一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法

摘要

本发明属于核酸检测领域，公开了一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法。本发明在目的核酸的提取、扩增以及试纸条检测全程中加入相应内控，使内控和目的片段平行接受操作，最终通过试纸条上检测线、内控线及质控线三条带的显色有无和强度对比进行半定量检测。本发明使目的核酸在被处理的全过程都有相应内控作为阳性对照，避免了在试纸条检测的过程中由于提取、扩增或点样失误等环节使结果出现假阴性的情况。同时通过比较内控线与样本线的显色强度，在免疫层析试纸条定性功能的基础上引入了半定量功能，估测被测样本的拷贝数，使检测结果更为详细、准确和可靠。本发明操作便利、快速，可满足临床实际需要。

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测领域，涉及一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法，具体涉及在病原体核酸的检测全程中，均引入与待测核酸序列相似的内控，对检测过程进行监控，既排除假阴性，又可通过比较试纸条上内控线与检测线的显色强度进行半定量的核酸检测方法。

背景技术

胶体金免疫层析(gold-immunochromotography assay，GICA)法是20世纪80年代末发展起来的一种快速的免疫学测定方法，它是胶体金标记技术和免疫层析技术相结合的产物。基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，然后用胶体金标记的抗体来直接显色，阳性反应在膜上呈现红色，阴性反应则不形成红色，即可实现可视化检测。

目前国内普遍以病原微生物的蛋白质抗原作为试纸条检测的主要对象，并且取得了不错的效果。然而尽管免疫学诊断技术在一直进步，第三代单克隆诊断抗体的出现使得免疫诊断的灵敏度大大提高，但是，由于免疫诊断所采用的原理是抗原抗体结合，自身存在着一定局限性：首先是个体免疫机能不同，其中有少数感染者感染后机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测线以下，甚至不产生抗体，因此，免疫学诊断方法不能检测出处于窗口期和新近感染病毒的献血员，这样势必导致漏检。其次，抗原出现变异以及稀有亚型也可导致漏检。因此，免疫学筛查后，假阴性及漏检现象仍时有发生。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，核酸诊断(Nucleic acid Test，NAT)这一全新的技术成为临床诊断的发展方向，在血液筛查上，NAT与传统的酶免检测法相比也有着明显的优越性，由于DNA/RNA直接反映病毒本身在机体内的存在情况，因此直接检测病原体的核酸，能大大缩短“窗口期”。以HCV为例，免疫学检测的“窗口期”平均长达70天，而PCR可将“窗口期”缩短41-60天，显然有利于疾病的早期诊断。同时NAT也具有更高的灵敏度，可检出标本中极微量的核酸，在病毒感染后数天即能检出，因此，NAT技术十分适合在临床应用和推广。PCR作为当今最为常用的核酸扩增方法，在生物科研和临床中应用广泛。根据文献报道，目前国内已有人使用PCR结合免疫层析试纸条法对病毒核酸进行定性诊断，但至今无报道使用免疫层析试纸条法对病毒核酸进行定量检测。

此外，核酸诊断的一个潜在问题就是假阳性与假阴性的困扰，而其中假阴性问题相对于临床检测更为严重。这是由于引起假阳性的原因多较为单一，一般仅涉及扩增产物的污染，通过严格的防污染培训，合理的环境布局，以及加入UNG酶等防污染技术可以使该问题得以基本解决。而PCR的假阴性却不同，它涉及到与整个检测相关的几乎任意一个环节，十分复杂。其中又以下几个方面较为重要：

一.实验仪器

核酸诊断对仪器的依赖性是很高的，恒温水浴锅、高速离心机、扩增仪等设备如若未定期校正，都可能造成检测结果的假阴性。国产水浴锅会出现显示温度与实际温度不符的情况，两者可以相差10度左右。扩增仪的主要问题同样是控温不准，不同孔道之间的孔间差会导致扩增结果不平行，使扩增效率降低甚至失败。离心机的参数常用相对离心力(RCF)或每分钟转速(rpm)表示，由于不同离心机有效半径存在差异，因此相同转速下所产生的离心力相差可能很大(有的在数倍以上)，导致相同的离心时间，固相和液相的分离出现问题，同样会产生假阴性。

