瑞士乳杆菌蛋白酶的分离纯化及其水解乳蛋白产生ACE抑制肽研究

摘要

近年来研究发现采用某些瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株制作的发酵乳有较强的降高血压功能，主要是由于在发酵过程中，瑞士乳杆菌的蛋白水解系统分解乳蛋白产生多肽，这些多肽则对血管紧张素转移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)具有抑制作用，从而达到了降低血压的效果。本文就瑞士乳杆菌主要蛋白酶的分离纯化及其理化特性，以及它们在发酵乳制品中水解乳蛋白产生ACE抑制肽的作用进行了研究，并分离纯化了一种乳清蛋白源性的ACE抑制肽。
　　 通过对瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶(CEP)，氨肽酶N(PepN)，X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶(PepX)和肽链内切酶活性的研究，发现CEP，PepN，PepX的活性较高，于是确定CEP，PepN，PepX为研究对象。采用响应面分析法对瑞士乳杆菌发酵乳产ACE抑制肽的发酵条件进行了优化，确定了如下最适条件：接种量4％，发酵液初始pH值7.5，培养温度39℃，在此发酵条件下所得酸乳的ACE抑制活性为75.46±0.42％。用相关系数评定ACE抑制肽的活性与CEP，PepN和PepX的关系，初步推测瑞士乳杆菌CEP是水解乳蛋白产生ACE抑制肽的关键蛋白酶。
　　 采用超声波破碎瑞士乳杆菌细胞壁提取CEP，PepN和PepX。通过单因素实验和响应面分析法对瑞士乳杆菌细胞壁破碎的条件包括菌液浓度、破碎功率和破碎时间进行了研究，以PepN的活性为响应值，得到了破碎细胞壁的最佳条件：菌体浓度为0.0238g/mL的瑞士乳杆菌细胞悬液，破碎功率为300W，破碎总时间为26min(工作时间3s，间隔时间5s)。通过硫酸铵沉淀，SephacrylS-300HR层析，非变性-PAGE切胶回收蛋白纯化了瑞士乳杆菌的CEP，PepN和PepX。CEP，PepN和PepX的比酶活力分别为20.53mg/mL，43.41mg/mL，62.24mg/mL。用纯化的CEP，PepN，PepX体外水解乳蛋白以确定这三种酶与ACE抑制肽产生的关系，更进一步证实了CEP是水解乳蛋白产生ACE抑制肽的关键蛋白酶。
　　 纯化的瑞士乳杆菌CEP为单体结构，分子量为～40kDa。CEP的最适酶反应温度为33℃，最适酶反应pH为6.0。Co2+，Mg2+，Ca2+能够激活CEP的活性，Zn2+，Ni2+和EDTA能够抑制CEP的活性，表明CEP为一种金属酶。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对CEP有抑制作用，表明CEP为一种丝氨酸蛋白酶。CEP的Km为0.115mM，N端氨基酸序列为Gln-Ile-Ile-Thr-Asp-Ile-Tyr-Ala-Arg-Glu。瑞士乳杆菌PepN分子量大约为24kDa，最适酶反应pH为7.0，最适酶反应温度为37℃。Co2+对PepN活性有激活作用，Zn2+，Ni2+，Fe3+对PepN活性有强烈的抑制作用，EDTA对PepN活力也有一定的抑制作用，表明PepN为金属蛋白酶。瑞士乳杆菌的PepX分子量大约为26kDa，最适酶反应pH为7.0，最适酶反应温度为37℃。Co2+对PepX有激活作用，Zn+，Ni2+，Mn2+，Fe3+对PepX有强烈的抑制作用，EDTA对PepX也有一定的抑制作用，表明PepX为金属蛋白酶。同时，丝氨酸蛋白酶PMSF对PepX也有抑制作用，表明PepX为一种丝氨酸肽酶。
　　 采用响应面设计确定了瑞士乳杆菌蛋白粗酶水解乳清蛋白产生ACE抑制肽的最优条件。通过控制三个主要的水解条件([E]/[S]，水解pH，水解温度)改变水解产物的ACE抑制活性。实验确定了最优的水解条件，即[E]/[S](w/w)为0.006，水解pH为8.60，水解温度为38.90℃，在此条件下酶解乳清蛋白，最后水解产物的ACE抑制率为92.21士0.45％，IC50为0.975mg/mL，水解度为18.76％。采用SephadexG-75，SephadexG-15，RP-HPLC分离纯化了一种乳清蛋白源性的ACE抑制肽，该ACE抑制肽IC50为0.13mg/mL。同时采用了ESI-MS/MS对纯化的ACE抑制肽测定了氨基酸序列，氨基酸序列为Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro，是β-乳球蛋白的148-153片段。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

