一种免PCR扩增无需检测仪器的核酸分析方法

摘要

本发明涉及一种免PCR扩增无需检测仪器的核酸分析方法。具体地，本发明提供了一种携带检测探针的生物素-亲和素的复合物，所述复合物包括：(i)引发序列；(ii)第n级亲和素，其中n为1-20的正整数；(iii)生长序列，所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合，而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合，其中n为1-20的正整数；和(iv)检测探针，所述的检测探针是一端标记有生物素的寡核苷酸单链，而且所述检测探针中的生物素与第n级亲和素结合。本发明的复合物无需PCR即可快速检测核酸。

说明书

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，具体地涉及一种免PCR扩增无需特殊检测仪器的核酸分析方法。

背景技术

目前常规分析方法的灵敏度还不足以直接分析检测生物的目标核酸(DNA或RNA)，一般均需对目标片断进行PCR扩增，使其富集到一定浓度后才可用于检测。由于PCR反应具有强大的扩增效率，易造成交叉污染，极微量的污染便可导致假阳性结果。

一直以来，科研工作者开发了一些免PCR扩增的方法用于核酸分析，这些方法大多是放大信号而非富集目标物。如：杂交捕获法(WO 03/078966，美国Digene公司)，bDNA法，Monica K等人综合运用Luminex流式荧光技术和Dendrimer技术直接检测目标核酸(JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，July2005，p.3255-3259，Vol.43，No.7)。

此外，美国Nanosphere公司还开发了商业化的仪器和试剂，不扩增目标DNA片断而是扩增信号，做到了直接检测目标核酸(www.nanosphere.us)。这些方法均需特殊的配套仪器对产生的信号进行检测，成本较高。

然而，在我国购置价格昂贵的仪器对于许多用户或许多场合而言是不现实的。另外，购置仪器后维护成本高和使用率低也成为一大问题。

因此本领域需要一种成本低廉又无需PCR扩增的核酸分析方法，便于核酸分析技术的普及推广。

发明内容

本发明的目的就是提供一种成本低廉又无需PCR扩增的核酸分析方法。

本发明的另一目的是提供一种可以在不使用昂贵检测仪器或基本上无需检测仪器的情况下进行核酸分析的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种携带检测探针的生物素-亲和素的复合物，所述复合物包括：

(a)固相载体；

(b)根序列，所述的根序列是固定于所述固相载体表面上的寡核苷酸单链；

(c)引发序列，所述的引发序列是互补结合于所述根序列的、并且在一端标记有生物素的寡核苷酸单链；

(d)第n级亲和素，其中n为1-20的正整数；并且当n为1时，则第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素；

(e)生长序列，所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合，而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合，其中n为1-20的正整数；和

(f)检测探针，所述的检测探针是一端标记有生物素的寡核苷酸单链，而且所述检测探针中的生物素与第n级亲和素结合，并且所述的检测探针包括与目标核酸检测区互补的检测互补结合区以及与信号探针互补的信号互补结合区。

在另一优选例中，所述的固相载体是微球，更佳地为磁性微球。

在另一优选例中，n为6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。

在另一优选例中，所述的根序列的长度为20-60个碱基，更佳地为25-50个碱基；

在另一优选例中，所述的引发序列的长度为10-50个碱基，更佳地为15-40个碱基。

在另一优选例中，所述引发序列与根序列的互补结合区的长度为20-40bp，更佳地为20-30bp。

在另一优选例中，所述的生长序列的长度为8-30个碱基，更佳地为10-20个碱基。

在另一优选例中，所述的生长序列是长度为8-20个碱基的polyT。

在另一优选例中，所述的检测探针的长度为40-80个碱基，更佳地50-70个碱基。

在另一优选例中，所述的检测探针中与目标核酸检测区互补的检测互补结合区长度为20-30个碱基。

在另一优选例中，所述的检测探针中与信号探针互补的信号互补结合区长度为15-20个碱基。

在另一优选例中，所述的检测探针中的检测互补结合区和信号互补结合区之间是长度为0-50个碱基(较佳地4-30个碱基，更佳地8-15个碱基)的间隔区。

在本发明的第二方面，提供了一种携带检测探针的生物素-亲和素的复合物，所述复合物包括：

(i)引发序列，所述的引发序列是互补结合于所述根序列的、并且在一端标记有生物素的寡核苷酸单链；

(ii)第n级亲和素，其中n为1-20的正整数；并且当n为1时，则第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素；

