利用甘露糖基转移酶抑制剂有效生产异源蛋白质

摘要

本发明描述了用于生产具有降低的O-联糖基化数量的蛋白质组合物的化合物和方法。所述方法包括在存在Pmt介导的O-联糖基化的某些亚苄基噻唑烷二酮抑制剂的条件下培养的细胞中产生所述蛋白质。

说明书

背景技术

糖蛋白在人和其它哺乳动物中调节许多必需功能，包括催化作用、信号转导、细胞间通讯以及分子识别和缔合。在真核生物中，糖蛋白构成了非胞质蛋白质的的主要部分(Lis和Sharon，1993，Eur.J.Biochem.218：1-27)。已开发了许多糖蛋白用于治疗目的。在最近二十年间，天然发生的糖蛋白的重组形式已成为生物技术工业的主要部分。用作治疗剂的重组糖基化蛋白质的实例包含红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAbs)、组织纤维酶原激活物(tPA)、干扰素-β(IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人绒毛膜促性腺素(hCH)(Cumming等人，1991，Glycobiology 1：115-130)。随着作为潜在的预防剂和治疗剂而产生的重组蛋白质接近临床应用，重组产生的糖蛋白的糖基化模式的变化近来已成为备受科学界关注的主题。

一般地，糖蛋白寡糖的糖基化结构根据用来产生它们的细胞的宿主物种而变化。非人宿主细胞产生的治疗性蛋白质很可能含有非人糖基化，可能引起人的免疫原性反应，例如酵母中的超甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymol.185：440-470)、植物中的α(1，3)海藻糖和β(1，2)-木糖(Cabanes-Macheteau等人，1999.Glycobiology，9：365-372)、中国仓鼠卵巢细胞中的N-乙酰神经氨酸(Noguchi等人，1995.J.Biochem.117：5-62)和小鼠中的Galα-1，3Gal糖基化(Borrebaeck等人，1993，Immun.Today，14：477-479)。在动物细胞中与蛋白质结合的糖链(carbonydrate chains)包含与该蛋白质天冬酰胺(Asn)残基结合的N-糖苷键型糖链(也称为N-聚糖；或N-联糖基化)和与该蛋白质丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基结合的O-糖苷键型糖链(也称为O-聚糖；或O-联糖基化)。

因为非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的寡糖结构倾向于更接近人糖蛋白的寡糖结构，所以大多数商用糖蛋白是哺乳动物细胞产生的。但是，哺乳动物细胞作为产生蛋白质的宿主细胞具有几个重要的缺点。除了费用高之外，哺乳动物细胞产生蛋白质的过程产生糖形异质群、具有低的体积滴度、并需要进行性的病毒抑制和相当长的时间来产生稳定的细胞系。

充分认识到的是蛋白质上的具体糖形可能深刻地影响蛋白质的性质，包括它的药物代谢动力学、药物动力学、受体相互作用和组织特异性靶向性质(Graddis等人，2002.Curr Pharm Biotechnol.3：285-297)。例如，已经显示了Ig的不同糖基化模式与不同生物学性质相关(Jefferis和Lund，1997，Antibody Eng.Chem.Immunol，65：111-128；Wright和Morrison，1997，Trends Biotechnol.，15：26-32)。进一步已经显示了糖蛋白的半乳糖基化可随细胞培养条件而变化，可使一些糖蛋白组合物产生免疫原性，这取决于糖蛋白上的具体半乳糖模式(Patel等人，1992.Biochem J.285：839-845)。但是，因为还不知道哪种具体糖形(或多种糖形)产生所希望的生物学功能，所以非常需要在糖蛋白上富集具体糖形的能力。因为不同糖形与不同生物学性质相关，富集具有具体糖形的糖蛋白的能力可用于阐明糖蛋白的具体糖形与该糖蛋白具体生物学功能之间的关系。另外，富集具有具体糖形的糖蛋白的能力能够产生具有具体特异性的治疗性糖蛋白。因此，非常需要产生具体糖形富集的糖蛋白组合物。

虽然N-联糖基化的途径已成为许多分析的对象，但是O-联糖基化的过程和功能还没有很好地理解。但是，已知的是，与N-联糖基化不同，O-糖基化是发生在顺面高尔基体中的翻译后事件(Varki，1993，Glycobiol.，3：97-130)。尽管看上去对于O-联糖基化不存在类似N-联糖基化的共有受体序列，但是几种糖蛋白大量O-联糖基化位点周围的氨基酸序列比对显示：在相对于糖基化残基的-1和+3位脯氨酸残基的频率增加，以及丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸残基的明显增加(Wilson等人，1991，Biochem.J.，275：529-534)。在糖蛋白中丝氨酸和苏氨酸残基的延伸也可能是O-糖基化的潜在位点。

在O-联糖基化中发挥作用的一个基因家族是编码Dol-P-Man：蛋白质(Ser/Thr)甘露糖基转移酶(Pmt)的基因。在高等真核生物例如人、啮齿动物、昆虫等和低等真核生物例如真菌等中已鉴定出这些高度保守的基因。酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)编码最多七个编码Pmt同源物的PMT基因(在Wilier等人Curr.Opin.Struct.Biol.2003 Oct；13(5)：621-30中综述)。在酵母中，通过七个O-甘露糖基转移酶基因之一在内质网中将起始甘露糖从多萜醇磷酸甘露糖添加到新生糖蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上来启动O-联糖基化。尽管在酵母中出现七个编码Pmt同源物的PMT基因，但是在酵母中分泌型真菌和异源蛋白质的O-甘露糖基化主要依赖PMT1和PMT2基因以及它们各自编码的蛋白产物Pmt1和Pmt2，这在各物种中是高度保守的，Pmt1和Pmt2看起来作为异源二聚体发挥作用。

Tanner等人在美国专利号5,714,377中描述了酿酒酵母的PMT1和PMT2基因，以及生产具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质的方法，该方法利用PMT基因中的一个或多个已被基因修饰的真菌细胞来产生具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质。

Ng等人在美国公开的专利申请号20020068325中公开了通过利用反义或共抑制或者通过酵母宿主菌株的工程化来抑制O糖基化，所述酵母宿主菌株具有与O-联糖基化相关基因的功能丧失突变，具体地是一个或多个PMT基因的功能丧失突变。

UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰基半乳糖胺基-转移酶(GalNAc-转移酶)参与在高等真核生物中发现的黏蛋白型O-联糖基化。这些酶启动蛋白质中具体的丝氨酸和苏氨酸氨基酸的O-糖基化，这是通过将N-乙酰半乳糖胺添加到这些氨基酸的羟基上来进行的，然后甘露糖残基可以分步的方式添加。Clausen等人在美国专利号5,871,990和美国公开的专利申请号20050026266中公开了编码UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰基半乳糖胺基-转移酶(GalNAc-转移酶)的核酸家族。Clausen在美国公开的专利申请号20030186850中公开了GaINAc-β-苄基选择性地抑制多肽GalNAc-转移酶的凝集素的用途，并且GaINAc-β-苄基不用作参与O-聚糖生物合成的其它糖基转移酶的底物，从而抑制O-糖基化。

O-联糖基化抑制剂已被描述。例如，Orchard等人在美国专利号7,105,554中描述了亚苄基噻唑烷二酮及其作为抗霉剂例如抗真菌剂的用途。已报道这些亚苄基噻唑烷二酮抑制Pmt1酶，阻止O-联甘露糖蛋白的形成并破坏真菌细胞壁的完整性。最终结果是细胞肿胀并最终经破裂而死亡。

Konrad等人在美国公开的专利申请号20020128235中公开了通过药理学抑制组织或细胞中的O-联蛋白糖基化来治疗或预防糖尿病的方法。该方法依靠用结合O-连接的N-乙酰葡糖胺转移酶从而抑制O-联糖基化的(Z)-1-[N-(3-铵基丙基)-N-(正丙基)氨基]二氮烯--1，2-二醇盐或其衍生物来治疗糖尿病个体。

Kojima等人在美国专利号5,268,364中公开了利用化合物例如苄基-α-N-乙酰半乳糖胺抑制O-糖基化的治疗性组合物，所述苄基-α-N-乙酰半乳糖胺抑制O-糖基化的延伸，引起O-α-GalNAc积累，来阻断白细胞或肿瘤细胞的SLex或SLea的表达，从而抑制这些细胞对内皮细胞和血小板的粘附。

Boirae等人的美国专利号6,103,501公开了激素变体，其中通过修饰糖基化位点的氨基酸序列来改变O-联糖基化。

本发明涉及Pmt蛋白质的新型抑制剂，用于产生O-联糖基化降低的重组蛋白质。这将使从真菌和酵母细胞产生的蛋白质的O-联糖基化得以控制。

发明概述

本发明描述了生产具有降低的O-联糖基化数量的蛋白质组合物的化合物和方法。所述方法包括在存在Pmt介导的O-联糖基化的某些亚苄基噻唑烷二酮抑制剂的条件下培养的细胞中产生所述蛋白质。

附图简述

图1图示了包括实施例4所示新型抑制剂在内的Pmt抑制剂对巴斯德毕赤氏酵母中分泌型重组单克隆抗体O-糖基化的作用。Pmt的化学抑制剂以剂量依赖方式降低O-糖基化。利用抗人H+L抗体的免疫印迹用于检测在用逐渐增加量的Pmt抑制剂(左侧道剂量较高)处理的菌株的生长培养基中的重链(Hc)和轻链(Lc)。迁移最慢的条带(用星号标记)表示O-糖基化的Hc，用Pmt抑制剂处理可使所述O-糖基化的Hc消除。

发明详述

本发明提供了在特定宿主细胞中表达对O-联糖基化敏感的重组蛋白质(包括多肽和糖蛋白)的新型化合物和方法，在该细胞类型中具有降低的O-联糖基化数量(包括没有O-联糖基化)。该方法涉及在蛋白质的表达被诱导之时，在存在本发明的一种或多种新型化合物与任选的如Bobrowicz等人在美国公开的申请号2007061631中所述的一种或多种α1，2-甘露糖苷酶的条件下，在宿主细胞中诱导感兴趣的蛋白质的表达，在所述宿主细胞中所述蛋白质对于O-联糖基化是敏感的；所述本发明的新型化合物是一种或多种Dol-P-Man：蛋白质(Ser/Thr)甘露糖基转移酶(Pmt)蛋白活性的抑制剂，所述Dol-P-Man：蛋白质(Ser/Thr)甘露糖基转移酶(Pmt)蛋白参与细胞中甘露糖向所述蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上的转移。与如果缺乏抑制剂时产生的蛋白质上存在的O-联糖基化的量相比，在存在抑制剂的条件下表达的蛋白质具有降低的O-联糖基化数量。该方法是特别有用的，因为它提供了在宿主细胞例如低等真核生物，例如酵母和细菌中产生治疗相关的蛋白质的手段，其中期望的是所述蛋白质具有降低的O-糖基化数量，所述宿主细胞本应正常地产生具有O-联聚糖的蛋白质，但现在产生具有降低数量的O-联聚糖的蛋白质。但是，尽管该方法特别适于在低等真核生物中表达具有降低的O-联糖基化的蛋白质，该方法也可在高等真核生物和细菌中实施。

本发明的Pmt抑制剂选自以下组或其盐：

对于在蛋白质对O-联糖基化敏感的宿主细胞中产生具有降低的O-联糖基化的蛋白质，所述方法与某些现有技术相比有所改进。例如，Tanner等人在美国专利号5,714,377中描述了利用真菌细胞例如酵母细胞产生具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质的方法，其中编码Pmt蛋白质的一种或多种PMT基因被基因修饰，从而产生具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质。虽然在真菌宿主细胞中PMT1、PMT2或PMT4基因的缺失能够在真菌宿主细胞中产生具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质，但是PMT基因的表达对宿主细胞生长是重要的，任何一个单独缺失还对真菌宿主细胞的生长能力产生不利影响，因此使它很难产生足够数量的宿主细胞或具有降低的O-联糖基化数量的重组蛋白质。PMT2加上PMT1或PMT4中任意一方的缺失对真菌宿主细胞看起来是致死的。因此，宿主细胞中PMT基因的基因消除看起来是产生具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质的不期望的方法。

