采用花生粕同步酶解发酵生产高浓度D-乳酸的方法及其专用培养基

摘要

本发明公开了一种采用花生粕同步酶解发酵生产高浓度D-乳酸的方法及其专用培养基。所述专用培养基是以花生粕作为有机氮源的发酵培养基。此外，所述专用培养基中还添加有蛋白酶。所述高浓度D-乳酸的生产方法是将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185接种到所述专用培养基中进行发酵，得到高浓度D-乳酸。本发明高浓度D-乳酸的生产方法明显优于现有的高浓度D-乳酸生产方法，具有纯度高、生产效率高、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，特别是涉及一种采用花生粕同步酶解发酵生产高浓度D-乳酸的方法及其专用培养基。

背景技术

乳酸(lactic acid)，学名为α-羟基丙酸(d-hydroxy-propionic acid)，乳酸的化学分子式子为C₂H₅OCOOH，是一种简单的羟基酸。乳酸分子中有一个不对称的碳原子，因此乳酸具有旋光性。L-乳酸为左旋性，D-乳酸为右旋性，DL-乳酸为消旋性。近年来，乳酸的衍生物聚乳酸引起了人们广泛关注，其物理性能与聚苯乙烯非常相似，它除了具有以石油化学品为原料的塑料材料的优异特性外，还有最大的特点是生物可降解性，即在自然界中可自然降解，不造成环境污染，解决了为世界环保所困扰的白色污染问题。但是纯聚L-乳酸(PLLA)的许多性能不稳定，而加入适当比例的聚D-乳酸进行聚合，可以提高性能，拓宽了聚乳酸的应用范围。D-乳酸作为一个手性中心，是合成多种手性物质的前体，在低毒农药、除草剂和化妆品等领域的手性物质合成中具有重要的应用。

丁子建等(丁子建等，生物加工过程，第2卷，第3期，30-36页，2004)首次报道了采用芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)从葡萄糖发酵制备D-乳酸，发酵72小时可产40.7克/升的D-乳酸，葡萄糖转化率67.8％。中国专利CN200610097453.6公开了一种组合发酵生产D-乳酸的工艺，产酸7.5％～13.1％。中国专利CN 200710176056.2报道了利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)半连续发酵生产D-乳酸，该发明方法获得的D-乳酸的浓度最高可达162克/升。中国专利CN200810098908.5报道了芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8菌株及其发酵生产D-乳酸的工艺，发酵液中D-乳酸含量达9.1％～16.5％，D-乳酸光学纯度达99.1％。中国专利CN200810116194.6报道了植物乳杆菌生产D-乳酸，发酵液中总乳酸浓度为18％，D-乳酸光学纯度84～86％。目前报道的发酵法生产L-乳酸浓度可达190克/升，光学纯度可达99％以上(中国专利CN200710176060.9)。与L-乳酸相比，发酵法生产D-乳酸的浓度和光学纯度还需要进一步提高。

由于乳酸发酵生产通常采用酵母抽提物作为氮源，在一定程度上提高了乳酸的生产成本。针对这一问题，目前国内有采用较为廉价的玉米浆、豆粕水解液等作为氮源替代酵母抽提物。豆粕等廉价大分子蛋白通常不能直接用作乳酸发酵的氮源，而需经过酸解等预处理，使大分子蛋白分解为短肽和氨基酸等小分子，以利于乳酸生产菌株的利用。酸解过程不仅需要耐酸的设备，还需要在较高温度下进行，消耗大量能量。同时高温和酸性环境对氨基酸等营养物质有一定的破坏作用。蛋白酶能够将大分子蛋白降解为小分子肽和氨基酸。与酸解过程相比，酶解过程条件更加温和，有利于保存蛋白水解液中的有效成分。通常情况下，作为发酵氮源的蛋白水解预处理过程与发酵过程分离，水解过程需要单独的场地、设备和操作，增加了整个发酵生产过程的设备投入和操作复杂程度。如果能将蛋白水解过程与发酵过程相整合，使蛋白酶解和乳酸发酵同时在发酵罐中进行，就能够省去单独的蛋白酶解操作，从而节省场地和设备投资，有利于降低D-乳酸生产成本。

花生粕是从花生仁经压榨提炼油料后的产品，富含植物蛋白。我国花生的分布非常广泛，在世界上我国花生产量位居前列。花生粕作为另一种分布广泛、高产量、含氮量丰富的廉价氮源，还没有用于D-乳酸发酵生产的报道。

发明内容

本发明提供了利用花生粕同步酶解发酵生产高浓度D-乳酸的专用培养基。

本发明所提供的专用培养基，是以花生粕作为有机氮源的发酵培养基。

在所述专用培养基中还添加有蛋白酶，以将花生粕中的蛋白酶解为小分子肽和氨基酸，并使花生粕酶解过程与发酵生产D-乳酸同步进行。

具体来讲，所述专用培养基包括：工业葡萄糖135～150克/升，花生粕20～40克/升，中性蛋白酶或风味蛋白酶或复合蛋白酶0～0.5克/升，余量为水；所述培养基的pH为5.5～6.5。