二.实验试剂

试剂是核酸诊断成功的关键要素，高质量的试剂可以提高提取的得率、扩增的灵敏度以及缩短检测的时间。然而在日常实验过程中，试剂的质量往往难以得到保证。一方面不同生产厂家的产品质量参差不齐，有时即使是使用同一厂家不同批次的产品都可能得到截然相反的实验结果。另一方面试剂保存不当同样会对检测结果造成巨大影响：模板的降解、溶液pH发生变化、酶的活性降低等等。

三.操作人员素质

核酸诊断的研究对象是DNA或RNA，即人体内的生物大分子，由于分子水平的结构无法用肉眼直接进行观察，因而操作过程中出现的一些细小问题很容易被忽视。例如少加、漏加试剂，混合液震荡、离心不充分，反应程序设置有误等。其中有些细节即便是具备多年操作经验的人员也难以完全避免。

总之，以上每个环节的失误都可能导致待测核酸的减少，有时甚至完全降解或丢失，使试纸条上的检测线无法显色，继而给检测人员提供错误的信息，导致错误的判断。

发明内容

本发明的目的在于针对现有核酸诊断技术整个过程任何一个环节(从样本的提取到目的片段的扩增放大，再到使用试纸条进行检测)出现问题均易产生假阴性的情况，提供一种使用内控核酸片段对样本核酸进行半定量可视化检测的方法。本方法有针对性的设计了待测核酸的相应内控作为阳性对照，并从提取步骤开始就和待测核酸平行操作，直至最终试纸条检测，实现对样本核酸的半定量可视化检测，并从根本上防止了检测结果假阴性的可能，具有广阔的临床应用前景。

本发明是通过下列技术方案实现的：

一种加入内控对目的核酸进行试纸条半定量可视化检测的方法，包括如下步骤：

(1)针对目的核酸制备与目的核酸片段Tm值相近的内控核酸片段；

(2)在待检样本中加入浓度及序列均已知的内控核酸片段，采用核酸提取法同时提取待检样本中的核酸(包括DNA以及RNA)以及内控核酸；

(3)以步骤(2)提取得到的提取液为模板，采用核酸扩增法在单管中加入针对目的核酸片段和内控核酸片段的修饰有检测用抗原的混合引物同时扩增目的核酸片段和内控核酸片段，得到带有检测用抗原的扩增产物混合液；

(4)将步骤(3)得到的含目的核酸扩增产物和内控核酸扩增产物的混合液点样在“三条线”免疫层析试纸条上进行免疫层析，通过层析方向上不同位置条带的有无对目的核酸进行定性，通过比较目的核酸与内控核酸检测条带的显色强度，估测被测样本的拷贝数，对目的核酸进行半定量分析；所述的层析方向上不同位置处条带分别修饰有与检测用抗原相对应的抗体。

其中，步骤(1)所述的内控核酸片段优选与目的核酸片段在碱基数目和碱基构成上均相同，仅碱基排列不同的核酸片段，进一步优选与目的核酸片段在碱基数目和碱基构成上均相同，仅一端约16～30个碱基排列不同的核酸片段。

步骤(1)所述的内控核酸片段是通过如下的制备方法得到：以所述的目的核酸或含有目的核酸片段的质粒为模板，使用一对特异性引物进行扩增，一条引物与目的核酸互补，另一条引物由与待测核酸互补和不互补的两部分组成，不互补的部分为5’端加入约16～30个人工设计的与待测核酸不互补的碱基，通过PCR扩增最终产生了与待测核酸扩增片段碱基数目相同、碱基构成比相同而仅一端约16～30bp排列不同的内控核酸片段。

步骤(3)所述的核酸扩增法可以为聚合酶链式反应(PCR)、依赖核酸序列扩增技术(NASBA)或核酸环介导等温扩增技术(LAMP)。

步骤(3)所述的得到带有检测用抗原的扩增产物，可通过如下的两种方法得到：以步骤(2)提取得到的提取液为模板，在单管中加入针对目的核酸片段和内控核酸片段的混合引物同时扩增目的核酸片段和内控核酸片段：