相反，在本发明的方法中使用的宿主细胞中PMT基因未被修饰或缺失，能够使宿主细胞O-糖基化那些对细胞生长重要的蛋白质，直到Pmt蛋白质的活性被抑制。一般地，这使宿主细胞能够生长到高于如果PMT基因缺失而得到的水平。另外，在具体实施方式中，重组蛋白质在宿主细胞中的表达被诱导型启动子控制，宿主细胞中的Pmt活性直到重组蛋白质的表达被诱导时才被抑制。这能够在诱导重组蛋白质表达和添加Pmt抑制剂之前产生大量宿主细胞，所述宿主细胞含有编码将在培养基中产生的重组蛋白质的核酸。与缺失一种或多种PMT基因以及在培养中不良生长的宿主细胞所发生的情况相比，这允许在更短的时间内在培养物中产生更大数量的具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质。

基于实施例5所示的增加的效价，本文所述的Pmt抑制剂与之前Orchard等人(美国专利号7,105,554)和Bobrowicz等人(美国公开的申请号2007061631)所述的抑制剂相比有改进。增加的效价允许使用较少量的抑制剂就可将真菌O-糖基化降低到可接受的水平和/或增加完全消除O-聚糖的可能性。

本文所述方法促进在宿主细胞中产生具有降低的O-联糖基化的糖蛋白，所述宿主细胞已被基因修饰以产生主要具有特定的N-联聚糖结构的糖蛋白而且还O-糖基化糖蛋白。产生主要具有特定N-联糖形的各种糖蛋白的方法已在美国专利号7,029,872以及美国公开的申请号20050170452、20050260729、20040230042、20050208617、20050208617、20040171826、20060160179、20060040353和20060211085中公开。利用本文所公开的方法，前述专利和专利申请所述的任何一种宿主细胞均可用于产生主要具有特定N-联聚糖结构并具有降低的O-联糖基化的糖蛋白。已发现一些已被基因修饰来产生主要具有特定N-联聚糖结构的糖蛋白的宿主细胞在特定条件下不如未修饰的宿主细胞生长良好。例如，已缺失参与超甘露糖基化的基因且已添加产生特定哺乳动物或人样N-联聚糖结构所需要的其他基因的特定真菌和酵母细胞不如未进行基因修饰的真菌或酵母细胞生长良好。在这些基因修饰的真菌或酵母细胞的某些中，进一步导入PMT基因的缺失对细胞是致死的或对细胞在培养物中生长到足够数量的能力产生不利影响。本文的方法通过在诱导重组糖蛋白表达和添加Pmt蛋白质活性的抑制剂与任选的一种或多种α1，2-甘露糖苷酶之前，允许细胞生长到足够数量，从而避免了缺失PMT基因的可能的有害作用，产生主要具有特定N-联聚糖结构和降低的O-联糖基化的重组糖蛋白。

本文所述方法的一方面是它提供了包含降低的O-联糖基化并主要具有特定N-联糖形的糖蛋白组合物，其中相对于哺乳动物细胞培养物例如CHO细胞产生的相同的糖蛋白组合物，该重组糖蛋白可显示升高的生物活性和/或降低的不期望的免疫原性。产生包含降低的O-联糖基化和主要具有N-联糖形的糖蛋白组合物的另一优势是它避免了产生不期望的或无活性的糖形和异质混合物，这些物质可能诱导不期望的效果和/或稀释更有效的糖形。因此，主要包含例如Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形并具有降低的O-联糖基化的糖蛋白分子的治疗性药物组合物可能在更低剂量下非常有效，因此具有更高效力/效价。

一般地，产生具有降低的O-联糖基化的蛋白质的方法包括用编码重组蛋白质或异源蛋白质的核酸转化宿主细胞，其中期望的是产生具有降低的O-联糖基化的蛋白质。编码该重组蛋白质的核酸可操作地连接到调节序列，该调节序列可使重组蛋白质表达。这样的调节序列包含诱导型启动子，任选地包含在编码该融合蛋白的核酸上游或5′的增强子，以及在编码该重组蛋白质的核酸3′或下游的转录终止位点。核酸还通常编码具有核糖体结合位点的5′UTR区和3′非翻译区。该核酸通常是载体的一部分，该载体在表达重组蛋白质的细胞中是可复制的。载体也可以含有标记物以允许识别转化的细胞。但是，某些细胞类型，特别是酵母，可以用缺乏外来载体序列的核酸成功地转化。

编码期望的重组蛋白质的核酸可以从多种来源获得。可以利用针对保守区的引物从已知表达该蛋白质的细胞系扩增cDNA序列(参见，例如，Marks等人，J.MoI.Biol.581-596(1991))。也可以根据科学文献中的序列从头合成核酸。也可以通过跨越期望序列的重叠寡核苷酸的延伸来合成核酸(参见，例如Caldas等人，Protein Engineering，13，353-360(2000)).

一方面，编码蛋白质的核酸与诱导型启动子可操作地连接，所述启动子使得蛋白质的表达在期望时被诱导。另一方面，编码蛋白质的核酸与组成型启动子可操作地连接。为了便于分离表达的蛋白质，目前优选的是，蛋白质包括信号序列，所述信号序列引导蛋白质分泌到细胞培养基中，然后蛋白质在那里可被分离。第一方面，在向培养基添加Pmt介导的O-联糖基化的一种或多种抑制剂之前，将转化的宿主细胞培养足够的时间来产生期望的大量宿主细胞，所述期望的大量宿主细胞足以产生期望数量的蛋白质。诱导物和抑制剂可以同时添加到培养物中，或者在添加一种或多种Pmt抑制剂之前向培养物添加诱导物，或者在添加诱导物之前向培养物添加一种或多种Pmt抑制剂。产生具有降低的O-连接的糖基化的诱导的蛋白质，并可以从培养基中回收，或者对于不具有信号序列的蛋白质，可以通过裂解从宿主细胞中回收。第二方面，其中编码蛋白质的核酸与组成型启动子可操作地连接，在培养物建立的同时向培养基中添加Pmt介导的O-联糖基化的一种或多种抑制剂，产生的具有降低的O-连接的糖基化的蛋白质可以从培养基中回收，或对于不具有信号序列的蛋白质，可以通过裂解从宿主细胞中回收。

本文描述了抑制一种或多种Pmt蛋白质的活性，用于产生具有降低的O-联糖基化的蛋白质的化学物质或组合物。当宿主细胞是低等真核生物例如真菌或酵母时，期望的是所述抑制剂抑制至少Pmt1或Pmt2、或这两者的活性。在高等真核生物中，期望的是所述抑制剂抑制该高等真核生物中相应于Pmt1或Pmt2的同源物的活性。