(iii)生长序列，所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合，而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合，其中n为1-20的正整数；和

(iv)检测探针，所述的检测探针是一端标记有生物素的寡核苷酸单链，而且所述检测探针中的生物素与第n级亲和素结合，并且所述的检测探针包括与目标核酸序列互补的检测互补结合区以及与信号探针互补的信号互补结合区。

在本发明的第三方面，提供了一种核酸检测分析方法，在本发明第一或第二方面中所述的生物素-亲和素的复合物存在下进行检测。

在本发明的第四方面，提供了一种在本发明第一或第二方面中所述的生物素-亲和素的复合物的用途，它用于制备无需聚合酶链反应的核酸检测的检测试剂。

在本发明的第五方面，提供了一种无需聚合酶链反应的、用于检测样品中是否存在目标核酸序列的核酸检测方法，所述方法包括步骤：

(a)将待检测样品与在本发明第一或第二方面中所述的携带检测探针的生物素-亲和素的复合物混合，其中所述的待检测样品是含核酸单链分子的溶液，从而形成“目标核酸-生物素-亲和素复合物”的第一偶联物；

(b)分离所述的第一偶联物，并向含所述的第一偶联物的溶液加入与所述生物素-亲和素复合物上的检测探针互补结合的信号探针，从而形成“目标核酸-生物素-亲和素复合物-信号探针”的第二偶联物；

(c)分离所述的第二偶联物；

(d)从分离的所述第二偶联物上解离下信号探针；和

(f)检测所述信号探针的存在与否和或数量，从而确定在样品中是否存在目标核酸序列或其数量。

在另一优选例中，步骤(f)是通过在金纳米颗粒溶液中进行检测。

在本发明的第六方面，提供了一种制备携带检测探针的生物素-亲和素的复合物的方法，包括步骤：

(a)将用作根序列的第一寡核苷酸单链固定于固相载体，

(b)将用作引发序列的第二寡核苷酸单链与所述根序列接触，所述的第二寡核苷酸单链是在一端标记有生物素的寡核苷酸单链，从而形成相对稳定的“根序列-引发序列”杂合体，其中所述的引发序列互补结合于所述的根序列；随后去除过量的引发序列；

(c)将亲和素与所述引发序列上的生物素接触并结合；随后去除过量的、未结合的亲和素，从而获得第1级生物素-亲和素的复合物；

或者所述步骤(c)还包括重复以下步骤(c1)-(c2)共1至n-1次，从而获得第n级生物素-亲和素的复合物，其中，n为2-20的正整数：

(c1)将用作生长序列的第三寡核苷酸单链与上一步骤获得的生物素-亲和素的复合物接触，其中所述第三寡核苷酸单链是两端标记有生物素的寡核苷酸单链，从而使得所述生长序列中位于一端的生物素与上一步骤中形成的结合状态的亲和素形成结合；随后去除过量的、未结合的生长序列；

(c2)将亲和素与步骤(c1)中所述生长序列另一端的生物素接触并结合；随后去除过量的、未结合的亲和素。

(d)将检测探针与步骤(c)的第n级生物素-亲和素的复合物接触并结合，从而制得携带检测探针的生物素-亲和素的复合物，

其中所述的检测探针是一端标记有生物素的寡核苷酸单链，而且所述检测探针中的生物素与第n级亲和素结合，并且所述的检测探针包括与目标核酸检测区互补的检测互补结合区以及与信号探针互补的信号互补结合区；

在另一优选例中，还包括步骤：将上一步骤中形成的携带检测探针的生物素-亲和素的复合物与结合于固相载体的根序列解离开，从而获得不含固相载体和根序列的携带检测探针的生物素-亲和素的复合物。

