苹果多酚在制备护肝药物、保健食品或食品中的应用

摘要

本发明公开了苹果多酚在制备护肝药物、保健食品或食品中的应用。实验结果证明：苹果多酚具有肝脏保护作用，对多种化学性物质如：CCl

说明书

技术领域

本发明涉及苹果多酚的新用途，特别是涉及苹果多酚在制备护肝药物、保健食品或食品中的应用。

背景技术

苹果多酚(AP)是苹果中天然存在的一类重要生物活性物质。AP包括多种酚类物质，可分为酚酸(如绿原酸)及其羟基酸酯类、糖类衍生物和黄酮类化合物(如儿茶素、表儿茶素、原花青素、二羟基查耳酮、黄酮醇配糖体等)。一般来说，苹果的品种不同，各主要成分的含量也有差异。另外，未成熟的苹果与成熟苹果相比，成分组成相似，但成分含量上有很大的差异，特别是多酚类物质的含量高出成熟苹果含量的10倍以上。研究还发现果皮中的多酚含量远远高于果肉中的，这也解释了在苹果加工过程中去掉果皮会减轻褐变的现象。

苹果多酚的来源：例如，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司生产。

主要理化指标：：苹果多酚(UV)20.0～90.0％，根皮苷(HPLC)1.0～20.0％，绿原酸(HPLC)1.0～30.0％，原花青素B2(HPLC)1.0～30.0％。

AP的制备，目前主要集中在有机溶剂提取上，也有关于用吸附分离及用超临界二氧化碳流体萃取的研究。

AP具有较强的抗氧化、清除自由基的能力。其抗氧化特性是通过多种途径体现出来的。AP以大量的酚羟基作为氢供体，对多种活性氧具有清除作用，减少氧自由基产生的可能性，同时也是各种自由基有效的清除剂；其次AP以邻位二酚羟基与金属离子螯合，减少金属离子对氧化反应的催化；再者对于有氧化酶存在的体系，如体内主要的氧自由基生成的源头，AP对其有显著的抑制能力；AP还能与VC和VE等抗氧化剂之间产生协同效应，具有增效剂的作用。研究结果证明，AP的许多生理活性比茶多酚高100倍以上，其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍。

以缩合丹宁为主体的AP对微生物具有广谱抗性(包括对丝状真菌、酵母、细菌、病毒的抑制)。其作用机理可能是多种因素共同作用的结果，如对蛋白质的高度结合能力、通过与细胞膜结合改变微生物的代谢以及对金属的络合作用等。

AP对生物大分子如蛋白质、多糖的结合特性以及与金属离子的络合特性等化学性质使其具有多种生物活性，而这些生物活性最本质的方面体现在多酚对酶促反应的影响上。

另外，AP还能抑制血管紧张素转移酶(ACE)，防止血管收缩，血压升高；AP对食品或环境来源的苯并芘等致癌物的致癌性有抑制作用；还具有抗突变作用；由于多酚类具有较高的紫外线吸收特征，特别是对能量高、破坏能力大的紫外区有更强的吸收，可作为抗衰老和防晒剂的有效成分。

由于AP具有多种药理、保健功能，可开发延缓衰老、预防肿瘤、有效抑制高血压、高血脂及心脑血管疾病的医疗保健品及多种保健食品；AP能有效抑制组胺的游离，因而被作为抗变异药物使用，用于特异性皮炎等病症的预防和治疗；还可以将AP作为添加剂用于牙膏中，既有防龋齿作用又有洁齿作用。日本最新研究发现，从苹果的提取物中制成促进头发生长的药剂——药用毛活林PB，对治疗脱发有特殊效果，这一发现提高了AP的高附加值。

由于AP有抗氧化、消臭、保鲜、保香、护色、防止维生素损失等作用，目前它在食品工业中可应用于水产制品、畜肉制品、干香肠制品、面包制品、油脂或含有油脂食品、清凉饮料等的加工制造，可显著提高其产品质量及保质期。还用于口香糖中抑制口臭。

另外，AP还有减肥和美白的功效，在护肤中起到多重作用(如抗衰老、抗辐射、增白、保湿、阻碍紫外线吸收等)，对多种因素造成的皮肤老化都有独特的功效。目前国际上已研制出多种抗衰老防辐射的绿色化妆品。

