎肉鸡冠置于反应罐中，加纯化水浸泡，去除上层油脂。病毒灭活期间不断去除上层油脂。

3)酶解

木瓜酶酶解：温度控制在48～68℃，pH＝5～7，缓慢搅拌，加木瓜酶每公斤鸡冠200～440万单位，12～18小时，期间不断去除上层油脂。

胰酶酶解：加氢氧化钠溶液调节pH至7～9，温度35～50℃，加胰酶粉每公斤鸡冠0.75～1.6万单位。酶解2～6小时，酶解期间，控制pH为7～9。

4)卤代烷吡啶盐的纯化

两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯，将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。

5)乙醇沉淀

将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取，进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。

6)预过滤及除菌过滤：

乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤，再进行0.22u微孔滤器除菌过滤，除菌液脱水，真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。

本发明从动物组织中提取的玻璃酸钠(透明质酸钠)制成的产品，用于人体时具有更好的生物相容性，但是在另一方面，它们应用到人体则会增加病毒传播和免疫原性等方面的安全风险。因此，本发明的目的在于管道化鸡冠提取玻璃酸钠(透明质酸钠)的制造过程中，增加病毒灭活的处理，将动物组织中可能存在的病毒灭活，提高产品的安全性。主要工艺参数为纯蒸汽加热68-98℃灭活，灭活时间为1～4小时。

本发明中对动物组织中存在的脂肪通过物理加热的方法去除，避免了传统工艺中采用化学溶剂如丙酮去脂。提高产品生产的安全性，减少对环境的污染。主要工艺为：将绞碎鸡冠置于反应罐中，加纯化水浸泡，去除上层油脂。病毒灭活期间不断去除上层油脂。

本发明中的组织消化，采用木瓜酶和胰酶进行酶消化。对鸡冠组织中蛋白质去除更彻底。主要工艺参数为：

木瓜酶酶解：温度控制在48～68℃，pH＝5～7，缓慢搅拌，加木瓜酶每公斤鸡冠200～440万单位，12～18小时，期间不断去除上层油脂。

胰酶酶解：加氢氧化钠溶液调节pH至7～9，温度35～50℃，加胰酶粉每公斤鸡冠0.75～1.6万单位。酶解2～6小时，酶解期间，控制pH为7～9。

本发明中采用两次CPC沉淀，沉淀完全后，收集沉淀，用NaCl溶液复溶，加硅藻土过滤。

本发明中采用两次乙醇沉淀：90％以上乙醇加至过滤料液中，沉淀完全后，收集沉淀。0.4～1mol/L NaCl溶液中复溶。

本发明中第二次乙醇沉淀的复溶溶液用活性炭吸附(0.2％-0.25％)，50℃以上吸附不少于1小时，搅拌吸附后，进行除活性炭过滤，收集滤液。以上滤过液，经0.22um微孔滤器过滤，收集滤液。

本发明在搅拌状态下加2-2.5倍量体积左右95％乙醇，充分沉淀后加适量体积的95％除菌乙醇固化，经固化的沉淀物于三合一机器内洗涤、脱水、干燥。即得玻璃酸钠(透明质酸钠)。

本发明采用管道化制备，每1kg鸡冠经上述方法可制得玻璃酸钠(透明质酸钠)5～7g，比非管道生产方法提高2～3倍，单批产量达4kg以上，比非管道生产方式提高20倍。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

将绞碎肉鸡冠置于反应罐中，加纯化水浸泡，去除上层油脂。88℃灭活2小时。病毒灭活期间不断去除上层油脂。温度控制在58℃，pH6.0，缓慢搅拌，加木瓜酶每公斤鸡冠200～440万单位，16小时，期间不断去除上层油脂。加氢氧化钠溶液调节pH至8.0，温度45℃，加胰酶粉每公斤鸡冠0.75～1.6万单位。酶解4小时，酶解期间，控制pH为8.0。两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯，将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取，进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤，再进行0.22u微孔滤器除菌过滤，除菌液脱水，真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。

实施例2

将绞碎肉鸡冠置于反应罐中，加纯化水浸泡，去除上层油脂。78℃灭活1.5小时。病毒灭活期间不断去除上层油脂。温度控制在48℃，pH5.0，缓慢搅拌，加木瓜酶每公斤鸡冠200～440万单位，12小时，期间不断去除上层油脂。加氢氧化钠溶液调节pH至7.0，温度50℃，加胰酶粉每公斤鸡冠0.75～1.6万单位。酶解3小时，酶解期间，控制pH为8.0。两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯，将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取，进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤，再进行0.22u微孔滤器除菌过滤，除菌液脱水，真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。

实施例3

将绞碎肉鸡冠置于反应罐中，加纯化水浸泡，去除上层油脂。70℃灭活2小时。病毒灭活期间不断去除上层油脂。温度控制在68℃，pH7.0，缓慢搅拌，加木瓜酶每公斤鸡冠200～440万单位，16小时，期间不断去除上层油脂。加氢氧化钠溶液调节pH至9.0，温度50℃，加胰酶粉每公斤鸡冠0.75～1.6万单位。酶解4小时，酶解期间，控制pH为8.0。两次添加卤代烷吡啶盐进行提纯，将两次提纯物分别用盐溶液进行复溶。将上述提取物的复溶液用乙醇沉淀收取，进行两次乙醇沉淀。将两次提纯物分别用不同盐浓度进行复溶。乙醇提取物进行活性炭吸附去内毒素和色素等杂质预过滤，再进行0.22u微孔滤器除菌过滤，除菌液脱水，真空干燥制得玻璃酸钠(透明质酸钠)。