在本发明的一个优选例中，还提供了一种免PCR扩增的检测方法，其中仅用肉眼即可判断目标核酸的存在与否。

应理解，在本发明范围内，本申请上述以及下述的各技术特征可以各种方式进行组合，从而构成各种优选例。例如，根序列的长度一般范围的下限20个碱基可以与优选范围的上限50个碱基进行组合，从而构成范围20-50个碱基。

附图说明

图1A-1E显示了本发明一个实例中生物素-亲和素复合物的制备。

图2显示了常规的免疫分析法产生信号的机制。

图3显示了在本发明的免疫分析法中“生物素-亲和素n级复合物”产生信号的机制。

图4A-4E显示了本发明另一实例中生物素-亲和素复合物的制备。

图5显示了本发明生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物富集单链寡核苷酸的过程。

图6显示了“固相载体-目标核酸-生物素-亲和素n级复合物-信号探针”四元复合物的形成过程。

图7显示了本发明一个实例中信号探针使金纳米颗粒溶液颜色改变的过程。

图8A和8B显示了本发明一个实例中的无PCR检测结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，基于生物素/亲和素反应的特性，首次提供了一种新的生物素-亲和素复合物的生产方法。利用该复合物，可进一步显著提高检测灵敏度，通常可提高1000倍至10000倍或更多(理论上，对可检测的反应信号的放大倍数可高达10⁶～10⁷)。通过使用本发明特定的生物素-亲和素复合物，可使核酸检测的灵敏度提高了多个数量级，从而可以较好地满足核酸检测的需求。在此基础上，本发明人完成了本发明。

如本文所用，术语“根序列”指可通过例如共价键固定于固相载体的寡核苷酸单链。此外，该术语还包括用于形成根序列或用作根序列的寡核苷酸单链。

如本文所用，术语“引发序列”指互补结合于所述根序列的、并且在一端标记有生物素的寡核苷酸单链。此外，该术语还包括用于形成引发序列或用作引发序列的寡核苷酸单链。

如本文所用，术语“生长序列”指两端标记有生物素的寡核苷酸单链，所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合，而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态，其中n为1-20的正整数。此外，该术语还包括用作引发序列的寡核苷酸单链。

在本发明的复合物中，以引发序列上的生物素为起点，可一层一层地通过“生物素-亲和素-生长序列”方式连接的大的n级复合物。

生物素和亲和素

应理解，如本文所用，术语“亲和素”包括亲合素(avidin)和链亲和素(streptavidin)。该术语还包括野生型、突变型以及衍生型的亲和素。

生物素(biotin)-亲合素是免疫分析技术中的重要工具，主要是因为其有下述几个特点：

①亲和素对生物素的亲和力极高，为抗原抗体反应的百万倍，具高度特异性和稳定性。

②生物素分子小，结构简单，极易与抗体、核酸、多糖及多种酶等生物大分子以共价键稳定结合，同时对结合物的原始生物活性无不良影响。

③亲和素性质极为稳定，每分子可结合4个生物素衍生物，其作为生物素化分子与信号物之间的桥，起到信号放大作用，从而提高检测的灵敏度。

生物素-亲和素的n级复合物

应理解，如本文所用，术语“生物素-亲和素复合物”包括生物素与亲合素(avidin)和/或链亲和素(streptavidin)所形成的复合物。

为了便于理解本发明，本发明人提供了以下基本原理。然而，应理解，本发明的保护范围并不受限于本发明的基本原理。

参见附图1。将根序列固定于固相载体，在适宜的条件下引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体(图1A)；去除过量的引发序列后，加入亲和素与固相载体上引发序列的生物素稳定结合(图1B)；去除过量的亲和素，加入生长序列，在固相载体上形成“生物素-亲和素1级复合物”，单个复合物的生物素的数量为3¹(图1C)；去除过量的生长序列，加入亲和素，与固相载体上生长序列的生物素稳定结合(图1D)；去除过量的亲和素，加入生长序列，在固相载体上形成“生物素-亲和素2级复合物”，单个复合物的生物素数为3²(图1E)，依此类推，当生成“生物素-亲和素n级复合物”时，单个复合物的生物素数为3ⁿ，此时适当地改变溶液条件，使引发序列脱离根序列，经过分离得到处于稳定的溶液状态下的“生物素-亲和素n级复合物”，这种复合物可用于免疫反应的信号放大，提高检测的灵敏度。