AP作为一类具有生物活性的天然化合物，对人们在强身健体、防病治病、延年益寿等各方面均有显著作用。

目前，苹果多酚在制备护肝药物、保健食品或食品中的应用未见文献报道。

苹果这一资源丰富的水果开发还有待于进一步研究，以期开发出新的药物和保健品，使其在医疗、保健等方面有更多应用。

发明内容

本发明的目的在于提供苹果多酚在制备护肝药物、保健食品或食品中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

苹果多酚在制备护肝药物、保健食品或食品中的应用。

所述药物、保健食品或食品的剂型为硬胶囊剂、软胶囊剂、散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、蜜膏剂、口服液、酒剂、注射剂或茶剂。

所述食品为饮料、糖果、大米制品、面粉制品、肉制品、鱼制品或食用油。

实验结果证明：苹果多酚(AP)具有肝脏保护作用，对多种化学性物质，如CCl₄、乙醇、D-GalN和顺铂(CP)等所致肝损伤模型具有显著的保护作用，且具有利胆作用，AP对免疫性肝损伤也具有保护作用。

附图说明

图1为CCl₄急性肝损伤模型小鼠肝组织光镜下病理学观察。(肝组织HE染色光镜下观察的病理图片(×400)：(A)空白组，(B)0.1％CCl₄组，(C)BP(联苯双酯滴丸)200mg/kg+0.1％CCl₄组，(D)AP200mg/kg+0.1％CCl₄组，(E)AP 400mg/kg+0.1％CCl₄组，(F)800mg/kg+0.1％CCl₄组)

图2为D-GalN急性肝损伤模型小鼠肝组织光镜下病理学观察。(肝组织HE染色光镜下观察的病理图片(×400)：(A)空白组，(B)D-GalN(600mg/kg)组，(C)BP(联苯双酯滴丸)200mg/kg+D-GalN(600mg/kg)组，(D)AP 200mg/kg+D-GalN(600mg/kg)组，(E)AP 400mg/kg+D-GalN(600mg/kg)组，(F)AP800mg/kg+D-GalN(600mg/kg)组)

图3为乙醇急性肝损伤模型小鼠肝组织光镜下病理学观察。(肝组织HE染色光镜下观察的病理图片(×400)：(A)空白组，(B)乙醇(4.8g/kg)组，(C)BP(联苯双酯滴丸)200mg/kg+乙醇(4.8g/kg)组，(D)AP 200mg/kg+乙醇(4.8g/kg)组，(E)AP 400mg/kg+乙醇(4.8g/kg)组，(F)AP 800mg/kg+乙醇(4.8g/kg)组)

图4为CP急性肝损伤模型小鼠肝组织光镜下病理学观察。(肝组织HE染色光镜下观察的病理图片(×400)：(A)空白组，(B)CP(3.5mg/kg)组，(C)BP(联苯双酯滴丸)200mg/kg+CP(3.5mg/kg)组，(D)AP 200mg/kg+CP(3.5mg/kg)组，(E)AP 400mg/kg+CP(3.5mg/kg)组，(F)AP 800mg/kg+CP(3.5mg/kg)组)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

苹果多酚的来源：

主要理化指标：：苹果多酚(UV，g/100g)20.0～90.0，根皮苷(HPLC，g/100g)1.0～20.0，绿原酸(HPLC，g/100g)1.0～30.0，原花青素B2(HPLC，g/100g)1.0～30.0。

实验表明苹果多酚的理化指标在下述范围中对肝损伤细胞都具有较好的保护作用。

  苹果多酚(UV，g/100g)  根皮苷(HPLC，g/100g)  绿原酸(HPLC，g/100g)  原花青素B2(HPLC，g/100g)  实施例1  30  20  30  20  实施例2  20  20  30  30实施例390523  实施例4  69  1  15  15  实施例5  88  10  1  1

实施例6.AP抗肝微粒体自发性脂质过氧化作用

大鼠自由饮食饮水适应一周，禁食不禁水12h后，断头处死，迅速取肝置于冰冷的生理盐水中，冲洗3次，洗去表面残血，滤纸吸干，称重。加入生理盐水，低温匀浆，制成10％(0.1g肝组织：0.9ml生理盐水)的匀浆液后，3000r/min离心10min，取上清液，储存于冰箱-80℃冷冻室备用。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。临用时，根据蛋白含量，用生理盐水稀释成蛋白含量为4mg/ml的肝匀浆供试液。

