用于产生降血压肽的瑞士乳杆菌菌株

摘要

本发明涉及能产生大量的降血压肽，特别是IPP、VPP和LPP的瑞士乳杆菌的新菌株。本发明也涉及含有三肽IPP-VPP-LPP的混合物和瑞士乳杆菌菌株的发酵乳制品。本发明进一步涉及由三肽IPP、VPP和LPP组成的特定的肽混合物以及发酵产物或肽的混合物在食品、食品补充剂或药物组合物中用于降低或预防高血压的用途。

说明书

本发明涉及能产生大量降血压肽，特别是IPP、VPP和LPP的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)的新菌株。本发明也涉及含有三肽IPP-VPP-LPP和瑞士乳杆菌菌株的混合物的发酵乳制品。本发明进一步涉及由三肽IPP、VPP和LPP组成的特定的肽混合物，以及发酵的产物或肽的混合物在食品、食品补充剂或药物组合物中用于降低或预防高血压的用途。

发明背景

认为高血压是心血管疾病(Cardio Vascular Disease)的主要危险因素之一。调节血压的一种机制是肾素-血管紧张素系统。这是一种导致血管紧张素II形成的反应级联，血管紧张素II具有强的血管收缩作用并由此引起血压升高作用。抑制该级联中的一种关键酶：血管紧张素I转化酶(Angiotensin I Converting Enzyme)(ACE)降低了血管紧张素II的形成并因此具有血压降低作用。

用来自瑞士乳杆菌(其作为用于奶制品的一般乳酸菌起始物已经用于生产发酵乳很长时间)的蛋白酶降解乳蛋白产生了具有ACE抑制活性的肽，其在自发性高血压大鼠中具有显著的抗高血压作用(Yamamoto、Akino、& Takano，1994)。用含有瑞士乳杆菌的发酵乳观察到了相同的作用(Nakamura、Yamamoto、Sakai、Okubo等，1995)。

事实上，目前已经显示，用瑞士乳杆菌(L.helveticus)发酵的乳含有抑制血管紧张素转化酶(ACE)的小肽例如异亮氨酰-脯氨酰-脯氨酸(Ile-Pro-Pro，IPP)和缬氨酰-脯氨酰-脯氨酸(Val-Pro-Pro，VPP)。

声称“适合于患轻度高血压人群”的市售发酵乳制品是由日本的Calpis Food Industry公司生产的用瑞士乳杆菌和酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)发酵的可尔必思(Calpis)酸乳。

另一个市售的发酵乳制品是由芬兰的Valio生产的EVOLUS^TM，其声称是“帮助低血压”的第一个欧洲的功能性食品。

两种发酵乳制品都用瑞士乳杆菌菌株发酵。产品含有通过酪蛋白的蛋白水解产生的负责体外ACE抑制的生物活性肽(VPP和IPP)。与其它乳酸菌相比，瑞士乳杆菌是最有效的蛋白水解乳杆菌属物种之一。

然而，仍然存在对具有特别高产量的降血压肽的瑞士乳杆菌属的备选乳酸菌菌株的需求，所述乳酸菌菌株可以容易地制备并以适合于服用的形式提供给消费者。

发明概述

因此，本发明的目的是提供瑞士乳杆菌和IPP-VPP-LPP的混合物或用所述菌株可获得的IPP、VPP和LPP的混合物的发酵乳制品。所述IPP-VPP-LPP的混合物优选地为大约2∶1∶1至1∶1∶1的比率。此类具有抗高血压特性的肽可以加入食品或药物产品中以预防或降低高血压。

本发明的另一个目的是提供瑞士乳杆菌的新乳酸菌菌株，即NCC 935-(CNCM I-3997)、NCC1322(LH111)(CNCM I-3998)和NCC1649(LH158)(CNCM I-3999)，它们可以产生由VPP、IPP和LPP组成的三肽混合物。此外，它们可以提供两倍高于在市售的产品Ameal S^TM中发现的浓度。