参见图2，图中显示了常规的免疫反应产生信号的机制。捕获抗体经共价键固定于固相载体，和相应的抗原反应后再与标记了生物素的第二抗体反应，夹心后再与连接了酶或荧光染料的亲和素稳定结合，酶催化底物显色或直接检测荧光强度对抗原进行定量，信号强度(灵敏度)取决于经一系列反应后最终结合酶的量或荧光染料的量，图示中第二抗体标记的生物素与最终的酶或荧光染料的量的比例关系为1∶1。

参见图3，图中显示了本发明方法中，免疫反应应用了“生物素-亲和素n级复合物”后产生信号的机制：

形成夹心的步骤与图2完全一致，夹心后经连接有酶或荧光染料的亲和素将“生物素-亲和素n级复合物桥连于第二抗体，这样图示中第二抗体标记的生物素与最终的酶或荧光染料的量的比例关系约为1∶3ⁿ，相应地，灵敏度约为原来的3ⁿ倍。

可用于免疫检测的生物素-亲和素n级复合物的制备

1.1根序列固定于固相载体

合成5’端修饰的一段寡核苷酸序列(如：-NH₂、生物素、-SH修饰等)，使其与完全匹配的互补链形成的杂合体相对稳定(如：Tm在50～70℃之间)；

选择合适的商业化的表面经相应修饰(如：羧基/亲和素化的聚苯乙烯微球、羧基/亲和素化的磁性微球等)的固相载体，按其使用说明或有关文献将跟序列稳定地固定于固相载体；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的跟序列分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

1.2引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体

合成5’端经生物素修饰的一段寡核苷酸，其序列与跟序列完全互补；

在适宜离子强度和温度的缓冲液中，引发序列与固相载体表面的跟序列杂交1小时后形成相对稳定的杂合体；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的引发序列分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

1.3连接亲和素

在含有固相载体的缓冲液中加入游离的亲和素溶液适量，静置30min，固相载体表面引发序列的生物素与亲和素稳定地结合；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的亲和素分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

1.4生物素-亲和素1级复合物的生成

合成3’、5’均经生物素修饰的一段寡核苷酸(生长序列)，碱基数10～20个；

在含有固相载体的缓冲液中加入游离的生长序列溶液适量，生长序列一端的生物素与固相载体表面的亲和素稳定地结合；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的生长序列分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用；

将含有固相载体缓冲液的温度升高到根序列与引发序列杂合体的Tm以上，使引发序列与根序列解离(也可采用改变溶液的离子强度或酸碱度等方法)，脱离固相载体，在保持该温度的条件下进行离心或施加磁场，吸取上清液，得到生物素-亲和素1级复合物。

……

如此反复，得到固相载体表面“长出”的生物素-亲和素n级复合物。可用于核酸检测的生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物

本发明的复合物除了可用于免疫检测，还可用于核酸检测分析。

以生物素和亲和素的n级复合物为例，用于核酸检测分析的复合物的制备过程如下：

参见图4(利用1个亲和素或链亲和素能结果4个生物素的特性)，将根序列固定于固相载体，在适宜的条件下引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体(图4A)；去除过量的引发序列后，加入亲和素与固相载体上引发序列的生物素稳定结合(图4B)；去除过量的亲和素，加入生长序列，在固相载体上形成“生物素-亲和素1级复合物”，单个复合物的生物素数为3¹(图4C)；去除过量的生长序列，加入亲和素，与固相载体上生长序列的生物素稳定结合(图4D)；去除过量的亲和素，加入检测探针，在固相载体上形成“生物素-亲和素2级复合物”，单个复合物的检测探针数约为3²(图4E)；若在图4C与图4D间循环n次，生成“生物素-亲和素n级复合物”时，单个复合物的检测探针数约为3ⁿ。随后，改变溶液条件，使引发序列脱离根序列，经过分离得到处于稳定的溶液状态下的“生物素-亲和素n级复合物”。