本发明的化合物显示在具有完整的功能性PMT基因的巴斯德毕赤氏酵母中有效地产生具有降低的O-联糖基化的重组蛋白质。实施例5的表1和图1显示上述四种Pmt化学抑制剂的任何一种在重组蛋白质的表达被诱导时添加到重组巴斯德毕赤氏酵母的培养物中，所述重组巴斯德毕赤氏酵母具有完整的功能性PMT基因并用与可诱导启动子可操作地连接的编码重组人抗Her2抗体蛋白的核酸转化，相对于用Orchard等人(Bioorgan & Med Chem Letters(2004)14：3975-3978)和包括EP 1313471 B1在内的相同作者的专利公开以及Bobrowicz等人的美国公开的申请号2007061631中所述的Pmt抑制剂Pmti-3处理巴斯德毕赤氏酵母细胞所见的O-联糖基化水平，产生了具有降低的O-联糖基化水平的重组蛋白质。

宿主细胞

本文所用术语“细胞”是指如下所述的宿主细胞。虽然用于本文方法的宿主细胞包括高等真核生物细胞和低等真核生物细胞，但是低等真核生物细胞例如丝状真菌或酵母细胞目前对于蛋白质的表达是优选的，因为它们可以被经济地培养，得到高产量的蛋白质，当适当地修饰时能够产生具有适合的糖基化模式的蛋白质。低等真核生物包括酵母、真菌、具领鞭毛虫、微孢子虫、alveolates(例如甲藻)、stramenopiles(例如褐藻、原生动物)、红藻门(例如红藻)、植物(例如绿藻、植物细胞、苔藓)和其他原生生物。酵母和真菌包括但不限于：毕赤氏酵母属(例如巴斯德毕赤氏酵母、Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母(Pichia trehalophila)、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、耐热毕赤氏酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤氏酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母(Pichia pijeri)、具柄毕赤氏酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤氏酵母(Pichia methanolica))、酵母属(例如酿酒酵母)、多形汉逊酵母(Hansenulapoly morpha)、克鲁维酵母属(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))、白色念珠菌(Candida albicans)、曲霉属(例如构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae))、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌属(例如Fusarium gramineum、Fusarium venenatum)，小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。特别地，酵母是目前优选的，因为酵母提供了确定的遗传学，可进行快速转化、测试的蛋白质定位策略、以及方便的基因敲除技术。适合的载体具有表达控制序列，例如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，以及所期望的复制起点、终止序列等等。

各种酵母，例如乳酸克鲁维酵母、巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤氏酵母和多形汉逊氏酵母对于细胞培养是目前优选的，因为它们能够生长到高细胞密度并分泌大量的重组蛋白质。同样地，丝状真菌，例如黑色曲霉、镰刀菌属、粗糙脉孢菌(Neurospora crass)等等可用于以工业规模产生重组蛋白质。

低等真核生物，特别是丝状真菌和酵母，可被基因修饰，以使它们表达蛋白质或糖蛋白，该蛋白质或糖蛋白中的糖基化模式是人样的或人源化的。这可以通过消除选定的内源糖基化酶和/或提供外源酶来实现，如Gerngross等人在美国专利号US7029872中，以及美国公开的专利申请号20040018590、20050170452、20050260729、20040230042、20050208617、20040171826、20050208617、20060160179、20060040353和20060211085中所描述的。因此，宿主细胞可以另外地或可选择地被工程化来表达一种或多种酶或酶活性，其能够以高产量产生特定的N-聚糖结构。这样的酶可以例如通过通常不与所述酶相关的信号肽的方式被靶向到宿主亚细胞器，在该亚细胞器中所述酶将具有最佳活性。宿主细胞也可以被修饰来表达糖核苷酸转运蛋白和/或核苷酸二磷酸酶(diphosphatase enzyme)。通过在合适的区室中提供糖基化酶的合适底物、降低竞争性产物抑制作用、并促进二磷酸核苷的消除，转运蛋白和二磷酸酶改进了工程化的糖基化步骤的效力。参见，例如Gerngross等人在美国公开的专利申请号20040018590，Hamilton，2003，Science 301：1244-46以及上述美国专利和专利申请。

举例来说，宿主细胞(例如，酵母或真菌)可以被选择或工程化来耗尽1，6-甘露糖基转移酶活性，其将甘露糖残基另外添加到糖蛋白的N-聚糖上，以及进一步包括用于α-1，2甘露糖苷酶活性的异位表达的核酸，这能够产生具有大于30摩尔百分比的Man₅GlcNAc₂ N-聚糖的重组糖蛋白。当根据本文所述方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有Man₅GlcNAc₂ N-聚糖结构结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在进一步的方面，所述宿主细胞被工程化以进一步包含用于GlcNAc转移酶I活性的异位表达的核酸，这能够产生主要具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖的糖蛋白。当根据本文所述方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有GlcNAcMan₅GlcNAc₂ N-聚糖结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在再进一步的方面，所述宿主细胞被工程化以进一步包含用于甘露糖苷酶II活性的异位表达的核酸，这能够产生主要具有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖结构的糖蛋白。当根据本文所述方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有GlcNAcMan₃GlcNAc₂ N-聚糖结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在再进一步的方面，所述宿主细胞被工程化以进一步包含用于GlcNAc转移酶II活性的异位表达的核酸，这能够产生主要具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖结构的糖蛋白。当根据本文所述方法在宿主细胞中产生糖蛋白时，所述宿主细胞将产生主要具有GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ N-聚糖结构、以及与在另外的细胞中产生的糖蛋白相比降低的O-糖基化的糖蛋白。在再进一步的方面，上述宿主细胞可以通过以任意组合进一步包含参与N-联糖基化的一种或多种高等真核生物基因被进一步工程化来产生特定的杂交或复合的N-聚糖或人样N-聚糖结构，所述基因编码例如唾液酰基转移酶活性、II类和III类甘露糖苷酶活性、GlcNAc转移酶II、III、IV、V、VI、IX活性、和半乳糖转移酶活性。目前优选的是，所述细胞进一步包含编码UDP特异性二磷酸酶活性、GDP特异性二磷酸酶活性和UDP-GlcNAc转运蛋白活性的一种或多种核酸。