(方法i)用一对基因特异性引物扩增目的核酸片段，该基因特异性上、下游引物分别修饰A抗原及B抗原，得到带有A抗原及B抗原的目的核酸片段扩增产物，用一对基因特异性引物扩增内控核酸片段，该基因特异性上、下游引物分别修饰A抗原及C抗原，得到带有A抗原及C抗原的内控核酸片段扩增产物；

(方法ii)用一对基因特异性引物对目的核酸片段进行非对称性扩增，其中非限制性引物修饰B抗原，最终扩增产物为带有B抗原的单链目的核酸片段；用一对基因特异性引物对内控核酸进行非对称性扩增，其中非限制性引物修饰C抗原，最终扩增产物为带有C抗原的单链内控核酸片段；设计一条修饰有A抗原的目的核酸特异性探针和一条修饰有A抗原的内控核酸特异性探针，加入扩增体系，在扩增的同一管中分别与带有B抗原的单链目的核酸片段及带有C抗原的单链内控核酸片段互补，通过特异性杂交形成带有检测用抗原的扩增产物：待测核酸-探针复合物及内控核酸-探针复合物；

或者，用一对基因特异性引物对目的核酸进行非对称性扩增，其中非限制性引物修饰A抗原，最终扩增产物为带有A抗原的单链目的核酸；用一对基因特异性引物对内控核酸进行非对称性扩增，其中非限制性引物也修饰A抗原，最终扩增产物为带有A抗原的单链内控核酸；设计一条修饰有B抗原的目的核酸特异性探针和一条修饰有C抗原的内控核酸特异性探针，加入扩增体系，在扩增的同一管中与目的核酸及内控核酸互补，通过特异性杂交形成带有检测用抗原的扩增产物：目的核酸-探针复合物及内控核酸-探针复合物。

步骤(4)中所述的免疫层析试纸条为“三条线”免疫层析试纸条，其有色颗粒结合垫中的有色颗粒为表面修饰特异性抗A抗体的有色颗粒；其包被膜上设有三条线：将特异性抗B抗体固定于包被膜上形成的检测线，将特异性抗C抗体固定于膜上形成的内控线，将A抗原修饰的蛋白固定于膜上形成的质控线。

所述的有色颗粒为胶体金、胶体硒或粒径为0.1μm-80μm的乳胶颗粒。

所述的有色颗粒表面修饰的特异性抗A抗体、包被膜上固定的抗B抗体和抗C抗体，可选自：抗生物素抗体、抗荧光素抗体或抗地高辛抗体中的任一种；引物上修饰的抗原可以为与之对应的生物素、荧光素或地高辛中的任一种，A抗原修饰的蛋白可选用A抗原修饰的牛血清白蛋白。

所述的步骤(4)对目的核酸进行定性的依据为如果质控线、内控线及检测线均显色，则检测结果为阳性，表明溶液中含有目的核酸；如果质控线、内控线显色而检测线不显色，则检测结果为阴性，表明溶液中不含目的核酸；如果仅质控线显色而内控线、检测线均不显色，则结果为假阴性，表明提取、扩增或试纸条检测过程中某一步或某几步出现问题，结果不可信；如果质控线不显色，表明试纸条质量出现问题，结果不可信；步骤(4)对目的核酸进行半定量的依据为如果检测线与质控线均显色，通过检测线和内控线的显色强度进行比较，估测被测样本的拷贝数，进而实现对未知样本核酸浓度的相对定量。

所述的待检样本为待检血液、组织、分泌物、尿液或粪便。

本发明加入内控的试纸条核酸检测方法原理如下：

“三条线”试纸条制备时，将特异性抗A抗体(一般为链亲和素)包被在有色颗粒表面，有色颗粒可以为乳胶颗粒或胶体金颗粒，再将有色颗粒固定在试纸条一端；依次将抗B抗原抗体(如抗荧光素抗体)、抗C抗原抗体(如抗地高辛抗体)以及牛血清白蛋白偶联的生物素固定在膜上分别形成检测线、内控线及质控线。用于试纸条检测的终产物为标记有生物素、荧光素的目的核酸片段和标记有生物素、地高辛的内控核酸片段的混合液。