实验分为空白对照组，AA组(抗坏血酸，阳性对照组)以及AP实验组。空白对照组加入1ml双蒸水，其余各给药组均加入不同浓度的药物溶液1ml。各组分别加入1ml肝匀浆，50μl FeSO₄和20μl L-Cys，加药后37℃水浴孵育30min，各组加入20％醋酸2ml，终止反应。3000r/min离心15min，取上清液3ml，加入0.67％TBA 1ml，沸水浴10min后流水冷却。点板，应用酶标仪在532nm下检测其吸光度值，并计算清除率及IC₅₀值。

清除率＝(A_{空白对照组}-A_{待测药物组})/A_{空白对照组}×100％

结果表明，在本实验条件下，当AP的浓度在0.014-10mg/ml(本文中AP浓度均以苹果多酚计，以此类推)时，对FeSO₄-L-Cys诱导的大鼠肝微粒体自发性脂质过氧化生成MDA有较好的抑制效果，并呈现出一定的剂量依赖性(表1)。即AP具有抑制自发氧化条件下的脂质过氧化作用，IC₅₀＝0.1063mg/ml。

表1  AP对FeSO₄-L-Cys诱导的

大鼠肝微粒体自发性脂质过氧化生成MDA的抑制作用

^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001与空白组相比。

实施例7.AP对2，2-二苯基-1-苦肼基(2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，以下简称DPPH)自由基的清除作用

取不同浓度的试验样品溶液100μl与1×10^-4mol/L的DPPH乙醇溶液900μl快速混匀后分别于0、5、10、15、20、25、30、40min......用酶标仪在517nm处测定其吸光度，直至吸光度相对稳定。取稳定时样品的吸光度值，按下式计算清除率及IC₅₀值：

清除率(％)＝[Ac-(Ai-Aj)]/Ac×100％

注：Ac-DPPH溶液与样品溶剂(双蒸水)的吸光度；

Ai-DPPH溶液与样品溶液的吸光度；

Aj-DPPH溶剂(无水乙醇)与样品溶液的吸光度；

结果表明，当反应进行120min以后，体系的吸光度变化不大，则认为该体系达到平衡。

表2反映的是体系反应120分钟时，各个浓度的AP溶液对DPPH自由基的清除率。结果发现AP的浓度在10^-4-10mg/ml时表现出明显的清除DPPH自由基的能力，并呈一定的剂量依赖关系。计算得到：AP清除DPPH自由基的IC₅₀＝2.46×10^-3mg/ml，而阳性药AA的IC₅₀＝2.26mg/ml。

表2 AP对DPPH自由基清除率的影响(时间＝120分钟)

每个数值是三次实验的平均值，^*p＜0.05与只含DPPH和溶剂的空白组相比

实施例8.AP对CCl₄所致小鼠急性肝损伤细胞的保护作用

小鼠60只，随机分成6组，每组10只：空白对照组、CCl₄组、阳性药组(联苯双酯滴丸，BP，200mg/kg)、AP给药组(200、400、800mg/kg)。BP组及AP给药组每天灌胃给药，给药体积为0.2ml/10g，空白及CCl₄组每天i.g.相同体积的蒸馏水。每天给药一次，连续给药7天。末次给药1h后，除空白对照组外，每组分别i.p.0.1％CCl₄大豆油溶液，给药体积0.1ml/10g，空白对照组i.p.相同体积的食用大豆油。禁食不禁水16h后动物称重，摘眼球取血，处死动物，取肝脏并称重。所测指标有：肝体比，血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量，并取肝脏右小叶放入10％甲醛中固定，冰冻切片，做常规HE染色，光镜下进行组织病理学检查。

结果表明，与空白对照组比较，i.p.0.1％CCl₄使小鼠的肝比重明显增加，血清中ALT和AST的含量明显升高，说明模型成功。AP 200、400和800mg/kg均可以显著地减小CCl₄引起的肝比重增加，AP 800mg/kg还可以明显抑制CCl₄引起的血清中ALT、AST活性的升高，AP 400mg/kg能够显著抑制AST的升高，而对ALT的影响没有显著性。结果见表3。