所述专用培养基中还可添加有pH调节剂，优选为碳酸钙，其在发酵培养基中含量为70±2克/升。

本发明的第二个目的是提供一种操作简便、纯度较高的利用花生粕同步酶解发酵生产高浓度D-乳酸的方法。

本发明所提供的高浓度D-乳酸的生产方法，是将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185接种到上述发酵培养基中进行发酵，得到高浓度D-乳酸。

在上述采用花生粕同步酶解发酵生产D-乳酸的方法中，所述接种量为5～10％体积比；发酵条件为：37～47℃培养42～70小时；优选为42℃培养48小时。

在发酵培养进行到30～36小时，葡萄糖浓度降至约50克/升，还需补加葡萄糖，使发酵液中葡萄糖浓度达到120～130克/升。

为提高发酵效率，所述发酵过程采用间歇搅拌，三角瓶中发酵，每隔8～12小时振动搅拌一次；发酵罐中发酵，每6～8小时搅拌一次，每次搅拌5～10分钟，转数优选为100转/分钟。

此外，为获得更好的发酵效果，在上述发酵方法实施前，所述菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC No.2185菌种在发酵前还需进行斜面培养和种子培养。

所述斜面培养，是将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No.2185接入斜面培养基中，在37～47℃下培养48～72小时；所述斜面培养基配方为：葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸钙1克/升，琼脂20克/升，溶剂为水，所述斜面培养基的pH为6.5，初始pH为6～7。

所述种子培养，是将经斜面培养的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillusinulinus)CASD CGMCC No.2185再接入种子培养基中，在37～47℃下培养30～36小时；所述种子培养基配方为：所述种子培养基配方为：葡萄糖40克/升，酵母粉5克/升，碳酸钙3克/升，余量为水；所述种子培养基pH为6～7。

用上述方法获得的高浓度D-乳酸以及花生粕在同步酶解发酵生产高浓度D-乳酸中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明首次实现了将花生粕作为廉价氮源同步酶解发酵生产D-乳酸，本发明方法与现有技术相比具有如下优点：

1.发酵培养基成分简单，所选氮源花生粕为生产花生油的副产物，价格低廉，资源丰富，大大降低了生产成本。

2.酶解花生粕和发酵生产乳酸同时进行，省去了有机氮源预处理的步骤，有效的节省了场地占用和设备投入。

3.采用本发明方法，可以显著提高D-乳酸的产量，与目前报道(中国专利CN200810116194.6报道发酵液中乳酸浓度为180克/升)相比，D-乳酸产量有了明显的提高，可达200克/升以上，糖酸转化率达到98.5％(丁子建等报道采用芽孢乳杆菌发酵制备D-乳酸，糖酸转化率67.8％)，光学纯度达到99.3％。

综上所述，本发明高浓度D-乳酸的生产方法明显优于现有的高浓度D-乳酸生产方法，具有纯度高、生产效率高、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，适合大面积推广和应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

具体实施方式

本发明所使用的菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，申请人先前已经保藏，保藏登记号为CGMCC No.2185；该菌株已在申请人发表的论文和申请的专利中公开。

本发明发酵培养基中所使用的工业葡萄糖购自淄博虹宇工业糖有限公司，花生粕购自北京康明威培养基技术有限责任公司，中性蛋白酶购自北京诺维信生物技术有限公司(5万活力单位/克，灭菌后添加)，风味蛋白酶购自北京诺维信生物技术有限公司(2万活力单位/克，灭菌后添加)，复合蛋白酶购自北京诺维信生物技术有限公司(2万活力单位/克，灭菌后添加)。

本发明所述利用花生粕同步酶解发酵生产D-乳酸的基本步骤如下：

(1)斜面培养：将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No.2185接入斜面培养基，将斜面放置在培养箱中培养，培养温度37～47℃，培养时间48～72小时，斜面培养基的初始pH值为6～7。

(2)种子培养：将培养好的菌种转入种子培养基，在培养箱中进行静置培养，培养温度37～47℃，培养时间30～36小时，种子培养基初始pH值为6～7。

(3)发酵培养：以5～10％体积比的接种量，将培养好的种子液转入发酵培养基进行发酵培养。发酵温度37～47℃，发酵时间42～70小时，发酵罐中发酵过程中可进行间歇性搅拌，每6～8小时搅拌一次，每次搅拌5～10分钟，转数优选100转/分钟。三角瓶中发酵每隔8～12小时振动搅拌一次。

