肺炎衣原体核糖核酸酶CpRNaseHIIa对核酸进行恒温检测的新方法研究

摘要

核糖核酸酶H普遍存在于各种生物体中（包括病毒、原核生物、真核生物等），是一类能够特异性识别并水解RNA/DNA杂交体系中的RNA链的核糖核酸内切酶，酶切产物为5’-磷酸末端和 3’-羟基末端。分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。 本论文着眼于核酸检测技术的研究，在发现了肺炎衣原体核糖核酸酶HIIa的新特性的基础上，设计嵌合分子信标，建立了一套新的恒温（37°C）检测核酸的新系统（CRMB assay）。CRMB assay主要涵盖三个基本因素：即肺炎衣原体核糖核酸酶HIIa 的新酶切特性、双链解链温度和信号放大。本论文的研究内容包括以下三方面： 1）CpRNase HIIa能识别并降解DNA-RNA-DNA／DNA双链中的单个核糖核苷酸，并且在(rA/dT)、 (rC/dG)、 (rG/dC)和 (rU/dA) 四组中无碱基特异性，这是CRMB assay系统的生化基础。 2）为了验证CRMB检测系统的可行性，选取了E.coli　K12 gap-A 中一段序列为目的检测序列，根据碱基互补原则，以及DNA Refold 软件设计了嵌合分子信标 MB-gapA，以40 bp长的寡核苷酸片段作为模板，并将其等倍稀释成6个梯度，经实验表明CRMB assay 可成功地将两倍浓度差异区分开来。存在信号放大作用,且特异性高。 3）将CRMB检测应用到长链检测中，用引物 PCR 扩增出长片段，并通过λ外切酶处理成单链；或者通过反转录总RNA成 cDNA第一链。实验结果证明，CRMB assay可以用于长的单链的定性定量检测，其检测效果与在寡核苷酸应用中相比具有一致性。 本论文实验表明CRMB assay是一套恒温条件下、无需外参基因的新型核酸检测系统，具有广泛的应用前景。