病毒灭活的效果验证：

实施例4

用本发明方法制得的玻璃酸钠(透明质酸钠)：取至生产过程中88℃加热处理之前的中间品，批号分别为090622、090707、090714的玻璃酸钠(透明质酸钠)中间品，送中国药品生物制品检定所委托进行玻璃酸钠(透明质酸钠)病毒灭活效果验证。

经中国药品生物制品检定所病毒灭活效果验证，结果如下：

采用指示病毒：

1)呼肠孤病毒III型(Reo3)：属呼肠病毒科，为双股RNA病毒，无囊膜，在ph2.2-8.0稳定，对有机溶剂有抵抗力，较耐热。

2)伪狂犬病毒(PRV)：属疱疹病毒科，为双股DNA病毒，有囊膜，对乙醚、氯仿等脂溶剂，福尔马林和紫外线照射等敏感，是疱疹病毒中抵抗力较强的一种。

3)水泡性口炎病毒(VSV)：属弹状病毒科，为单股负链RNA病毒，有囊膜，可见光、紫外光及脂溶剂能使其灭活，不耐酸。对理化学因子的抵抗力与口蹄疫病毒相似。

4)猴空泡病毒40(SV40)：属乳多空病毒科，为双股DNA病毒，无囊膜，对酸、热、乙醚、甲醛等均有较强的抵抗力。

验证结果：

1)三批中间品经88℃加热处理后，可灭活呼肠孤病毒III型分别为：

090622批≥5.625LgTCID₅₀/0.1ml

090707批≥5.375LgTCID₅₀/0.1ml

090714批≥6.063LgTCID₅₀/0.1ml

2)三批中间品经88℃加热处理后，可灭活伪狂犬病毒分别为：

090622批≥5.375LgTCID₅₀/0.1ml

090707批≥5.188LgTCID₅₀/0.1ml

090714批≥5.563LgTCID₅₀/0.1ml

3)三批中间品经88℃加热处理后，可灭活水泡性口炎病毒分别为：

090622批≥6.563LgTCID₅₀/0.1ml

090707批≥6.313LgTCID₅₀/0.1ml

090714批≥6.750LgTCID₅₀/0.1ml

4)三批中间品经88℃加热处理后，可灭活猴空泡病毒40分别为：

090622批≥7.125LgTCID50/0.1ml

090707批≥7.000LgTCID50/0.1ml

090714批≥7.250LgTCID50/0.1ml

验证结论：

上海昊海生物科技有限公司生产的连续三批玻璃酸钠(透明质酸钠)(玻璃酸钠(透明质酸钠))中间品，加入感染呼肠孤病毒III型、伪狂犬病毒(PRV)、水泡性口炎病毒(VSV)、猴空泡病毒40等四种指示病毒后，按照其生产工艺，进行88℃加热处理，病毒去除量均大于4logs，根据国药监注[2002]160号文的规定，88℃加热处理为有效灭活病毒方法。

玻璃酸钠(透明质酸钠)制品的检验结果

实施例5

用本发明方法制得的玻璃酸钠(透明质酸钠)原料配制成的玻璃酸钠(透明质酸钠)注射液质量指标检测结果如下：

经山东医疗器械质量监督检验中心测试结果：(检验标准：YY0308-2004《医用透明质酸钠凝胶》)

  乙醇残留量  应不大于400ug/g  ＜61  ＜63  无菌  应无菌  无菌生长  无菌生长  细菌内毒素  应＜0.5EU/mg  ＜0.5  ＜0.5  溶血性链球  菌溶血素  应无溶血性链球菌溶血素  无溶血性链球菌溶  血素  无溶血性链球菌溶血素  细胞毒性  细胞相对增殖率应不小于  50％  细胞相对增殖率：  80％  细胞相对增殖率：80％  致敏  应无致敏反应  无致敏反应  无致敏反应

  皮内刺激  应无皮内刺激反应  无皮内刺激反应  无皮内刺激反应  眼刺激：  应无眼内刺激  无眼内刺激  无眼内刺激  皮下植入  皮下植入样品14天，取样  境内观察，样品周围组织相  容性良好，可见以嗜中性粒  细胞浸润为主的轻微炎症  反应。  皮下植入样品14天，  境内观察可见有嗜  中性粒细胞浸润为  主的炎性反应，样品  周围组织反应良好。  皮下植入样品14天，境  内观察可见有嗜中性粒  细胞浸润为主的炎性反  应，样品周围组织反应  良好。  遗传毒性  Ames试验：结果应呈阴性  小鼠淋巴瘤试验：结果应呈  阴性  染色体畸变试验：结果应呈  阴性  结果呈阴性  结果呈阴性  结果呈阴性  结果呈阴性  结果呈阴性  结果呈阴性