可用于核酸检测的生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物的制备

2.1根序列固定于固相载体

合成5’端修饰的一段寡核苷酸序列(如：-NH₂、生物素、-SH修饰等)，使其与完全匹配的互补链形成的杂合体相对稳定(如：Tm在50～70℃之间)；

选择合适的商业化的表面经相应修饰(如：羧基/亲和素或链亲和素化的聚苯乙烯微球、羧基/亲和素或链亲和素化的磁性微球等)的固相载体，按其使用说明或有关文献将跟序列稳定地固定于固相载体；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的跟序列分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

2.2引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体(图4A)

合成5’端经生物素修饰的一段寡核苷酸，其序列与跟序列完全互补；

在适宜离子强度和温度的缓冲液中，引发序列与固相载体表面的跟序列杂交1小时后形成相对稳定的杂合体；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的引发序列分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

2.3连接亲和素或链亲和素(图4B)

以亲和素为例，在含有固相载体的缓冲液中加入游离的亲和素溶液适量，静置30min，固相载体表面引发序列的生物素与亲和素稳定地结合；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的亲和素分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

2.4生物素-亲和素1级复合物的生成(图4C)

合成3’、5’均经生物素修饰的一段寡核苷酸(生长序列)，碱基数10～20个；

在含有固相载体的缓冲液中加入游离的生长序列溶液适量，生长序列一端的生物素与固相载体表面的亲和素稳定地结合，单个复合物上的生物素数为3¹个；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的生长序列分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

2.5亲和素连接于生物素-亲和素1级复合物(图4D)

在含有固相载体的缓冲液中加入游离的亲和素溶液适量，静置30min，固相载体表面生长序列的生物素与亲和素稳定地结合；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的亲和素分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。

2.6含有检测探针的生物素-亲和素2级复合物(图4E)

在含有固相载体的缓冲液中加入检测探针溶液适量，静置30min，与固相载体表面的亲和素稳定地结合，单个复合物上的检测探针数为3²个；

通过离心或施加磁场将固相载体与过量检测探针分离，固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用；

将含有固相载体缓冲液的温度升高到根序列与引发序列杂合体的Tm以上，使引发序列与根序列解离(也可采用改变溶液的离子强度或酸碱度等方法)，脱离固相载体，在保持该温度的条件下进行离心或施加磁场，吸取上清液，得到含检测探针3²个的生物素-亲和素2级复合物。

2.7含3ⁿ个检测探针的生物素-亲和素n级复合物

对图4C、4D的过程循环n次后再进行图4E的操作，可得到含检测探针约3ⁿ个的生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物。

单链、双链寡核苷酸及金纳米颗粒的静电特性

溶液中的金纳米颗粒表面吸附了阴离子(如：柠檬酸根)，金纳米颗粒间的静电排斥作用与范德华力相抗衡，使金纳米颗粒稳定地分散在溶液中而呈现淡红色。

单链寡核苷酸充分暴露其碱基，而双链寡核苷酸的磷酸骨架带有较多的负电荷，因此二者呈现不同的静电特性。

由于双链寡核苷酸带有较强的负电荷，所以不能被金纳米颗粒所吸附；单链寡核苷酸的结构决定了其磷酸骨架相对于碱基更远离带负电荷的金纳米颗粒，以至于其碱基与金纳米颗粒之间的引力足以使单链寡核苷酸吸附在其表面。

一定浓度的盐离子可以屏蔽金纳米颗粒上的阴离子而使其聚集，导致溶液颜色发生改变，当溶液中事先加入单链寡核苷酸，吸附在金纳米颗粒表面后可以抵消后来加入的盐离子对金纳米颗粒表面阴离子的屏蔽作用，所以金纳米颗粒不会聚集，溶液颜色保持不变；互补的2条单链形成双链后不能被吸附到金纳米颗粒表面，无法抵消盐离子对金纳米颗粒表面阴离子的屏蔽作用，导致金纳米颗粒聚集，依溶液中双链的多少，溶液从红色渐变为蓝色。

如果因目标核酸的存在而特异性的富集到上述互补双链中的1条单链，再与另一条单链形成双链，加入到金纳米颗粒溶液中，再加盐离子，金纳米颗粒溶液的颜色就会发生肉眼可见的变化，则报告目标核酸的存在。

若存在目标核酸，则本发明的生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物经过一系列的杂交反应能够富集上述互补双链中的1条单链。