表3AP对CCl₄所致小鼠急性肝损伤肝比重，血清ALT，AST含量的影响(平均值±标准误差，n＝10)

##P＜0.01，###P＜0.001与空白组相比；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001与CCl₄组相比。

病理组织学观察

①肝组织的肉眼观察

空白对照组：肝外观颜色红润，表面光滑，质脆柔软。

CCl₄组：肝脏体积明显增大，颜色暗红或呈土黄色，表面粗糙，肝边缘钝，质地较韧。

AP给药组：肝脏在色泽、质地、大小及表面光滑度较CCl₄组有明显改善。

②肝组织切片的病理组织学观察

病理图片见图1。光镜下检查结果如下：

空白对照组：肝小叶结构完整清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝血窦清晰，肝细胞形态正常，胞浆丰富。

CCl₄组：肝小叶结构模糊，显示以中央静脉为中心的出血和变性坏死，多以点状坏死为主，可见少数小片状坏死。小叶内大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松，有的呈气球样变，可见广泛的空泡坏死、点状坏死和灶性坏死。坏死区被脂肪变性细胞所包绕，坏死区内有较多淋巴细胞和炎症细胞浸润，细胞核明显大小不等，呈不同程度的固缩。

AP组：肝小叶结构基本清晰，肝细胞形态较正常，肝细胞肿胀、充血明显减轻，少见坏死，少量肝细胞脂肪变性，较少的炎症细胞浸润。随着AP剂量的增大，对肝细胞的保护作用也随之增强。

实施例9.AP对D-GalN所致小鼠急性肝损伤细胞的保护作用

末次给药1h后，除空白对照组外，每组分别i.p.D-GalN 600mg/kg，给药体积0.2ml/10g，空白对照组i.p.给予相同体积的生理盐水。其它实验方法同上。

结果表明，与空白对照组比较，D-GalN组小鼠血清中ALT和AST活性明显升高，而肝比重未发生显著性变化，说明造模成功。与D-GalN组比较，AP 800mg/kg可以显著地抑制由D-GalN引起的血清中ALT和AST的活性升高；AP 400mg/kg对ALT活性有显著性降低作用，而对血清中AST的活性没有显著性影响；AP200mg/kg对血清中ALT和AST都未产生明显地影响。结果见表4。

表4AP对D-GalN所致小鼠急性肝损伤肝比重，血清ALT，AST含量的影响(平均值±标准误差，n＝10)

###P＜0.001与空白组相比；^*P＜0.05，^**P＜0.01与D-GalN组相比。

病理组织学观察

①肝组织的肉眼观察

空白对照组：肝外观颜色红润，表面光滑，质脆柔软。

D-GalN组：肝脏色泽较暗，部分有明显白色坏死灶。

AP组：肝脏色泽较暗，仍有白色坏死小点。

②肝组织切片的病理组织学观察

病理图片见图2。光镜下检查结果如下：

空白对照组：肝小叶结构完整清晰，肝细胞束以中央静脉为中心呈放射状排列，汇管区无炎性细胞浸润。

D-GalN组：肝组织均出现病变，肝小叶结构破坏，小叶内肝细胞排列紊乱，大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，肝窦枯否氏细胞增生及肝细胞变性，有的呈气球样变，可见广泛的空泡坏死点，点状坏死和灶状坏死，并且汇管区出现炎性细胞浸润，纤维结缔组织增生，增生的纤维组织有向肝小叶延伸的倾向。

AP组：肝小叶结构存在，肝细胞变性坏死程度呈不同程度的减轻，肝细胞束呈放射状排列，轻度颗粒样变性，肝血窦清晰，但仍可见到单个坏死肝细胞和嗜酸性变性肝细胞，汇管区局部炎性细胞浸润，提示AP对D-GalN所致小鼠急性肝损伤细胞有一定的保护作用。

实施例10.AP对乙醇所致小鼠急性肝损伤细胞的保护作用

末次给药1h后，除空白对照组外，每组分别i.g.50％(v/v)乙醇，给药体积0.12ml/10g(相当于乙醇4.8g/kg)，空白对照组i.g.给与相同体积的蒸馏水。其它实验方法同上。

