一种瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳蛋白生产抗高血压活性肽的方法

摘要

本发明涉及一种瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳蛋白生产抗高血压活性肽的方法。所说的方法是：先从瑞士乳杆菌ATCC15019中，经菌体破碎、离心、盐析、三步柱层析，分离得到瑞士乳杆菌ATCC15019蛋白酶Q；再用得到的蛋白酶Q水解乳蛋白；最后水解液经过超滤、冷冻干燥、Sephadex G－25离子交换层析、μBondasphere C

说明书

技术领域

本发明涉及食品科学和生物技术领域，具体涉及一种瑞士乳杆菌蛋白酶水解乳蛋白生产抗高血压活性肽的方法。

技术背景

降血压肽，又称为血管紧张素转化酶(Angiotensin-I-converting Enzyme，简称ACE)抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的多肽短链物质。从来源上，可分为乳蛋白(包括酪蛋白、乳清蛋白)，发酵食品，动物蛋白，植物蛋白以及天然A C E抑制肽。这些来源于食品的降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，其共同突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会有降压过度现象发生。而化学合成的降压药物(如卡托普利等)，虽然治疗高血压的效果非常明显，但其对肾脏的毒副作用，以及服药后出现低血压、干咳等症状，使人们对其安全性产生忧虑。高血压病容易引发冠心病，心肌梗塞，脑卒中和肾功能衰竭等，因此成为一个十分严重的社会公共卫生问题。

在功能众多的生物活性肽中，降血压肽因其无毒副作用的降压功能称成为活性肽研究的热点。从天然食物蛋白中分离的降血压肽，虽然降压效果不如合成药物那么强烈，但其具有安全性，并且除降血压外还往往具有免疫调节和减肥等功能。从天然食物蛋白中发现并分离出更多的短链降血压肽，一方面为后续的降血压活性检测提供了基础，同时另一方面也通过保健食品的途径预防和缓解高血压提供了方向。

在乳源蛋白方面，Mullldly等人通过C18固相提取β-乳球蛋白胰蛋白酶消化液，用20-25％乙晴洗脱得到肽物质，之后对固相提取物进行质谱分析，含有β-lgf片断(142-148)，采用3KDa和1KDa分子量截留膜可使ACE抑制肽富积。Maruyama等从牛乳酪蛋白胰蛋白酶水解物分离纯化出具有ACE抑制活性的十二肽、七肽、六肽和五肽，之后进行SHR实验，血压明显降低，第四周血压与对照组相差14mmHg左右。Abubabar等人从蛋白酶-K的干酪乳清蛋白的消化液中通过RP-HPLC分离获得6条具有抗高血压活性的肽，其中的IPA(Ile-Pro-Ala)具有很强活性。Saito等人从7种干酪中分离，得到4条具有ACE抑制活性的肽，对SHR有降压作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的制备抗高血压活性肽的方法。

本发明的方法包括以下步骤：

(1)瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC15019蛋白酶Q的分离纯化：将培养的瑞士乳杆菌ATCC15019菌体破碎后离心，收集其上清液，上清液经硫酸氨盐析后离心，取沉淀物溶于蒸馏水，再通过Sephadex G-100、Sepharose CL-6B和DEAE Sephadex A-25层析柱分离，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰，得到瑞士乳杆菌ATCC15019蛋白酶Q；

(2)蛋白酶Q水解乳蛋白：用瑞士乳杆菌ATCC15019蛋白酶Q水解乳蛋白；

(3)抗高血压肽的分离纯化：

a、先用孔径为10nm的陶瓷膜对乳蛋白水解物进行超滤以除去大分子物质，收集超滤液，冷冻干燥；

b、将上述冻干粉溶于蒸溜水，离心，收集上清液，经Sephadex G-25离子交换层析后，再经μBondasphere C₁₈(3.9×150mm)、YMC-Pack ODS-AP-303(4.6×250mm)、YSK-Octadecyl 4PW(3.9×150mm)及YMC-Pack ODS-100S(3.9×150mm)四步反相液相色谱分离，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰，制得多肽异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(Ile-Pro-Pro，IPP)和缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸(Val-Pro-Pro，VPP)。