(4)发酵罐葡萄糖补料：上述步骤(3)中发酵培养进行到30～36小时，葡萄糖浓度降至约50克/升，补加葡萄糖，使发酵液中葡萄糖浓度达到120～130克/升。

(5)样品测定：取发酵液以6,000转/分钟的速度离心5分钟，取上清液稀释适当倍数，检测葡萄糖含量，D-乳酸含量和L-乳酸含量。葡萄糖浓度用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。L-乳酸和D-乳酸含量采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定，手性分离柱(日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10 W(3μ)4.6ID×50mm，光学异体分离用)，0.002mol/L硫酸铜为流动相，流量0.5mL/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。D-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L0625，L-乳酸标准品为Sigma-Aldrich公司产品，货号为L1750。在该色谱条件下，D-乳酸标准品的保留时间为9.724分钟。

D-乳酸光学纯度计算方法：D-乳酸光学纯度(％)＝(D-乳酸浓度(克/升)÷[D-乳酸浓度(克/升)+L-乳酸浓度(克/升)])×100％[Bioresource Technology 101(2010)6494～6498]

糖酸转化率计算方法：转化率(％)＝(D-乳酸浓度(克/升)÷葡萄糖消耗量(克/升))×100％

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。其目的是为了更好的理解本发明的内容，因此，所举例的实例并不限制本发明的保护范围。

实施例1利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在37℃下发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，发酵时间42小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基：葡萄糖10克/升，酵母粉5克/升，碳酸钙1克/升，琼脂20克/升，溶剂为水，所述斜面培养基的pH为6.5，121℃灭菌20分钟。

种子培养基：葡萄糖40克/升，酵母粉5克/升，碳酸钙3克/升，溶剂为水，所述种子培养基的pH为6.5，121℃灭菌20分钟。

发酵培养基：工业葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，中性蛋白酶0.1克/升，碳酸钙70克/升，余量为水，所述发酵培养基的pH为6.5，115℃灭菌20分钟。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：将菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASDCGMCC No 2185接种于斜面培养基上，42℃培养72小时；

(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有30mL种子培养基的100mL三角瓶中，42℃静置培养36小时，然后以10％体积比的接种量接种到新的种子培养基中，42℃静止培养36小时，即活化种子一次，制得种子培养液；

(3)发酵培养：将上述种子培养基以10％体积比的接种量接种到发酵培养基(50mL发酵液/100mL三角瓶)中，放置在37℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养42小时，结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。D-乳酸含量112±3克/升，葡萄糖含量20±1克/升，糖酸转化率97.4％，D-乳酸光学纯度达到99.2％。

实施例2利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在42℃下发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，发酵时间42小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)发酵培养：将上述种子培养基以10％体积比的接种量接种到发酵培养基(50mL发酵液/100mL三角瓶)中，放置在42℃静置培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养42小时，结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。D-乳酸含量129±2克/升，葡萄糖含量0.3±0.2克/升，糖酸转化率96.0％，D-乳酸光学纯度达到99.1％。

实施例3利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在47℃下发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，发酵时间42小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基、种子培养基和发酵培养基同实施例1。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)发酵培养：将上述种子培养基以10％体积比的接种量接种到发酵培养基(50mL发酵液/100mL三角瓶)中，放置在47℃静置培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养42小时，结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复。D-乳酸含量128±2克/升，葡萄糖含量3.7±0.6克/升，糖酸转化率97.5％，D-乳酸光学纯度达到99.3％。

实施例4利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在20克/升花生粕浓度下发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，发酵温度42℃，发酵时间48小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基和种子培养基同实施例1；

发酵培养基：花生粕浓度为20克/升，同时添加工业葡萄糖135克/升，中性蛋白酶0.5克/升，碳酸钙70克/升，余量为水，所述发酵培养基的pH为6.5，115℃灭菌20分钟。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)发酵培养：将上述种子培养基以10％体积比的接种量接种到发酵培养基(50mL发酵液/100mL三角瓶)中，42℃静置培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时，结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复，结果表明，D-乳酸含量102.0±4克/升，葡萄糖含量30±2克/升，糖酸转化率97.0％，D-乳酸光学纯度达到99.4％。

实施例5利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在30克/升花生粕浓度下发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，发酵温度42℃，发酵时间48小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基：花生粕浓度为30克/升，同时添加工业葡萄糖135克/升，中性蛋白酶0.5克/升，碳酸钙70克/升，余量为水，所述发酵培养基的pH为6.5，115℃灭菌20分钟。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)发酵培养：同实施例4。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复，结果表明，D-乳酸含量128±5克/升，葡萄糖含量3±0.5克/升，糖酸转化率96.5％，D-乳酸光学纯度达到99.2％。