生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物富集单链寡核苷酸的过程

富集过程见图5和图6。在溶液中存在目标核酸的单链分子(或部分呈单链状态)的前提下，固相载体、目标核酸和生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物形成“夹心”(图5)。

随后，加入与检测探针人工设计序列互补的寡核苷酸(信号探针)，使之通过碱基互补原则结合于图5所示的“夹心”物上，形成“固相载体-目标核酸-生物素-亲和素n级复合物-信号探针”四元复合物(图6)；

由于生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物上有3ⁿ个检测探针，因此理论上有3ⁿ个寡核苷酸结合于“夹心”物上，此时适当提高溶液温度即可富集到3ⁿ个寡核苷酸单链(因检测探针与目标核酸互补的序列较长，所以该温度不会使检测探针与目标核酸形成的杂合体解链)，即可用于金纳米颗粒溶液颜色改变的过程。

在本发明的一个优选例中，生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物用于富集信号探针的方法包括以下步骤：

3.1图5所示“夹心物”的生成

3.1.1捕获探针与检测探针设计

检测探针结合目标DNA的序列与捕获探针应有较高的Tm1值(应尽可能接近，最好一致)这样才能保证“夹心物”的稳定性；

检测探针用于富集信号探针的序列Tm2值应相对较低。

3.1.2捕获探针固定于固相载体

核酸探针固定于固相载体有多种方法，是本技术领域技术人员的一般知识，优选将-NH₂修饰的捕获探针通过共价键固定于表面经-COOH修饰的磁性微球上。

3.1.3目标核酸样本的处理

采用市售试剂盒提取目标核酸；

对得到的目标核酸进行超声处理，使其变为较小的片段，便于杂交反应的进行。

3.1.4杂交以形成图5所示的“夹心物”

优选磁微球作为固相载体，检测探针结合目标核酸的序列与捕获探针的Tm1均＞55℃，检测探针结合信号探针的序列的Tm2＜45℃；

将固定有捕获探针的固相载体、目标核酸单链和含3ⁿ个检测探针的生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物在适宜的溶液和温度条件下杂交；

通过洗涤或磁分离等方法得到如图5所示的“夹心物”。

3.2二次杂交以形成图6所示的“夹心物”

向图5所示的夹心物溶液中加入信号探针溶液，在适宜的温度下与生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物上的检测探针杂交；

通过洗涤或磁分离等方法得到图6所示的“夹心物”。

3.3收集信号探针

提高溶液温度至Tm1与Tm2之间，使信号探针与生物素-亲和素(或链亲和素)n级复合物上的检测探针解离，脱离夹心物并收集。

3.4金纳米颗粒溶液的颜色改变

富集到的信号探针与其互补链在适宜的条件下形成双链后，加入到金纳米颗粒溶液中，再加入盐离子溶液，金纳米颗粒溶液由粉红色变为蓝色(图7)。

由于只有在目标DNA存在的前提下才形成图6的“夹心物”，进而才富集到信号探针，导致金纳米颗粒溶液颜色的改变，报告目标核酸的存在与否，达到对目标核酸进行分析的目的。

本发明的主要优点在于：

(a)可以避免核酸分析中使用PCR方法可能造成的交叉污染；

(b)缩短核酸分析的时间；

(c)显著降低核酸分析的成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

生物素-亲和素1级复合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析检测

1、生物素-亲和素1级复合物的制备

1.1根序列固定于羧基修饰的磁颗粒

1.1.1原料

根序列：5’NH₂-(T₁₅)GACCAATGCATGGTCCAGAC3’(SEQ ID NO：1)；

粒径为1μm表面羧基化的磁微球；

EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；

MES(吗啉乙磺酸)

1.1.2操作步骤

01.将根序列寡核苷酸用双蒸水溶解，浓度为0.01mM；

02.用振荡器将磁微球混合均匀；

03.取50μl(约6.0x10⁶磁微球)，放入洁净的Ep管中；

04.施加磁场沉淀磁微球，小心弃取上清液；

05.取消磁场，加入100μl双蒸水，充分振荡悬浮磁微球，施加磁场沉淀磁微球；

06.弃去上清液，取消磁场，用50μl 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮磁微球，并用振荡器混匀；