0前言

1研究背景

1.1乳源性ACE抑制肽的降压原理

1.2 ACE抑制肽的纯化及鉴定

1.3发酵法制备ACE抑制肽菌种选择的重要性

1.4乳酸菌蛋白水解系统

2.本课题的研究现状、目的和内容

2.1国内外关于该课题的研究现状

2.2研究目的

2.3研究内容

3.本课题的研究意义

参考文献

第2章瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶和胞内肽酶的活性研究

0前言

1材料与方法

1.1材料

1.2仪器

1.3方法

2结果与分析

2.1瑞士乳杆菌蛋白酶提取方法研究

2.2瑞士乳杆菌肽酶活力

3讨论

4.实验结论

参考文献

第3章抗ACE活性酸乳发酵条件优化及瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶、氨肽酶N、X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶对ACE抑制肽产生的影响研究

0引言

1材料与方法

1.1材料

1.2主要仪器与设备

1.3方法

2结果

2.1抗ACE活性酸乳单因素发酵条件研究

2.2抗ACE活性酸乳发酵条件响应面优化

3 讨论

3.1发酵条件对瑞士乳杆菌生长和发酵乳ACE抑制率的影响

3.2利用Box-Behnken对抗ACE活性酸乳优化发酵条件

3.3 ACE抑制活性与CEP，PepN，PepX关系研究

4结论

参考文献

第4章瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶、氨肽酶N、X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶初提条件的研究

0引言

1材料与方法

1.1材料

1.2仪器

1.3方法

2结果与分析

2.1单因素超声波破碎条件的研究

2.2超声波破碎条件的响应面优化

3讨论

4结论

参考文献

第5章瑞士乳杆菌细胞壁蛋白酶、氨肽酶N、X-脯氨酰-二肽酰基-氨基肽酶的分离纯化及酶学性质研究

0前言

1材料与方法

1.1材料

1.2主要仪器与设备

1.3实验方法

2结果与讨论

2.1 CEP，PepN和PepX的分离纯化

2.2 CEP，PepN，PepX水解乳蛋白对ACE抑制肽产生的影响

2.3酶性质研究

3讨论

3.1 CEP，PepN，PepX的分离纯化

3.2 CEP的相关研究报导

3.3 PepN的相关研究报导

3.4 PepX的相关研究报导

4结论

参考文献

第6章瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳清蛋白制备ACE抑制肽的条件优化

0前言

1材料与方法

1.1材料

1.2主要仪器与设备

1.3方法

2结果与讨论

2.1单因素条件

2.2响应面优化水解条件

3讨论

4结论

参考文献

第7章乳清蛋白源性ACE抑制肽的分离

0前言

1材料与方法

1.1材料

1.2主要仪器与设备

1.3方法

2结果与分析

2.1 Sephadex G-75分离

2.2 Sephadex G-15分离

2.3 RP-HPLC分离

2.4质谱测定肽序列

3讨论

4结论

参考文献

第8章总结

1课题的研究结论

2课题的创新点

3课题的展望

附录(缩略词)

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