上述步骤(2)所说的用瑞士乳杆菌ATCC15019蛋白酶Q水解乳蛋白的水解条件优选：乳蛋白液初始pH值为6.25-6.80，蛋白酶Q添加量0.10-0.20mg/mL，在40℃下水解2-4h。

在上述方法中所提及的柱层析分离和反相液相色谱分离过程中，所说的能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰，因具体操作的工艺条件的差别，如流速的不同，会使其出现的时间有所差别，但是，这对于本领域技术人员来说，是可通过结合常规的水解乳蛋白和抑制ACE活性试验而得知的。

经上述方法制得的多肽IPP和VPP，具有显著抑制ACE活性和降高血压活性；其抑制ACE活性的IC₅₀分别为5.15与9.13μM，分别以1.80mg/kg与3.60mg/kg剂量给源发性高血压老鼠灌胃，最大降压值分别达到29和25mmHg。

本发明与现有的方法相比，具有以下优点：(1)用瑞士乳杆菌ATCC15019蛋白酶Q水解乳蛋白能同时产生具有较强降高血压活性的多肽IPP和VPP，而用其它方法酶解不可能同时获得IPP和VPP；(2)用瑞士乳杆菌ATCC15019蛋白酶Q定向水解乳蛋白产生抗高血压肽比现有的发酵法产生抗高血压肽更容易控制，便于批量生产。

附图说明

图1是IPP和VPP反相色谱分离图(a-μBondasphere C₁₈，b-ODS-AP-303，c-YSK-Octadecyl 4PW，d-YMC-Pack ODS-100S；I峰VPP，II峰IPP)。

图2是高血压老鼠灌胃IPP和VPP的收缩压变化(-·-IPP，-◇-VPP)

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

活性肽制备

(1)将瑞士乳杆菌ATCC15019接种在4升MRS(0.8％的酵母粉，1.2％的蛋白胨和1.2％的葡萄糖)培养基中，在37℃下培养22小时，8000rpm×10min离心分离得菌体细胞泥，将菌体细胞反复用蒸溜水冲洗离心得菌体细胞，再将菌体细胞分散于pH为6.8-7.0的缓冲液中，200W×10min超声波破碎，破碎后的溶液经4800rpm×30min离心，收集其上清液。上清液经硫酸氨盐析，6000rpm×15min离心收集沉淀，沉淀物溶于蒸馏水中，经Sephadex G-100(洗脱液为0.04M的磷酸钠缓冲液，流速1.0mL/min，检测波长280nm)层析，分别收集各洗脱峰，将用于水解乳蛋白(pH为6.8-7.0，40℃下水解4h)，水解液用于抑制ACE活性试验；能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(155-175min之间的洗脱液)冷冻干燥后，溶于pH7.5的0.05M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，用孔经为0.2μm的过滤膜过滤，过滤液经Sepharose CL-6B(洗脱液为pH7.5的0.05MTris-HCl缓冲液，流速1.0mL/min，检测波长280nm)层析，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(181-195min之间的洗脱液)，冷冻干燥后，溶于0.02MpH7.5的磷酸缓冲液溶，用孔经为0.2μm的过滤膜过滤，过滤液经DEAE Sephadex A-25(洗脱液为0.02MpH7.5的磷酸缓冲液溶，流速1.0mL/min，检测波长280nm)凝胶柱层析，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(176-187min之间的洗脱液)，冷冻干燥制得瑞士乳杆菌ATCC15019蛋白酶Q。

(2)取牛乳，6000rpm×10min离心脱脂，脱脂乳在90℃杀菌15min，将其pH调整到6.60，冷却到40℃后，按0.12mg/mL的剂量加入蛋白酶Q，在40℃下水解4h，得水解液；