带有试纸条检测用抗原的核酸扩增产物可来源于两种方法：(i)混合液中的目的核酸片段来源于5’端分别修饰生物素及荧光素的一对待测基因特异性引物的扩增产物，混合液中的内控核酸片段来源于5’端分别修饰生物素及地高辛的一对内控核酸特异性引物的扩增产物；(ii)混合液中的目的核酸片段来源于一条荧光素修饰的引物(PCR两条引物中浓度较高的引物)的扩增产物，杂交结合了一条生物素修饰的特异性探针，或者是一条生物素修饰的引物(PCR两条引物中浓度较高的引物)的扩增产物，杂交结合了一条荧光素修饰的特异性探针；混合液中的内控核酸片段来源于一条地高辛修饰的引物(PCR两条引物中浓度较高的引物)的扩增产物，杂交结合了一条生物素修饰的特异性探针，或者一条生物素修饰的引物(PCR两条引物中浓度较高的引物)的扩增产物，杂交结合了一条地高辛修饰的特异性探针。在试纸条的检测过程中，修饰有生物素的目的核酸片段及内控核酸片段均会与有色颗粒表面的链亲和素结合，形成目的核酸-有色颗粒复合物及内控核酸-有色颗粒复合物，复合物通过毛细现象沿纤维膜前进，当到达检测线位置时，目的核酸片段上修饰的荧光素与检测线上固定的抗荧光素抗体发生抗原抗体反应，使有色颗粒聚集在检测线处继而出现肉眼可见条带；当复合物到达内控线位置时，内控核酸片段上修饰的地高辛与内控线上固定的抗地高辛抗体发生抗原抗体反应，使有色颗粒聚集在内控线处继而出现肉眼可见条带；修饰链亲和素的游离有色颗粒继续层析，当到达质控线时，与固定的生物素结合，使质控线同样有显色。

当目的核酸片段不存在时，有色颗粒无法在检测线处聚集，不能形成肉眼可见的有色条带；同样，当内控核酸片段不存在时，有色颗粒也无法在内控线处聚集，不能形成肉眼可见的有色条带。如果试纸条上质控线及检测线均显色，则检测结果为阳性，表明样本中含有目的核酸；如果质控线、内控线显色而检测线不显色，则检测结果为阴性，表明样本中不含目的核酸；如果仅质控线显色而内控线、检测线均不显色，则表明检测全过程中某一步或某几步出现问题，试纸条结果不可信，为假阴性；如果质控线不显色，表明试纸条自身存在质量问题，检测结果亦不可信。由于内控核酸的浓度已知，在检测线与质控线均显色的情况下，通过内控线与检测线显色强度的对比，可实现对待检样本中目的核酸浓度的相对定量，如果内控线不显色，而检测线与质控线均显色，说明待检样本中目的核酸浓度远大于已知内控核酸片段浓度。

本发明的有益效果：

1、本发明通过从目的核酸片段提取步骤开始便加入设计好的内控核酸片段作为阳性对照，使两者平行提取、扩增和点样，最终在一张试纸条上同时检测上述两种片段，从而实现对目的片段检测的全程监控，避免了现有核酸诊断易于产生假阴性的问题，使检测结果更为准确、可靠。

2、内控核酸由目的核酸制备而来，与目的核酸扩增产物相比碱基排列顺序不同而碱基总数及构成比均相同，从而使两者Tm值相似，在确保引物扩增特异性好的前提下同时实现了扩增效率一致。

3、与其他基于试纸条检测的方法一般用于定性检测不同的是，本方法在引入内控后可实现基于试纸条的目的核酸半定量检测。通过加入一定量已知浓度的内控核酸，对试纸条上检测线和内控线的显色强度进行比较，进而实现对待检样本中目的核酸浓度的相对定量。