07.取10μl根序列溶液加到上步骤中的磁微球悬液中，用振荡器混匀；

08.按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；

09.取2.5μl上步骤的EDC溶液加入磁微球悬液中，用振荡器混匀；

10.避光，37℃静置30分钟；

11.施加磁场沉淀磁微球；

12.弃去上清液，取消磁场，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮磁微球，并用振荡器混匀；

13.施加磁场沉淀磁微球；

14.弃去上清液，取消磁场，用100μl TE(pH 8.0)重新悬浮磁微球，并用振荡器混匀；

15.将固定了根序列的磁微球避光保存在2-10℃环境中。

1.2引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体

1.2.1原料

引发序列：3’CTGGTTACGTACCAGGTCTG(T₁₀)-生物素5’(或表示为5’-生物素-tttttttttt gtctggaccatgcattggtc-3’，SEQ ID NO：2)；

固定了根序列的磁微球混悬液。

1.2.2操作步骤

01.将引发序列用TE(pH 8.0)溶解，浓度为0.01mM；

02.用振荡器将磁微球混悬液混合均匀；

03.取10μl引发序列溶液加入50μl磁微球混悬液中，混匀后室温放置30min；

04.施加磁场，弃去上清液；

05.取消磁场，加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球；

06.施加磁场，弃去上清液，反复几次得到如图1A复合物的TE混悬液100μl。

1.3连接亲和素

1.3.1原料

市售亲和素；

步骤1.2中制备复合物(图1A)的TE混悬液。

1.3.2操作步骤

01.取10μl市售亲和素溶液加入图1A复合物的100μl TE混悬液中，混合均匀，室温静置30min；

02.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

03.取消磁场，加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球；

04.施加磁场，弃去上清液，反复几次得到如图1B复合物的TE混悬液100μl。

1.4生物素-亲和素1级复合物的生成

1.4.1原料

生长序列：3’生物素-TTTTTTTTTTTTTTT-生物素5’(SEQ ID NO：3)；

图1B复合物的TE混悬液。

1.4.2操作步骤

01.将生长序列用TE缓冲液配制成终浓度为10μM；

02.取10μl生长序列溶液加入图1B复合物的TE混悬液100μl中，混合均匀，室温静置30min；

03.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

04.取消磁场，加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球；

05.施加磁场，弃去上清液，反复几次得到如图1C复合物的TE混悬液100μl；

06.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

07.取消磁场，加入100μl纯水，混合均匀，提高温度至50℃，静置5min；

08.施加磁场，沉淀磁微球，吸取上清液，得到生物素-亲和素1级复合物，2-8℃保存备用。

2、生物素-亲和素1级复合物用于免疫分析法的信号放大

此处以Luminex流式荧光法检测甲胎蛋白抗原为例说明本专利放大检测信号提高灵敏度的有效性。

根据基本原理的阐述，生物素-亲和素1级复合物用于免疫分析，对信号的放大倍数理论上应是常规信号检测方法的3倍，为此用2种方法分别平行检测同样浓度的甲胎蛋白抗原5次，求各自的平均数，观察2个平均数的比值是否接近于3。