(3)用孔径为10nm的陶瓷膜对乳水解物进行超滤以除去大分子物质，收集超滤液，冷冻干燥；再将上述得到的冻干粉溶于蒸溜水，5000rpm×15min离心，收集上清液，经Sephadex G-25凝胶层析(洗脱液为pH9.0的0.30mol/LNH₄AC，流速为1mL/min，检测波长为220nm)，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(56-64min之间的洗脱液)，冷冻干燥后，再经下述四步反相高压液相色谱分离精制得抗高血压活性肽IPP和VPP：首先，通过μBondasphere C₁₈(3.9×150mm)色谱柱分离，洗脱液A为乙腈∶水∶三氧乙酸(100∶900∶1，V/V)，洗脱液B为乙腈∶水∶三氧乙酸(900∶100∶1，V/V)，采用梯度洗脱法，在0～40min洗脱时间内，B液浓度从0％上升至45％，在41～70min洗脱时间内，B液浓度从45％升至75％，在71～90min洗脱时间内，B液浓度从75％升至100％，各价段洗脱液的流速均为1.0mL/min，检测波长为220nm，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(21-26min之间的洗脱液)，冷冻干燥；第二步，将上述冻干粉溶于A洗脱液，通过YMC-Pack ODS-AP-303(4.6×250mm)色谱柱分离，洗脱液、洗脱梯度、洗脱液流速及检测波长均同第一步，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(24-33min之间的洗脱液)，冷冻干燥；第三步，将上述冻干粉溶于A洗脱液，再经YSK-Octadecyl 4PW(3.9×150mm)色谱柱分离，洗脱液、洗脱梯度、洗脱液流速及检测波长均同第一步，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(24-29min之间的洗脱液)，冷冻干燥；第四步，将上述冻干粉溶于A洗脱液，经YMC-Pack ODS-100S(3.9×150mm)色谱柱分离，洗脱液A为乙腈∶水∶三氟乙酸(100∶900∶1，V/V)，洗脱液B为乙腈∶水∶三氟乙酸(900∶100∶1，V/V)；B液洗脱梯度如下，在0～45min洗脱时间内，浓度从0％升至40％，在46～75min洗脱时间内，浓度从41％升至70％，在76～90min洗脱时间内，浓度从71％升至100％，洗脱液流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，收集能水解乳蛋白产生抗ACE活性的洗脱峰(20-22min及23-25min之间的洗脱液)，冷冻干燥，制得具有显著抑制ACE活性和降高血压活性的多肽VPP和IPP。

将上述制得的VPP和IPP进行以下实验，验证其抑制ACE活性和降高血压活性。

抑制ACE活性实验：采用Cushman等的方法。用含有0.3M NaCl的0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.3)将Hip-His-Leu配成5.0mM的溶液。在10mL试管中分别加入200μL的5mM Hip-His-Leu溶液和80μL的含有多肽的水解液(或溶于蒸馏水的多肽溶液)，于37℃下保温3分钟后，再加入20μL ACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.1μ/mL)，混匀后在37℃下保温30分钟，再加入250μL的1.0N的盐酸溶液以终止反应，再加入1.7mL醋酸乙酯，经15秒种振荡混匀后，静置5分钟，用移液管吸取1.0mL的醋酸乙酯层，真空冷冻干燥后，加入1.0mL蒸馏水，混匀后在228nm处测定吸光度。在上述条件下，抑制50％的ACE活性(IC₅₀)为样品的一个活性单位。

ACE抑制率＝[(B-A)/(B-C)]×100％

其中A为含有多肽的水解液(或溶于蒸馏水的多肽溶液)和ACE溶液的吸光度；B为不含有多肽的水解液(或溶于蒸馏水的多肽溶液)样品，但含有ACE溶液的吸光度；C为含蒸馏水，但不含ACE溶液的吸光度。

经验证，IPP和VPP抑制ACE活性的IC₅₀分别为5.15与9.13μM。

降高血压活性实验：将原发性高血压老鼠(购买于中国科学院上海实验动物中心上海斯莱克动物有限公司)按体重随机分为以下三组：对照组、IPP1.80毫克/千克体重/天、VPP3.60毫克/千克体重/天剂量组，每组10只(雌雄各5只)，单笼饲养，自由进食和饮水，多肽按剂量溶于0.2mmol/L的磷酸缓冲液中(pH7.2)，灌胃3天，灌胃体积为1.0mL/只，每天一次，连续灌胃3天，每次灌胃结束后2、4、6、8、10、12和24h，分别测定原发性高血压老鼠的尾动脉收缩压(Systolic blood pressure，SBP)，按Furushiro等的方法，在测定收缩压前，将老鼠在32±5℃的条件下保温5min再测定，每次重复测3次，取平均埴。结果如图2所示，最大降压值分别达到29和25mmHg。