4、本发明加入内控对目的核酸进行试纸条半定量可视化检测的方法检测快速，全过程在15分钟内完成；操作方便，易于推广，相关人员无需经过专业培训；容易判读，检测结果可视化；无需特殊仪器，特别适合现场检测；制作成本低廉。

附图说明

图1是本发明方法流程示意图。

图2是本发明加入内控的双修饰引物试纸条检测核酸方法的原理图。

图3是本发明加入内控的单探针试纸条检测核酸方法的原理图。

图4是用试纸条对实际样本进行检测的结果以及阳性样本检测时出现的假阴性结果。其中1代表正常人血清的试纸条检测结果；2代表HBV病毒血清的试纸条检测结果；3代表HBV病毒血清的假阴性检测结果。

图5是实施例2对加入内控的试纸条法进行半定量考察的结果图。其中1～6中加入的内控模板量均为50copies，1中加入的病毒目的核酸模板量为50copies；2中加入的病毒目的核酸模板量为500copies；3中加入的病毒目的核酸模板量为5000copies；4中加入的病毒目的核酸模板量为5×10⁴copies；5中加入的病毒目的核酸模板量为5×10⁵copies；6中加入的病毒目的核酸模板量为5×10⁶copies。

图6是实施例3对不同浓度的HBV病毒血清进行半定量考察的结果图。1～5依次表示HBV病毒浓度为10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶copies/100μL血清的待测血清半定量考察的结果图。

具体实施方式

实施例1(采用加入内控的试纸条法，检测血液中HBV病毒)

我国在世界上属于乙型肝炎病毒感染的高发区，目前全国有上亿人是乙型肝炎病毒携带者，慢性肝炎病人约有几千万。每年我国在病毒性肝炎的直接治疗方面费用约有上百亿元(不包括保健品费用、影响学习、就业和工作等造成的间接损失)。对乙型肝炎病毒高效、准确的检测在其预防和治疗方面至关重要。

HBV基因组为环状双链DNA，全长为3182bp(约3.2kb)。双链的长度不对称，负链(长链)与病毒mRNA互补。正链仅5’端固定，其长度可为负链的50％-100％，其3’端位置不定，因而在病毒群体中有不同长度的正链与全长的负链匹配，仅有部分长度为双链。HBV负链核苷酸序列有4个主要开放读码框架(open reading frame，OFR)：S基因区、C基因区、P基因区和X基因区。通过查阅相关文献，选择S基因区作为目标扩增区域。

以目的核酸(HBV病毒的S基因区)为模板，制备内控核酸片段用上游引物为：P1SEQID NO.1；下游引物为：P2SEQ ID NO.2。

以上述扩增产物为模板，制备内控核酸片段用上游引物为：P1-2SEQ ID NO.3；下游引物为：P2SEQ ID NO.2。

检测用HBV目的核酸扩增特异性引物分别是：

P3(上游)5’-biotin-SEQ ID NO.4-3’

P4(下游)5’-FITC-SEQ ID NO.5-3’

检测用HBV内控核酸扩增特异性引物分别是：

P3(上游)5’-biotin-SEQ ID NO.4-3’

P5(下游)5’-Dig-SEQ ID NO.6-3’

实验流程：

1)内控核酸片段制备：首先使用一对特异性的引物对目的核酸或含有目的核酸片段的质粒进行单管一重扩增，反应体系为25μL，其中包括：10×Buffer 2.5μL、dNTPs(10mM)0.5μL、MgCl₂(25mM)1.5μL、引物P1(SEQ IDNO.1)、P2(SEQ IDNO.2)各1μL、rTaq DNApolymerase(5U/μL)0.125μL，补水至25μL，混匀。在94℃预变性2分钟后，于90℃10秒、70℃30秒的条件下扩增40个循环，最后于72℃延伸2分钟。之后用引物P1-2(SEQ ID NO.3)、P2(SEQ ID NO.2)对稀释10⁵倍的上述目的核酸扩增产物进行扩增，扩增反应条件和反应程序同上，纯化扩增产物，以去除反应中多余的引物、寡核苷酸、盐离子等。最后使用紫外分光光度计，测定A₂₆₀/A₂₈₀处的比值以及A₂₆₀处的紫外吸收峰，计算纯化产物中内控核酸的浓度，从而得到已知浓度的内控核酸片段(SEQID NO.7)。目的核酸和内控核酸的扩增片段长度均为173bp。