实施例6利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在40克/升花生粕浓度下发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，发酵温度42℃，发酵时间48小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基：花生粕浓度为40克/升，同时添加工业葡萄糖135克/升，中性蛋白酶0.5克/升，碳酸钙70克/升，余量为水，所述发酵培养基的pH为6.5，115℃灭菌20分钟。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)发酵培养：同实施例4。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复，结果表明，D-乳酸含量129±5克/升，葡萄糖含量4±3克/升，糖酸转化率97.8％，光学纯度达到99.2％。

实施例7利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185添加不同种类的蛋白酶发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，温度42℃静置发酵60小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基：设计3种培养基，分别添加中性蛋白酶0.5克/升，风味蛋白酶0.5克/升，复合蛋白酶0.5克/升，同时添加工业葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，碳酸钙70克/升，余量为水，所述发酵培养基的pH为6.5，115℃灭菌20分钟。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)发酵培养：将上述种子培养基以5％体积比的接种量接种到发酵培养基(50mL发酵液/100mL三角瓶)中，42℃静置培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养60小时，结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复，结果表明，添加风味蛋白酶，复合蛋白酶，中性蛋白酶的培养基分别产D-乳酸108±1克/升，112±1克/升，129±3克/升，糖酸转化率最高达98.0％，D-乳酸光学纯度最高达到99.2％。

实施例8利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在不添加中性蛋白酶的情况下发酵生产D-乳酸，50mL发酵液/100mL三角瓶，温度42℃，发酵时间48小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

斜面培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基：工业葡萄糖135克/升，花生粕40克/升，碳酸钙70克/升，余量为水，所述发酵培养基的pH为6.5，115℃灭菌20分钟。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)发酵培养：将上述种子培养基以10％体积比的接种量接种到发酵培养基(50mL发酵液/100mL三角瓶)中，42℃静止培养，每隔12小时振荡搅拌一次，培养48小时结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵结束后发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率、D-乳酸光学纯度。该实验共设3次重复，结果表明，D-乳酸含量58±3克/升，葡萄糖含量75±3克/升，糖酸转化率96.6％，D-乳酸的光学纯度99.3％。

实施例9利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCCNo.2185在5升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，发酵温度42℃，发酵时间66小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

(1)斜面培养基同实施例1；

(2)种子培养基同实施例1；

(3)发酵培养基：工业葡萄糖150克/升，花生粕40克/升，中性蛋白酶0.5克/升，碳酸钙70克/升，余量为水，所述发酵培养基的pH为6.5，115℃灭菌20分钟。再配制糖母液和碳酸钙粉末，115℃灭菌20分钟。

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：将步骤1培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30mL种子培养基的100mL三角瓶中，42℃静置培养36小时，然后将30mL种子培养液接种到300mL新的种子培养基中，42℃静置培养36小时，制得种子培养液；

(3)发酵培养：将300mL步骤(2)制得的种子培养液在无菌条件下接入装有3.7升发酵培养基的5升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，42℃静置培养，每隔6小时搅拌一次，每次以100转/分的转速搅拌5分钟，培养30小时，此时发酵液中葡萄糖浓度约为50克/升，补加葡萄糖280克，补加碳酸钙160克，使发酵液中葡萄糖浓度达到120～130克/升。66小时结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率和D-乳酸光学纯度。结果表明：D-乳酸含量205±3克/升，葡萄糖含量1.0±0.6克/升，糖酸转化率98.5％，D-乳酸的光学纯度99.3％。

实施例10利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)CASD CGMCC№2185在50升全自动发酵罐中发酵生产D-乳酸，发酵温度42℃，发酵时间70小时。

本实施例中所使用的各培养基的组成如下：

(1)斜面培养基同实施例1；

(2)种子培养基同实施例1；

(3)发酵培养基：同实施例9；

该发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：

(1)斜面培养：同实施例1；

(2)种子培养：将步骤1培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于装有30mL种子培养基的100mL三角瓶中，42℃静置培养36小时，然后将30mL种子培养液接种到300mL新的种子培养基中，42℃静置培养36小时，然后将300mL种子培养液接种到3000mL新的种子培养基中，42℃静置培养36小时，制得种子培养液；

(3)发酵培养：将3000mL步骤2制得的种子培养液在无菌条件下接入装有37升发酵培养基的50升全自动发酵罐(上海保兴BIOTECH)中，42℃静置培养，每隔8小时搅拌一次，每次以100转/分的转速搅拌5分钟，培养36小时，此时发酵液中葡萄糖浓度约为50克/升，补加葡萄糖2800克和1600克碳酸钙，使发酵液中葡萄糖浓度达到120～130克/升。70小时结束发酵。

发酵结束后，根据上述具体实施方式中所述的检测和计算方法，检测发酵液中D-乳酸含量、葡萄糖含量，计算转化率和D-乳酸光学纯度。结果表明：D-乳酸含量203±3克/升，葡萄糖含量2±1克/升，糖酸转化率97.8％，D-乳酸的光学纯度99.2％。