根据本发明，也提供了含有发酵乳的食品、宠物食品组合物或营养补充剂，所述发酵乳包含前述乳酸菌和/或由Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro和Leu-Pro-Pro组成的三肽混合物，所述混合物优选地为大约2∶1∶1至1∶1∶1的比率。在最后一个目的中，本发明涉及此类食品、宠物食品或食品补充剂的抗高血压特性的用途。

在附图中，

图1显示了在不同的市售乳制品中存在的和用瑞士乳杆菌的不同菌株通过发酵在乳中产生的VPP和IPP三肽的浓度。

图2显示了在用瑞士乳杆菌LH53、LH111、LH158、LH157发酵18小时和24小时后，在常规稀释的乳基质(milk base)中存在的VPP和IPP三肽的浓度。

发明详述

在本说明书的上下文中，词语“包含”意指“包括，等等”。不应解释为“仅由一种组成”。而且，在本文中定义的“三肽VPP、IPP和LPP”包括VPP、IPP和LPP以及含有包含VPP、IPP和VPP序列的3-25个氨基酸残基的肽和这些肽的混合物。

根据第一个目的，涉及发酵乳制品，其含有瑞士乳杆菌的乳酸菌菌株和IPP-VPP-LPP的混合物。

事实上，已经惊奇的发现，瑞士乳杆菌的一些菌株可以产生大量的三种三肽VPP-IPP-LPP的混合物，优选地以依据发酵条件而变化的从大约2∶1∶1至1∶1∶1的比率。

在所有测试的菌株中，瑞士乳杆菌NCC 935(LH53)、NCC1322(LH111)和NCC 1649(LH 158A)根据布达佩斯条约在2008年6月11日在巴斯德研究所(Pasteur Institute)(法国)的国立微生物保藏中心(CNCM)分别以保藏号CNCM I-3997、CNCM I-3998和CNCM I-3999保藏。

根据本发明的发酵乳制品可以通过包括用上述乳酸菌发酵培养基的方法制备，所述培养基含有包含序列VPP、IPP和LPP的基于蛋白质的原材料。优选地，将乳用作为原材料。

乳原材料可以是任一乳、脱脂乳，只要它含有包含氨基酸序列VPP、IPP和/或LPP的蛋白质。也可以使用动物乳如牛乳、山羊乳、骆驼乳、马乳。

不特别限制乳原材料中固体的含量，但是通常是5至20wt％。乳原材料可以是通过混合水和乳成分，例如(脱脂)乳粉制备的复原乳。乳原材料可以含有添加剂，例如碳水化合物等，只要这些添加剂不妨碍发酵。

乳原材料的发酵可以在常规的发酵罐中实行，其中将乳原材料作为培养基用本发明的瑞士乳杆菌接种。可以将瑞士乳杆菌优选地以具有足够活性的预培养起始物的形式添加入发酵。起始物的初始细胞数优选地是大约10⁷至10⁹个细胞/ml。并没有特别限制接种培养基所用的瑞士乳杆菌的量，但是其优选地是1至5％，最优选地是起始物菌株的2％。

为了得到均匀的发酵培养基，可以以常规的方式混合发酵罐中的物质，包括瑞士乳杆菌接种物和乳原材料。

发酵有利地可以在25至50℃，优选地在30至45℃进行6至100小时，优选地15至50小时。在一个最优选的实施方案中，发酵温度是38-42℃，因为在这个温度范围内，形成了最大量的三肽VPP、IPP和LPP。而且，可以调整发酵期间的pH以便产生最大量的三肽。

在发酵的乳中，根据本发明产生的三肽的总量可以依据用作为原材料的乳的来源和优化的工艺条件而变。该种量例如可以包含大约10至50mg/l的总三肽，优选地15至30mg/l。而且，通常用于制备稀释的发酵乳饮品而实施的稀释显然减少了三肽的总量。在制备常规的稀释乳饮品的情况下，总三肽的量可以是最大约10mg/L的发酵乳饮品，优选地4至8mg/L。