植物和植物细胞培养物可以用于表达本文教导的具有降低的O-联糖基化的蛋白质和糖蛋白(参见，例如，Larrick和Fry，1991，Hum.Antibodies Hybridomas 2：172-89)；Benvenuto等人，1991，Plant MoI.Biol17：865-74)；Durin等人，1990，Plant MoI.Biol.15：281-93)；Hiatt等人，1989，Nature 342：76-8)。优选的植物宿主包括例如拟南芥(Arabidopsis)、红花烟草(Nicotiana tabacum)、黄花烟草(Nicotiana rustica)和马铃薯(Solarium tuberosum)。

昆虫细胞培养物也可以用于产生本文教导的具有降低的O-联糖基化的糖蛋白蛋白质和糖蛋白，例如基于杆状病毒的表达系统(参见，例如，Putlitz等人，1990，Bio/Technology 8：651-654)。

虽然目前不像低等真核生物和原核生物那样经济地培养，哺乳动物组织细胞培养物也可以用于表达和产生本文教导的具有降低的O-联糖基化的蛋白质和糖蛋白(参见Winnacker，From Genes to Clones(VCH Publishers，NY，1987)。适合的宿主包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞，优选的骨髓瘤细胞系等等，或转化的B细胞或杂交瘤。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子(Queen等人，1986 I，mmunol.Rev.89：49-68)和必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸位点和转录终止子序列。表达控制序列是来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等等的启动子。一般地，可选择的标记例如neoR表达盒包含在表达载体中。

编码要表达的蛋白质的核酸可以通过常规方法转移到宿主细胞中，其根据细胞宿主的种类而变化。例如，磷酸钙处理、原生质体融合、自然孵育、脂转染、生物射弹、基于病毒的转导或电穿孔可以用于细胞宿主。钨颗粒弹丸转基因对于植物细胞和组织是优选的(一般地参见Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，1982))。

一旦被表达，具有降低的O-联糖基化的蛋白质或糖蛋白可以根据本领域的标准方法来纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等等(一般地，参见Scopes，R.，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，1982))。对于药物用途，至少约90到95％的均质性的基本上纯的糖蛋白是优选的，98到99％或更高的均质性是最优选的。一旦被纯化，如部分地纯化或纯化到所期望的均质性，所述蛋白质可以治疗性使用(包括体外地(extracorporeally))，或在开发或进行分析步骤、免疫荧光法染色等等方面使用(一般地，参见Immunological Methods，VoIs.I and II(Lefkovits and Pernis，eds.，Academic Press，NY，1979 and 1981)。

因此，进一步提供的是糖蛋白组合物，其包含主要种类的N-聚糖结构，并且与在没有Pmt介导的O-联糖基化的抑制剂或α-1，2-甘露糖苷酶或这两者的条件下孵育的宿主细胞中产生的糖蛋白的组合物相比，具有降低的O-联糖基化，所述α-1，2-甘露糖苷酶能够从聚糖结构上修饰多于一个的甘露糖残基。在具体的方面，所述糖蛋白组合物包含具有选自Man₅GlcNAc₂、Man₃GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、Gal(GlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、(GalGlcNAc)₂Man₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂、NANA₂Gal₂GlcNAcMan₃GlcNAc₂和GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂糖形的主要N-聚糖结构的糖蛋白。

药学组合物

具有降低的O-联糖基化的蛋白质和糖蛋白可以被掺入到药物组合物中，所述药物组合物包含作为活性治疗性试剂的糖蛋白和多种其他药学上可接受的成分(参见Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。优选的形式取决于施用和治疗应用的预期方式。根据所需的制剂，组合物也可以包含药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不影响组合的生物学活性。这些稀释剂的实例是蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、Ringer′s溶液、葡萄糖溶液和Hank′s溶液。此外，药物组合物或制剂也可以包括其他载体、佐剂、或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等等。

用于肠胃外施用的药物组合物是无菌的、基本上等渗的、无热原的，并根据FDA或类似机构的GMP来制备。糖蛋白可以作为物质在生理学可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液的可注射剂量来施用，其具有可以是无菌液体例如水油、盐水、甘油或乙醇的药物载体。另外，辅助剂物质，例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等等可以存在于组合物中。药物组合物的其他组分是石油、动物、植物或合成来源的那些物质，例如，花生油、豆油和矿物油。一般地，二醇例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液。糖蛋白可以储库注射或植入物制品的形式施用，其可以允许活性成分持续释放的方式来配制。通常地，将组合物制备成可注射的，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备成在注射之前适合溶解于或悬浮于液体媒介物的固体形式。制品还可以乳化或密封在脂质体或微粒中，例如聚交酯、聚乙交酯或共聚物，用于增强的佐剂效果，如以上讨论的(参见Langer，Science 249，1527(1990)和Hanes，Advanced Drag Delivery Reviews 28，97-119(1997)。

术语“或其盐”是指由可接受的碱制备的盐，所述碱包含无机或有机碱。源自无机碱的盐包含铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠、锌盐等。固体形式的盐可以多于一种的晶体结构存在，也可以是水合物的形式。源自碱的盐包含伯、仲和叔胺，包含天然取代胺的取代胺，环胺，以及碱性离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡碱、胆碱、N，N′-二苄基亚乙基-二胺、二乙基胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺(glucamine)、氨基葡糖(glucosamine)、组氨酸、哈胺(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等的盐。

本发明的化合物可含有一个或多个不对称中心，并可因此出现消旋体和消旋混合物、单一对映体、非对映体混合物和单个非对映体。本发明的意思是包括这些化合物的所有这些异构形式。

除非本文另外定义，与本发明关联使用的科学和技术术语和短语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步的，除非上下文另外需要，单数的术语应当包括复数，复数的术语应当包括单数。一般地，相关使用的命名，以及本文所述生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域公知和通常使用的。本发明的方法和技术一般地根据本领域公知的常规方法以及如本说明书中引证和讨论的各种一般的和更具体的参考文献的描述进行，除非另有说明。参见，例如，Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to 2002)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)；Taylor和Drickamer，Introduction to Glycobiology，Oxford Univ.Press(2003)；Worthington Enzyme Manual，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol I，CRC Press(1976)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol II，CRC Press(1976)；Essentials of Glycobiology，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1999)。

