一种食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白的酶联免疫检测方法

摘要

一种食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白的酶联免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明应用高纯度的卵清蛋白免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体，以该抗体作为检测试剂，高纯度卵清蛋白为标准品和包被抗原，建立了食品中卵清蛋白的间接ELISA方法。本发明为在食品中卵清蛋白的含量检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好，灵敏度为1ppm，线性范围为1-128ppm，免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种定量检测食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白含量的酶联免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

近年来，食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题，而鸡蛋是最常见的八大食品过敏原之一。过敏疾病严重危害人们的身体健康，虽然激发过敏反应的最低过敏原的量随着人群的不同而不同，但是微量的过敏原就可以使绝大部分患者产生过敏症状。为了避免接触微量的过敏原，过敏原的检测成为当务之急。现在，虽然有许多过敏原检测方法可供借鉴，但在具体应用上都存在着各自不同的问题。体内实验方法可提供最为直接的证据，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与此相比体外实验方法具有方便、安全的优点，但却存在着准确性差的缺点。目前体外微量的检测方法有免疫法、PCR法、组胺释放实验法、过敏原指纹快速检测法等。虽然目前有关过敏原检测的方法很多，但都存在各自不同的问题，如检测速度慢、成本高、需要特定的分析仪器等，这些制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫检测方法，用于食品中卵清蛋白的批量、快速检测。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明建立了一种食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白含量的酶联免疫检测方法，包括对检测方法的优化。

(1)抗原的包被

用高纯度卵清蛋白作为包被抗原，以包被缓冲液pH 9.6、0.05M的碳酸钠缓冲液CBS稀释包被抗原，包被抗原浓度为0.125～256μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL包被液，4℃孵育过夜，用含0.1％明胶的包被缓冲液作为封闭液封闭；

封闭液为含0.1％明胶的pH 9.6、0.05M的CBS；

(2)竞争反应

将高纯度卵清蛋白免疫制备的卵清蛋白多克隆抗体用抗体稀释液PBST按1∶4000重量比稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，同时分别加入用标准品稀释液稀释的系列浓度0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，8.0μg/mL，16μg/mL，32μg/mL，64μg/mL，128μg/mL，256μg/mL的高纯度卵清蛋白标准品，每孔50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤4次；

抗体稀释液PBST为含1％明胶、含0.5％吐温-20、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；

PBST洗涤液的配方为1000mL蒸馏水中加入氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g、吐温-200.5mL；

标准品稀释液的配方为在含30％体积甲醇的pH6.5的PBS中加入质量浓度为5％的氯化钠；

(3)加酶标二抗

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔HRP-IgG以抗体稀释液PBST稀释为1∶3000，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤4次；

(4)显色

每孔加入100μL显色液，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL终止液2mol/L的硫酸，用酶标仪测定吸光值OD₄₅₀；

显色液包括A液和B液，A液配方为每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL 30％H₂O₂；B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇；使用时按A∶B＝5∶1体积比使用；

所述的高纯度卵清蛋白为购于SIGMA公司的A7642高纯度卵清蛋白。

本发明方法的检测分析原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测含卵清蛋白的样品和卵清蛋白多克隆抗体后，固相包被抗原和待测样品中的卵清蛋白相互竞争与抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的抗体含量均一致，所以当待测样品中卵清蛋白浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，用洗涤液洗涤后加入底物液(即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测样品含卵清蛋白浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据所作的标准曲线，可以推算出待测样品含卵清蛋白的浓度。

(三)有益效果

本发明提供的鸡蛋过敏原卵清蛋白检测方法采用了卵清蛋白多克隆抗体，能准确灵敏地检测食品中含卵清蛋白的浓度，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本低，而且本发明方法稳定性好，无放射性污染。本发明对解决大批量样品中卵清蛋白含量的在线检测具有重要的现实意义。