测量了三肽在8℃保存1个月期间的稳定性，并且结果显示，保存后三肽的浓度仅稍微低于发酵结束时，因此表明，肽在8℃保存期间没有降解。

在另一个实施方案中，任选地巴氏灭菌的发酵乳可以用根据本发明的微生物补充，所述微生物将不会在发酵培养基上进一步生长。例如，产物可以是酸奶，其是经热处理的，并且为了获得具有本发明的特征的产物，向其加入不能在已发酵的、经热处理的产物中生长的微生物。因此，根据本发明的产物可以是天然的或具有额外的调味剂或成分如水果的搅拌型或凝固型酸奶。根据本发明的产物也可以是贮藏稳定的新鲜奶酪。

其它微生物可以任选地加入到发酵培养基中，例如益生细菌或酵母。

发酵的乳制品可以就这样使用，或者可以稀释，它可以是经浓缩的，它可以是经纯化的和它可以是经干燥的，优选地是经喷雾干燥的或经冷冻干燥的。发酵的乳制品可以是例如酸奶、酸性乳饮料或奶酪。发酵乳也可以在食品产品中作为食品成分使用。根据本发明的食品产品可以是任一食品类型、宠物食品或营养补充剂。根据本发明的产品可以通过技术人员基于普通的一般知识，使用发酵乳或发酵乳衍生的产物例如上述的IPP-VPP-LPP混合物以合适的量作为成分来制备。该类食品产品的例子是焙烤商品、营养组合物和乳类食品，特别是低脂乳制品、零食、饮品、含有发酵酸乳的食品、基于谷类的产品等。

根据本发明的发酵的乳制品或衍生的食品产品可以是巴氏灭菌的或灭菌的。

备选地，根据本发明的产品可以是例如糖浆、饮品、果汁例如苹果、桔子或一般的水果果汁。产品也可以是基于大豆的产品或基于谷类的产品。例如，它可以是大豆乳或大豆饮品。例如，液体产品可以是乳的基于大豆的替代物。基于大豆的产品可以无乳糖。

除发酵的乳制品外，它们可以包含合适量的普通食品成分，例如调味剂、糖、水果、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂等。

在一个优选的实施方案中，可以向组合物中加入额外的活性成分。该类成分优选的是维生素D或维生素D的类似物。添加维生素D与根据本发明的三肽的混合物组合改善了组合物的功效。维生素D的每日价值DV是大约400IU(对成年人而言)。

根据另外的方面，本发明提供了使用有效量的上述瑞士乳杆菌菌株的发酵培养基和/或它们的IPP-VPP-LPP混合物，优选地以1∶1∶1的比率(+/-10％)的混合物来预防或治疗高血压的方法。根据本发明的食品的有效量通常可以是例如使得总三肽的每日摄取是至少每天5.2mg。例如，如果由LH53发酵产生了多于30mg/L的三肽，那么在150ml中，发酵的稀释乳基质就可以含有每日剂量。

现给出本发明的特定实施例作为进一步的说明。

实施例1：LAB菌株的筛选

本工作的目的是筛选一系列乳酸菌(LAB)在乳发酵期间具有产生更大量生物活性三肽的潜力。

基于它们的生理学特性，选择了一系列的30个菌株的瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和唾液链球菌(Streptococcus thermophilus)。第一个考虑的标准是酸化能力(PA)，其是在24小时内产生的酸的量。这种产生大量酸的潜能与生长行为和细菌在乳中的蛋白水解特性直接相关。有效的蛋白水解系统对肽的释放是必要的。第二个考虑的标准是在肽的产生和/或稳定性中发挥作用的菌株的肽酶活性。

在PA乳(10％脱脂乳粉在98-100℃巴氏灭菌35分钟)中，从冻干原种中再活化不同的菌株。然后，将PA乳用2％的每一种起始物菌株接种并在40℃温育。对于每一种菌株，在凝固时终止发酵并保存于4℃。然后将发酵产物进行处理用于如下述的VPP和IPP的定量。