以下实施例提供制备本发明各种Pmt抑制剂的方法。

实施例1

步骤A

向1-1(5.90g，25mmol)的THF(200mL)溶液中分批加入NaH(2.0g，50mmole)。将得到的混合物在0℃搅拌半小时。然后将NBS(4.86g，27.5mmol)加入其中并搅拌15分钟。过滤白色固体，浓缩滤液得到残余物，将其溶于CHCl₃并用Na₂SO₄干燥。蒸发溶剂，得到1-2(5g，产率63％)，无需进一步纯化用于下一步骤。

步骤B

向1-2(1.8g，6mmol)和1-3(1.3g，5mmol)的干燥的DMF(5mL)溶液中加入NaH(2.4g g，10mmol)，然后在室温搅拌过夜。将得到的混合物在水和EtOA之间分配。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。通过制备型TLC纯化残余物，得到1-4(800mg，产率40％)。¹H-NMR(400MHz，CDCl3)δ9.66(s，1H)，7.74～7.71(m，2H)，7.49～7.46(m，1H)，7.37～7.33(m，5H)，7.20(d，J＝2.02Hz，1H)，6.97～6.92(m，3H)，4.28～4.19(m，6H)，3.16(t，J＝6.6Hz，2H)，1.11(m，6H).

步骤C

在0℃，向LAH(380mg，10mmol)的THF(50mL)悬浮液中加入1-4(1.3g，2.6mmol)，将得到的混合物在室温搅拌30分钟。将混合物用稀释的HCl水溶液小心处理，然后在水和EtOA之间分配。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。通过制备型TLC纯化残余物，得到1-5(260mg，20％产率)。

步骤D

向1-5(300mg，0.54mmol)的2，2-二甲氧基丙烷(1mL)溶液中加入催化量的TsOH.H₂O(～10mg)，然后将得到的混合物在室温搅拌一小时。通过制备型TLC直接纯化混合物，得到1-6(100mg，产率28％)。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δppm 7.52(d，J＝8.05Hz，2H)，7.40～7.15(m，5H)，6.90～6.85(m，2H)，6.80～6.75(m，2H)，4.25(s，2H)，4.23(m，6H)，3.0(m，2H)，1.48(t，6H).

步骤E

向1-6(100mg，0.22mmol)的干燥的DCM(25mL)溶液中一次性加入MnO₂(174mg5 2mmol)，将得到的混合物加热至回流约2小时。冷却到室温后，过滤混合物，浓缩滤液并通过制备型TLC纯化残余物，得到1-7(60mg，产率60％)。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δppm 9.5(s，1H)，7.52(d，J＝7.2Hz，1H)，7.48(d，J＝2.8Hz，2H)，7.30(m，3H)，7.25(m，6H)，7.0(t，J＝8.6Hz，2H)，6.89(m，J＝8.6Hz，2H)，6.76(d，J＝8Hz，1H)，4.23(m，6H)，3.0(m，2H)，1.48(t，6H).

步骤F

向1-7(80mg，0.17mmol)的THF溶液中加入6N HCl，将得到的混合物在室温搅拌2小时。在真空下去除溶剂，得到粗产物1-8(60mg，82％产率)，无需进一步纯化用于下一步骤。

步骤G

在℃，向1-8(60mg，0.146mmol)的DMF(6mL)溶液中加入NaH(24mg，1mmol)，将得到的混合物在相同温度下搅拌约30分钟，然后将CH₃I(0.2mL)加入其中。将混合物在相同温度下再搅拌一小时。然后将混合物在H₂O和EtOAc之间分配。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。通过制备型TLC纯化残余物，得到1-9(40mg，产率63.0％)。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δppm 9.6(s，1H)，7.52(d，J＝8.08Hz，2H)，7.43(m，1H)，7.36～7.30(m，5H)，7.16(d，J＝2.02Hz，1H)，7.0(t，J＝8.6Hz，2H)，6.89(m，J＝8.6Hz，2H)，4.23(t，J＝6.56Hz，2H)，3.95～3.85(m，4H)，3.30(s，6H)，3.13(dd，J₁＝6.26Hz，J₂＝6.26Hz，2H).

步骤H

在氮气下，将1-9(40mg，0.09mmol)、1-10(19mg，0.09mmol)和NH₄OAc(70mg，0.9mmol)在甲苯(10mL)中的混合物加热至回流约3小时。冷却到室温后，用稀释的HCl水溶液处理得到的混合物直到pH＝4～5，然后将其在H₂O和EtOAc之间分配。合并的有机层用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到实施例1(30mg，产率50％)，其为黄色固体。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δppm 7.46～7.53(m，3H)，7.31～7.40(m，5H)，7.15～7.18(m，1H)，6.92～7.06(m，4H)，4.71(s，2H)，4.25～4.30(m，2H)，3.85～3.94(m，4H)，3.26～3.29(m，6H)，3.10～3.13(dd，J＝6.26Hz，J＝6.26Hz，2H).MS m/z 612(M+1)⁺.

实施例2

步骤A

向化合物2-1(150mg，0.58mmol，1.0当量)和化合物2-2(214mg，0.87mmol，1.5当量)的DMF(10mL)溶液中加入Cs₂CO₃(161mg，0.49mmol，0.85当量)。然后将混合物在室温搅拌过夜，然后加热到80℃并维持1.5小时。然后将得到的混合物在H₂O和EtOAc之间分配。合并的有机层用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型TLC纯化，得到2-3(122mg，产率49.4％)。

步骤B

在氮气下，将化合物2-3(122mg，0.29mmol，1.0当量)、2-4(57mg，0.30nimol，1.05当量)和NH₄OAc(223mg.2.90mmol，10.0当量)在甲苯(15mL)中的混合物加热至回流约3小时。用10％盐酸处理得到的混合物至pH＝4-5，然后将其在H₂O和EtOAc之间分配。合并的有机层用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，浓缩，并通过制备型TLC纯化，得到实施例2(52mg，产率29.9％)。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ7.41-7.47(m，3H)，7.19-7.35(m，10H)，6.99-7.07(m，3H)，6.87-6.92(m，2H)，6.22(s，1H)，4.75(s，2H)，4.24-4.29(m，2H)，3.72-3.13(m，2H).MS m/z 600(M+1)⁺