附图说明

图1卵清蛋白ELISA标准曲线。

具体实施方案

以下通过实施例进一步说明本发明。

一、仪器：

TGL-40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂

KFLOW纯水机，凯佛隆公司

ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂

Costar 96孔8×12可拆酶标板，上海吉泰生物科技有限公司

Multiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司

可调试移液器，Thermo Labsystems公司

涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂

二、试剂：

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)，康成生物工程公司四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司

其他试剂均为分析纯试剂

三、步骤

1.抗血清(多克隆抗体)的制备

1)实验动物：选2只2月龄、体重为1.5-2kg的健康新西兰大白兔为实验动物。

2)抗原配置：将免疫原卵清蛋白用生理盐水稀释，配成2mg/mL的溶液。

3)乳化：将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅拌法将其乳化，直至将一滴乳剂滴入水中，不散开漂在水面上为止。

4)免疫方法：初次免疫将乳化好的试剂于兔子背部多点注射，1mL/只。初次免疫后的免疫称为加强免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂乳化，加强免疫为肌肉注射，每两周加强免疫一次，剂量与初次免疫相同。

5)采血：4次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价达到要求后，采用耳静脉放血与心脏放血相结合获得抗血清，收集于50mL灭菌塑料离心管中。

6)抗体的纯化和保存：将抗血清XmL用等量的生理盐水稀释至2XmL，然后在搅拌下逐滴加入与稀释后抗血清等量(2X)的饱和硫酸铵，4℃放置3小时使其充分沉淀。离心(3000r/min)20min，弃上清以生理盐水溶解沉淀至XmL，再逐渐滴加饱和硫酸铵X/2mL。4℃放置3小时使其充分沉淀，重复上述第二步过程1次，将末次离心后所得沉淀物以0.02mol/L PBS(pH 7.4)溶解至XmL，装入透析袋中0.02mol/L PBS(pH 7.4)充分透析，期间换液3次，透析完浓缩，分装放入-20℃冰箱保存备用。

2、ELISA反应过程：

抗体效价测定步骤：

1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100μL/孔，于4℃冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200μL PBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。

2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μL/孔，于37℃温育箱内温育2h后取出烘干待用。

3)将阳性血清稀释后对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，50μL/孔，37℃孵育1h后用PBST洗涤液洗涤4次、拍干。

4)每孔加入100μL，1∶3000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育1h后用PBST洗涤液洗涤4次、拍干。

5)每孔加入100μL显色液(TMB与底物液体积比例为1∶5)，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值OD₄₅₀。

抗体特异性测定步骤：

a、包被：用设定浓度的包被原包被酶联反应板，100μL/孔，4℃过夜。

b、洗涤：用PBST洗涤反应板4次，每次3min，200μL/孔，然后甩干反应板。

c、封闭：含0.1％明胶的PBS，200μL/孔，37℃封闭2h。

d、洗涤：同b。

e、竞争：用PBST将卵清蛋白母液稀释成0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64，128，256μg/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50μL/孔。然后每孔加入50μL稀释4000倍的抗血清，于37℃温育1h。

f、洗涤：同b。

g、加酶标二抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶3000)，100μL/孔，37C反应1h。

h、洗涤：同b。

i、显色：加底物TMB 100μL/孔，显色15min。

j、终止：加终止液100μL/孔。

k、测定：用酶标仪检测OD₄₅₀

回收率的测定：

将卵清蛋白母液精确稀释成50μg/mL、20μg/mL、5μg/mL、1.25μg/mL，每个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验，以测定的OD₄₅₀平均值为纵坐标，对应的卵清蛋白标准品浓度为横坐标，根据所得的直线回归方程计算卵清蛋白含量的测定值。

回收率的计算：根据不同添加浓度的样品OD值计算相应的抑制率，再根据相应的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收率。

试验结果如下：

1、标准曲线：本实验所获得的抗原检测的线性范围是为1～128μg/mL，如附图所示。

2、所得50％最大吸光值所对应的标准品的浓度，即IC₅₀为63μg/mL。

3、样品回收率：

理论值(μg/mL)      检测浓度平均值(μg/mL)    回收率(％)50                  46.67                     93.3420                  20.03                     100.155                   4.61                      92.21.25                1.17                      93.6