通过液相层析(LC)和质谱法(MS)定量三肽VPP和IPP

样品制备

通过离心来澄清(去除凝固的蛋白质)不同的发酵产物，并将澄清的上清液等分保存于-20℃。将500μl等分试样的澄清上清液用Ultrafree-0.5单位(Millipore，截留分子量10,000Da)在12,000g通过离心20分钟过滤。在固相萃取(SPE)前，将滤液通过用在水中的0.1％三氟乙酸(TFA)1∶1稀释来酸化。将Cartridges tC18 Sep-Pak Plus(Waters Corp.，Milford，MA)用2ml 0.1％在乙腈中的TFA进行调整，然后用2ml 0.1％在水中的TFA进行平衡。将1ml稀释的滤液应用于SPE-柱体上，并用2ml 0.1％在水中的TFA洗涤。

肽的洗脱用2ml 70％乙腈、0.1％TFA水溶液来完成。将洗脱液在Speedvac浓缩器中干燥至完全，并储存于-20℃直到进一步使用。需要将样品预纯化以除去与目标分析物不利地相互作用的化合物。

液相层析(LC)和质谱法(MS)分析

将干燥的样品在0.1％TFA中重新溶解，超声15分钟并离心。将12.5μl当量的初始发酵乳注射到HyperCarb柱(0.32×150mm，5μm)：一种100％多孔石墨碳柱(HyperCarb柱，Thermo Electron Corp.，Bellefonte，PA)上。将柱安装在由Rheos 2000泵(Flux Instruments，瑞士)和HTC PAL自动取样器(CTC Analytics，瑞士)组成的HPLC系统上。

将柱的出口直接与LCQ经典离子阱MS(Thermo Electron Corp，Bellefonte，PA)连接。溶剂A由0.1％TFA水溶液组成，溶剂B是在水中的80％乙腈、0.1％TFA。肽洗脱包括用100％溶剂A的等度洗涤10分钟，然后用30分钟内从0-50％的B的线性梯度洗涤，流速5μl/分钟。通过100％的B洗涤5分钟再生柱，然后在下一次注射前再平衡15分钟。

MS系统在单位分辨率从m/z 250-1600扫描；毛细管电压设定为4kV且温度为140℃。用Xcalibur 1.3使用来自MS层析图的质量迹线(对于VPP提取的质量为m/z 312.1和对于IPP为m/z 326.1)的手工积分来进行系统控制和数据分析。将标准峰的积分面积用作为单个校准点以计算样品中两种三肽的含量。

如果省去了用Ultrafree-0.5单位(10,000Da截留)的样品过滤，那么峰形和强度都会显著地降低，而且两种肽的定量是不可行的(未显示数据)。精确的样品纯化和适应的层析条件对获得可重复的和定量的结果是关键的。MS检测的特异性是必需的，以测量在发酵产物的复杂混合物中的两种肽。

结果

结果显示，大多数选择的菌株产生了少于1mg/L的三肽(表1)。在经测试的不同乳酸菌中，只有一些瑞士乳杆菌菌株产生了多于1mg/L直到几乎5mg/L如LH111。在菌株的蛋白水解特性和三肽的产生之间不存在直接的相关性。

表1：定量由不同的唾液链球菌(S.thermophilus)(Sfi和S)、、保加利亚乳杆菌(L.delbrueckii subsp bulgaricus)(Yl、Lfi和LD)和瑞士乳杆菌(LH)菌株产生的VPP+IPP。(PA：酸化能力(NCC Bionumerics)；pep：低至高肽酶活性，1-4；coag：以小时计的凝固时间；VPP+IPP：在产物中的浓度(以mg/L计)；nd：未测定)

除LH158外，产生大量三肽的菌株(LH111、LH25、LH53和LH92)需要大约8小时以使乳凝固。然后，将这些菌株在相同条件中进行测试，但是将发酵时间增加到24小时和40小时。结果显示，延长发酵时间对三肽生产在不同的瑞士乳杆菌菌株间具有不同的作用(图1)。对于LH25来说，在8小时和40小时之间仅观察到了少量的增加，然而LH53在8小时和24小时之间却产生了大量的三肽。

一般而言，在24小时和40小时之间观察到了释放的三肽的量的减少。

已经发现3种瑞士乳杆菌菌株产生了大量的降低血压的三肽。因此，这些菌株应当能产生含有几乎2倍量的存在于Calpis产品(Ameal S^TM)中的三肽的乳制品。