靶向蛋白质精氨酸甲基转移酶PRMT1/5的抑制剂发现与研究

摘要

蛋白质精氨酸甲基化是生物体中普遍的翻译后修饰之一，它由蛋白质精氨酸甲基化酶家族(PRMTs)催化，对多种细胞生理过程具有重要调节作用。哺乳动物中存在3种类型的PRMTs蛋白，研究表明其活性异常与许多疾病的发生发展有关，是心血管疾病、乳腺癌、白血病等疾病的潜在药物靶点。
　　PRMT1是最重要的Ⅰ型PRMT蛋白，它的催化活性占哺乳动物PRMTs总活性的85％以上，研究其特异性的小分子抑制剂显得尤为重要。本论文借助基于配体的计算机辅助药物设计，采用SHAFT(SHApe-FeaTure Similarity)的方法，以已报道的PRMT1小分子抑制剂MS023和DB75为模板，对临床药物数据库进行搜索，得到一系列候选化合物;通过构建TR-FRET酶活测试体系进行初筛，发现化合物Pentamedine具有一定的活性;接下来，采用放射性同位素方法进一步确证该化合物能够抑制PRMT1酶活，并测定半数抑制浓度IC50=13.2±0.3μM;紧接着，我们通过化学合成得到一系列Pentamedine的衍生物，并研究其构效关系，最终得到了另一个PRMT1抑制剂Hexamideine，其分子水平IC50=5.9±1.7μM;之后，我们采用分子对接结合Thermal shift、NMR等生物物理实验进一步探究Hexamidine与蛋白的结合模式，发现其是PRMT1的双底物竞争性抑制剂;最后细胞水平增殖实验表明，该化合物能够时间和浓度依赖性地抑制A549等细胞系的增殖，Western Blot实验确证该化合物能够在细胞内抑制PRMT1酶活。
　　PRMT5是最重要的Ⅱ型PRMT蛋白，与白血病、淋巴瘤、乳腺癌等有关，是潜在的药物靶点。本论文借助基于受体的计算机辅助药物设计，对PRMT5晶体结构进行分子对接，经聚类分析以及手动筛选得到120个化合物;通过放射性同位素初筛得到DC_Y53，其分子水平IC50=5.7μM;紧接着，我们通过相似性搜索进行结构优化，得到DC_Y134其体外IC50=1.7μM，且具有较好的选择性。最后细胞实验表明，DC_Y134能够时间和浓度依赖性地抑制多种白血病和淋巴瘤细胞的增殖，且对MV4-11细胞的抑制作用最为明显。Western Blot实验表明该化合物可以抑制胞内PRMT5酶活，流式细胞术实验表明DC_Y134能够将细胞周期阻滞在G0/G1期，并且促进肿瘤细胞凋亡。
　　综上所述，我们以计算机辅助药物设计为出发，结合生物实验确证，得到了具有选择性的靶向PRMT1的小分子抑制剂Hexamideine(IC50=5.9±1.7μM)以及PRMT5的小分子抑制剂DC_Y134(IC50=1.7μM)，为后续PRMT1/5的功能研究提供了分子探针，为小分子抑制剂的发现提供了线索。

目录

声明

摘要

缩略语

1 表观遗传学基本内容

2 组蛋白修饰

2．1 组蛋白甲基化动态修饰

3 蛋白精氨酸甲基转移1(PRMT1)

3．2 PRMT1的功能与相关疾病

3．3 靶向PRMT1的小分子抑制剂

4 蛋白精氨酸甲基转移5(PRMT5)

4．1 PRMT5的结构

4．2 PRMT5的功能与相关疾病

4．3 靶向PRMT5的小分子抑制剂

第二章 靶向PRMT1小分子抑制剂的实验设计方案

1 实验目的、意义

2 研究内容

2．2 小分子与PRMT1的结合模式分析以及细胞水平活性评价

3 实验流程图

第三章 靶向PRMT1的小分子化合物的发现与优化

1 材料与试剂

1．1 试剂

2 方法

2．1 骨架跃迁

2．2 全合成pET28a-rPRMT1质粒

2．3 表达纯化目的蛋白

2．4 构建TR-FRET体系并检测化合物

2．5 放射性同位素方法定量化合物的活性

2．6 结构优化及构效分析

3．2 经过Ni柱纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳

3．3 经过Superdex 75柱纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳

3．4 TR-FRET初筛结果

3．5 放射性同位素的方法检测Pentamidine化合物的活性

3．6 二脒类衍生物结构与活性

3．8 NMR实验验证Hexamidine与PRMT1蛋白的结合

4 讨论

第四章 小分子与PRMT1结合模式分析以及细胞水平活性评价

1 材料与试剂

1．1 材料

1．2 试剂

1．3 主要试剂的配置

2 方法

2．1 同源模建

2．2 分子对接

2．3 核磁竞争实验

2．4 选择性实验

2．5 细胞增殖实验

2．6 Western Blot

3 结果

3．1 同源模建

3．2 结合模式分析

3．3 Hexamidine对PRMT3-5的体外酶活抑制结果

3．4 细胞水平分析

3 讨论

第五章 靶向PRMT5小分子抑制剂的实验设计方案

1 实验目的、意义

2 研究内容

2．1 靶向PRMT5的小分子化合物的发现与优化

2．2 DC_Y134化合物的细胞水平活性评价

3 实验流程图

第六章 靶向PRMT5的小分子化合物的发现与优化

1 材料与试剂

1．1 试剂

2 方法

2．1 分子对接

2．2 放射性同位素实验

2．3 相似性搜索

2．4 选择性实验

3 结果

3．1 初筛及优化结果

3．2 选择性结果

4 讨论

第七章 DC_Y134化合物的细胞水平活性评价

1 材料与试剂

1．1 材料

1．2 试剂

2 方法

2．1 细胞增殖实验

2．2 Western Blot

3 结果

3．1 细胞增殖结果

3．2 Western Blot结果

3．3 周期和凋亡结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