2)样本提取：在十份HBV病毒血清及一份正常人血清中加入相应内控核酸片段，并使用深圳匹基生物工程有限公司生产的乙肝病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒对十一份血清平行提取。最终获得病毒血清核酸提取液十份及正常人血清核酸提取液一份。

3)PCR扩增：同时加入HBV样本扩增特异性引物及相应内控引物进行单管二重扩增：在收集的核酸提取液中加入10×Buffer 2.5μL、dNTPs(10mM)0.5μL、MgCl₂(25mM)1.5μL、引物P3(SEQ IDNO.4)、P4(SEQ IDNO.5)、P5(SEQ IDNO.6)各1μL、rTaq DNApolymerase(5U/μL)0.125μL，补水至25μL，混匀。PCR反应程序同上。

4)试纸条检测：取3μL步骤3)中的扩增产物与97μLPBS缓冲液充分混匀，滴在免疫层析试纸条点样孔处，肉眼观察显色结果(一般于15分钟内显色)。在试纸条的有色颗粒结合垫上固定有链亲和素结合的乳胶颗粒，检测线上固定有抗FITC的抗体，内控线上固定有抗Dig的抗体，质控线上固定有BSA-Biotin。由图4的结果可以看出，将正常人血清扩增产物点样在试纸条上，质控线和内控线均有显色，而检测线无显色，检测结果为阴性，与样本实际情况相符。将十份病毒血清扩增产物点样在试纸条上：其中九份样本的检测试纸条上出现三条带，质控线、内控线及检测线均有显色，检测结果为阳性，与样本实际情况相符；一份病毒血清扩增产物点样在试纸条上，试纸条上只出现质控线，内控线及检测线均不显色，说明这份样本出现假阴性，需重新测定。

实施例2(对加入内控的试纸条法的半定量性能进行考察)

实验流程：

1)PCR扩增：分别将6种不同浓度的含HBV目的核酸序列的质粒模板(5×10¹、5×10²、5×10³、5×10⁴、5×10⁵、5×10⁶copies/μL)和一定浓度的HBV内控核酸片段(50copies/μL)混合后作为模板，用HBV样本扩增特异性引物及相应内控引物进行单管二重扩增。HBV内控核酸片段序列、HBV引物序列、相应内控核酸片段引物序列、反应体系及反应程序同实施例1。

2)试纸条检测：实施步骤同上，结果见图5。由图5的结果可以看出，当病毒目的核酸片段的浓度和内控核酸浓度相同时(两者均为50copies/μL)，检测线与内控线显色强度基本一致；当病毒目的核酸片段的浓度继续升高时，检测线显色强度不发生明显变化，而内控线显色强度逐渐减弱，病毒目的核酸片段的浓度达5×10⁵copies/μL时，内控线用肉眼已无法观察到。检测线与内控线显色强度的相对强弱可以作为参考，用于对血液病原体感染浓度进行大致推断。

实施例3

利用实施例1的方法对不同含量的HBV病毒血清进行半定量检测，其中内控核酸片段的浓度为5000copies/μL，引物P3(SEQ ID NO.4)、P4(SEQ ID NO.5)各1μL、引物P5(SEQ ID NO.6)0.25μL待测血清中HBV病毒的浓度分别为1×10²copies/100μL血清、1×10³copies/100μL血清、1×10⁴copies/100μL血清、1×10⁵copies/100μL血清、1×10⁶copies/100μL血清。检测结果如图6，从图6可看出，随着待测血清中HBV病毒浓度的提高，检测线相对于内控线的显色强度逐渐增强，每100微升病毒血清含有病毒量大于10⁶copies时，内控线消失。