实施例3

步骤A

在-70℃，向3-1(1g，6.37mmol)的干燥的THF(20mL)溶液中滴加BuLi(3mL，7.68mmol)，然后将混合物在室温搅拌30分钟。再次冷却到-70℃后，向其中滴加环己烷甲醛(0.72g，6.43mmol)的干燥的THF(5mL)溶液。搅拌30分钟后，将饱和的NH₄Cl水溶液加入到混合物中，得到的混合物用EtOAc萃取。合并有机层并用Na₂SO₄干燥，浓缩，得到3-2(1.52g，14.3％)，其为粗制油状物。

步骤B

在0℃，向3-2(600mg，3.1mmol)在干燥的DCM(15mL)中的混合物中滴加SOCl₂(2mL)。然后将得到的混合物在室温搅拌2小时。在减压下浓缩混合物，然后用EtOAc稀释。有机层用饱和的NaHCO₃水溶液、盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，然后浓缩得到3-3(500mg，粗产物)。

步骤C

向3-3(450mg，粗产物)和3-4(375mg，1.44mmol)的DMF(10mL)溶液中一次性加入Cs₂CO₃(399mg，1.22mmol)，然后将混合物加热到110℃并维持18小时。混合物用H₂O稀释并用EtOAc萃取。合并有机层，用Na₂SO₄干燥，浓缩。通过TLC纯化残余物，得到3-5(130mg)，其为油状物，将其直接用于下一步骤。

步骤D

向3-5(130mg，0.3mmol)和3-6(60mg，0.31mmol)在甲苯(15mL)中的混合物中一次性加入NH₄OAc(180mg，2.34mmol)，然后将混合物加热至回流3.5小时。然后将混合物冷却到室温并加入10％HCl水溶液至pH＝5。用EtOAc萃取混合物。合并有机层并用Na₂SO₄干燥，浓缩得到黄色油状物。通过制备型TLC纯化残余物，得到实施例3(150mg，产率82.4％)。¹H-NMR(300MHz，MeOD)δ7.60(s，1H)，7.19～7.49(m，11H)，6.88(s，1H)，6.81(s，1H)，5.05(s，1H)，4.65(s，2H)，4.25～4.39(m，2H)，3.15(m，2H)，1.60～1.98(m，5H)，1.00～1.46(m，6H).MS m/z：607(M+1)⁺.

实施例4

步骤A

在40℃，将钠(8.5mg，0.37mmol)溶解在2-甲基-丙-1-醇(1.3g，17.5mmol)中，然后在50℃用30分钟将化合物4-1(2g，16.7mmol)滴加至其中。然后将反应混合物加热至70℃并搅拌过夜。将得到的混合物在H₂O和EtOAc之间分配。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩得到4-2(1.0g，粗产物)，将其直接用于下一步骤。

步骤B

在0℃，向4-2(1.0g，粗产物)、4-3(400mg，1.64mmol，1.0当量)和PPh₃(516mg，1.96mmol，1.2当量)的THF(20mL)溶液中滴加DIAD(406mg，1.96mmol，1.2当量)。将得到的混合物在室温搅拌过夜，然后将其在H₂O和EtOAc之间分配。有机层用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，浓缩并通过制备型HPLC纯化得到4(90mg，产率12.0％)。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ9.72(s，1H)，7.28-7.40(m，9H)，6.98-7.05(t，J＝8.78Hz，2H)，6.89-6.92(d，J＝8.28Hz，1H)，5.42-5.46(m，1H)，4.22-4.32(m，2H)，3.86-3.92(m，1H)，3.68-3.74(m，1H)，3.24-3.34(m，2H)，3.12-3.18(m，2H)，1.82-1.90(m，1H)，0.84-0.88(m，6H).

步骤C

实施例4的制备与实施例3相同。¹H-NMR(400MHz，MeOD)δ7.49(s，1H)，7.24-7.40(m，7H)，6.98-7.05(m，4H)，6.90-6.91(m，1H)，5.37-5.40(m，1H)，4.75(s，2H)，4.21-4.32(m，2H)，3.83-3.88(m，1H)，3.69-3.72(m，1H)，3.33-3.35(m，2H)，3.09-3.13(t，J＝6.57Hz，2H)，1.79-1.87(m，1H)，0.86-0.88(m，6H).

实施例5

该实施例显示了用编码人抗Her2抗体重链(Hc)和轻链(Lc)的表达载体转化并用本文所述的新型Pmt抑制剂处理的巴斯德毕赤氏酵母产生具有降低的O-糖基化的糖蛋白。

表达/整合质粒载体pGLY2988含有在甲醇诱导型巴斯德毕赤氏酵母AOX1启动子控制下的表达盒，该表达盒编码抗Her2的重链(Hc)和轻链(Lc)。通过GeneArt AG合成融合在α-MAT前信号肽N-末端的抗Her2的Hc和Lc(SEQ ID Nos：1和2)。合成每条序列，均具有单一的5′EcoR1和3′Fse1位点。抗Her2 Hc的核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID Nos：3和4中。抗Her2 Lc的核苷酸和氨基酸序列分别显示在SEQ ID Nos：5和6中。利用5′EcoR1和3′Fse1单一位点将融合在α-MAT前信号肽中的编码Hc和Lc蛋白质的两个核酸片段分别亚克隆到表达质粒载体pGLY2198，该载体含有巴斯德毕赤氏酵母TRP 2靶向核酸和博莱霉素抗性标记，并产生在AOX1启动子和酿酒酵母CYC终止子控制下的表达盒，以分别形成质粒载体pGLY2987和pGLY2338。然后，通过用BamHI和NotI消化，将Lc表达盒从质粒载体pGLY2338上去除并亚克隆到用BamH1和Not1消化了的质粒载体pGLY2987上，从而产生最终的表达质粒载体pGLY2988。