结果表明，与空白对照组比较，乙醇模型组小鼠的肝比重、血清中ALT和AST含量均显著升高，说明小鼠乙醇急性肝损伤模型复制成功。与乙醇组比较，AP 200、400和800mg/kg三个剂量组能够剂量依赖地降低乙醇急性肝损伤小鼠血清中ALT的含量，AP 400、800mg/kg可以显著降低血清中AST的含量，而只有AP 800mg/kg对乙醇引起的肝比重增加有显著性降低作用。结果见表5。

表5AP对乙醇所致小鼠急性肝损伤肝比重，血清ALT，AST含量的影响(平均值±标准误差，n＝10)

##P＜0.01，###P＜0.001与空白组相比；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001与乙醇组相比。

病理组织学观察

①肝组织的肉眼观察

动物给予乙醇后，出现明显的醉酒现象，如反应迟钝，嗜睡，亢奋等。

空白对照组：肝脏颜色鲜红，表面光滑，质脆柔软。

乙醇组：体积增大，表面暗红或呈土黄色，表面粗糙，质地较韧。

AP组：肝脏在色泽、质地、大小及表面光滑度较乙醇模型组有明显改善。

②肝组织切片的病理组织学观察

病理图片见图3。光镜下检查结果如下：

空白对照组：肝小叶结构正常，肝细胞条索排列规则有序，偶见脂肪滴，但未见炎症与坏死现象。

乙醇组：肝小叶结构紊乱，肝细胞中度脂肪变性，少量呈点状或凝固性坏死灶，间质中有炎性细胞浸润。

AP组：肝小叶结构基本正常，与乙醇模型组比较，肝组织仍可见肝细胞脂肪变性或气球样变性，有轻度浊肿现象，但未见炎性细胞浸润及肝细胞坏死。

实施例11.AP对CP所致小鼠肝损伤细胞的保护作用

小鼠60只，随机分成6组，每组10只：空白对照组、CP组、BP组(200mg/kg)、AP给药组(200、400、800mg/kg)。给药后第3天，在继续给药的同时，除空白对照组外，i.p.CP 3.5mg/kg，连续5天。药物与CP给药间隔6h，以保证药物在CP注射前能被充分吸收。CP停药后，继续i.g.药物2天(药物共给药9天，CP共给药5天)。空白对照组在此期间i.g.相同体积的蒸馏水，i.p.相同体积的生理盐水。末次给药后24h，取血取肝，测定指标有：体重变化，肝重，血清中ALT、AST，病理组织学检查。

结果表明，与空白对照组比较，CP模型组小鼠的体重减少量、血清中ALT和AST含量均显著升高，而肝比重未发生明显的变化，说明CP小鼠肝损伤模型复制成功。与CP模型组比较，AP 800mg/kg可以显著降低CP肝损伤小鼠血清中ALT的含量，而对CP引起的体重下降和血清中AST的含量没有显著性影响；AP 200、400mg/kg对CP引起的体重降低和血清中ALT、AST的含量升高均无显著性影响。结果见表6。

表6AP对顺铂所致小鼠急性肝损伤肝比重，血清ALT，AST含量的影响(平均值±标准误差，n＝10)

###P＜0.001与空白组相比；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001与顺铂组相比。

病理组织学观察

①肝组织的肉眼观察

空白对照组：肝脏颜色鲜红，表面光滑，质脆柔软。

CP组：肝脏出现明显的萎缩现象，表面暗红。

AP组：肝脏在色泽、质地、大小及表面光滑度较CP组有一定程度的改善。

②肝组织切片的病理组织学观察

病理图片见图4。光镜下检查结果如下：

空白对照组：肝小叶结构完整清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝血窦清晰，肝细胞形态正常，胞浆丰富。

CP组：肝小叶结构模糊，显示以中央静脉为中心的出血和变性坏死，多以点状坏死为主，也可见小片状坏死。小叶内大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松，有的呈气球样变，可见广泛的空泡坏死、点状坏死和灶性坏死。坏死区有较多炎症细胞浸润，细胞核明显大小不等，呈不同程度的固缩。

AP组：肝小叶结构基本清晰，肝细胞肿胀、充血有减轻，仍可见坏死、炎症细胞浸润现象。