抗Her2表达菌株yGLY4280如下所述构建：用切割TRP2靶向区的限制酶Spe1消化5微克的pGLY2988，将其用于转化菌株yGLY22-1。利用之前所述方法(Nett和Gerngross，Yeast 20：1279(2003)；Choi等人，PNAS USA 100：5022(2003)；Hamilton等人，Science 301：1244(2003))构建菌株yGLY22-1(och1Δ::lacZ bmt2Δ::lacZ/KlMNN2-2/mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3pno1Δmnn4Δ::lacZ met16Δ::lacZ)。

yGLY22-1的转化基本如下所述进行：将YGLY22-1在50mL YPD培养基(酵母提取物(1％)、蛋白胨(2％)、葡萄糖(2％))中培养过夜达到OD值为约0.2～6。在冰上孵育30分钟后，通过在2500-3000rpm离心5分钟来沉淀细胞。去除培养基，用冰冷的无菌1M山梨醇洗涤细胞三次，然后重悬浮在0.5ml冰冷的无菌1M山梨醇中。将10μL线性化的DNA(10ug)和100μL细胞悬浮液在电穿孔杯中合并，在冰上孵育5分钟。在Bio-Rad GenePulser Xcell仪中根据预设的巴斯德毕赤氏酵母方法(2kV，25μF，200Ω)进行电穿孔，然后立刻添加1mL YPDS恢复培养基(YPD培养基加1M山梨醇)。在将细胞涂布在选择性培养基之前，允许转化的细胞在室温(26℃)恢复四小时至过夜。在含有博莱霉素的培养基上筛选后，通过小规模表达分析来筛选转化子以检测抗Her2表达。基于高水平抗Her2表达选择菌株yGLY4280。

菌株yGLY4280的抗Her2蛋白质表达在24℃使用缓冲的甘油-复合物培养基(BMGY)在摇瓶中进行，所述培养基由1％酵母提取物、2％蛋白胨、100mM硫酸钾缓冲液pH 6.0、1.34％酵母氮源、4×10^-5％生物素和1％甘油组成。用于蛋白质表达的诱导培养基是缓冲的甲醇-复合物培养基(BMMY)，其由BMGY中1％甲醇代替甘油组成。将100％甲醇中的Pmt抑制剂添加到生长培养基中达到0.15ug/mL的终浓度，此时添加诱导培养基。这是中间剂量，足以将O-糖基化降低到不用Pmt抑制剂处理所观察到的大约50％，从而允许进行不同抑制剂的效价比较。在诱导培养基中进一步生长24小时后，收获培养物并在2,000rpm离心五分钟，以将细胞从上清液中去除。

利用Dionex-HPLC(HPAEC-PAD)如下所述进行O-聚糖测定。为了测量O-糖基化降低，利用蛋白质A层析(Li等人Nat.Biotechnol.24(2)：210-5(2006))从生长培养基中纯化蛋白质，通过碱消除(β-消除)(Harvey，Mass Spectrometry Reviews 18：349-451(1999))从蛋白质中释放和分离O-聚糖。这种处理也降低了向甘露醇释放的O-聚糖(寡甘露糖或甘露糖)的新形成的还原末端。甘露醇基团因而充当了每个O-聚糖的独特的指示物。在100μL体积的PBS缓冲液中含有的0.5nmole或更多的蛋白质是β消除所需的。样品用25μL碱性硼氢化物试剂处理，在50℃孵育16小时。添加约20μL阿拉伯醇内标准，随后添加10μL冰醋酸。然后将样品通过含有SEPABEADS和AG 50W-X8树脂的Millipore过滤器离心并用水洗涤。样品，包括洗出物，转移到塑料自动进样器小瓶中，在离心蒸发器中蒸发到干燥。将150μl 1％AcOH/MeOH添加到样品中，并将样品在离心蒸发器中蒸发到干燥。这个最后的步骤再重复五次。添加200μL水，通过高pH阴离子交换层析与脉冲电化学检测-Dionex HPLC(HPAEC-PAD)结合来分析100μL样品。根据回收的甘露醇的数量测定平均O-聚糖占用率。

在表1中概括结果，其显示了四种新型Pmt抑制剂，实施例1至4，将O-糖基化降低到低于用Pmt抑制剂Pmti-3所观察到的水平，Pmti-3如Orehard等人(Bioorgan & Med Chem Letters(2004)14：3975-3978)和包括EP 1313471 B1在内的相向作者的专利公开以及Bobrowicz等人的美国公开的申请号2007061631中所述。Pmti-3具有如下的化学结构：

表1

新型Pmt抑制剂有效降低毕赤氏酵母产生的重组蛋白质的O-糖基化的直观证据由图1提供，其显示增加量的Pmt抑制剂对抗Her2重链(Hc)O-糖基化的作用。将菌株yGLY4280接种到96孔深孔板(Qiagen，Valencia，CA)中，每孔含有0.5ml的BMGY培养基。在剧烈振荡生长24小时后，将96孔板在2,000rpm离心5分钟来沉淀细胞。去除培养基，在用0.5mL的BMMY培养基进行洗涤步骤后，将细胞重悬在0.2mLBMMY培养基中，在培养基中将Pmt抑制剂沿排进行2倍稀释(11孔)。#1孔含有5ug/mL抑制剂，#2孔含有2.5ug/mL等等直到#10孔含有0.009ng/mL；#11孔不含有抑制剂。又剧烈振荡生长24小时后，将板在2,000rpm离心5分钟来沉淀细胞，并将澄清的上清液进行免疫印迹分析来检测抗Her2表达。免疫印迹如下进行：根据Laemmli，U.K.(1970)Nature 227，680-685通过还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离7μL上清液，然后电印迹到硝酸纤维素膜上(Schleicher & Schuell，now Whatman，Inc.，Florham Park，NJ)。利用过氧化物酶偶联的抗人Hc和Lc抗体(Calbiochem/EMD Biosciences，La Jolla，CA)在免疫印迹上检测抗Her2抗体链并利用ImmunoPure Metal Enhanced DAB Substrate Kit(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)显色。图1显示了一个这样的分析的结果，其中检测了实施例4的新型Pmt抑制剂(实施例4，图A)与Orchard等人的Pmti-3(图B)，还将无活性化合物用作对照(图C)。如图A和B所示，实施例4和Pmti-3在低至0.018ug/mL的浓度有效降低了抗Her2 Hc的O-糖基化。相反，无活性对照化合物(图C)没有显示Hc O-糖基化的降低。利用实施例1、2和3所示的抑制剂得到类似结果。综上，这些结果表明实施例1至4所示的新型Pmt抑制剂是真菌O-糖基化的有效抑制剂。

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