2.1常规方法检测甲胎蛋白抗原

2.1.1原料

市售“甲胎蛋白定量检测试剂盒(流式荧光免疫法)”。

2.1.2操作

01.将试剂盒中16ng/ml的校准品复溶；

02.分别吸取5次，每次20μl，置于5个EP管中；

03.按试剂盒使用说明书操作，获取这5个平行样的荧光信号，结果见下表：

表1：16ng/ml的校准品的荧光信号值

2.2生物素-亲和素1级复合物配合常规方法检测甲胎蛋白抗原

2.2.1原料

使用上述同一试剂盒；

生物素-亲和素1级复合物纯水溶液。

2.2.2操作

01.分别吸取上述复溶的同一校准品溶液5次，每次20μl，置于5个EP管中；

02.按试剂盒使用说明书操作至反应结束，不要上机检测荧光信号；

03.将5个EP管离心，弃去上清液；

04.用试剂盒提供的反应缓冲液配合离心操作洗涤复合物2次后，加入反应缓冲液100μl，振荡，使复合物悬浮；

05.复合物悬浮液中加入10μl生物素-亲和素1级复合物溶液，混合均匀，37℃静置30min；

06.重复“03，04”的操作；

07.加入标记了藻红蛋白(PE)的链亲和素，混合均匀，37℃静置30min，得到复合物；

08.上机检测荧光信号，结果见下表：

表2：生物素-亲和素1级复合物配合常规方法检测16ng/ml的校准品的荧光信号值

2种方法荧光信号的比值约为3.82，这提示：对于1个反应单元，常规方法下只有1个荧光染料分子报告信号，而使用了生物素-亲和素1级复合物后，加原来的1个共有4个荧光染料分子报告信号，所以比值应接近4，因此本专利方法能够有效放大免疫分析方法的信号，提高检测灵敏度。

实施例2：生物素-亲和素8级复合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析检测

1、生物素-亲和素8级复合物的制备

参照实施例1中生物素-亲和素1级复合物的制备方法和附图1A-1E，增加循环反应的次数得到生物素-亲和素8级复合物溶液。

2、生物素-亲和素8级复合物用于免疫分析法的信号放大

仍以Luminex流式荧光法检测甲胎蛋白抗原为例说明本专利放大检测信号提高灵敏度的有效性，本实施例仍以实施例1中16ng/ml的校准品为样品。

根据基本原理的阐述，生物素-亲和素8级复合物用于免疫分析，对信号的放大倍数理论上应是常规信号检测方法的3⁸倍，即：6561倍。

为此用常规方法平行检测16ng/ml的甲胎蛋白校准品5次，求荧光信号的平均数；将16ng/ml的甲胎蛋白校准品用试剂盒提供的反应缓冲液稀释1000倍后(即：16pg/ml)，再用生物素-亲和素8级复合物配合常规方法，平行检测16pg/ml的甲胎蛋白校准品5次，求荧光信号的平均数。

原料、操作步骤与实施例1中的相应部分完全一致，结果见表3、4。

表3：常规方法检测16ng/ml的校准品的荧光信号值

表4：生物素-亲和素8级复合物配合常规方法检测16pg/ml的校准品的荧光信号值

2种方法荧光信号平均值的比值约为：2.4，因后者测的样本的浓度为前者的1/1000，所以将2.4×1000＝2400，虽与理论值有较大的差距，但还是大幅提高的检测的灵敏度。

实施例3：生物素-亲和素8级复合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析检测

重复实施例1和2，不同点在于，制备生物素-亲和素2级复合物、生物素-亲和素3级复合物、生物素-亲和素4级复合物、生物素-亲和素5级复合物、生物素-亲和素6级复合物、和生物素-亲和素7级复合物。并测试各级复合物的检测灵敏度。

结果如表5所示。

表5各级复合物的检测灵敏度

 复合物的级数(n)  与对照相比的相对灵敏度倍数  (复合物/对照的比值) 0(对照)  1 1  3.82 2  14 3  40 4  110 5  275 6  630 7  1320

 复合物的级数(n)  与对照相比的相对灵敏度倍数  (复合物/对照的比值) 8  2425

上述结果表明，本发明的2级复合物可以提高灵敏度约15倍，而4级复合物可以提高灵敏度约100倍，而6级复合物可以提高灵敏度约1000倍。随着n级数的增加，虽与理论值有较大的差距，但仍可大幅提高的检测的灵敏度。

实施例4-5：不同序列长度的根序列

重复实施例1和2，制备n＝4的4级复合物。不同点在于：用5’NH₂-(T₁₃)GACCAATGCATGGTCCAGA3’(SEQ ID NO：4)或5’NH₂-(T₂₀)GACCAATGCATGGTCCAGAC3’(SEQ ID NO：5)分别替换SEQ ID NO：1所示的根序列。

测试结果表明，实施例4和5的二种4级复合物可以提高灵敏度约100倍和105倍。

实施例6-7：不同序列长度的引发序列

重复实施例1和2，制备n＝3的3级复合物。不同点在于：用5’-生物素-ttttttttt gtctggaccatgcattggt-3’(SEQ ID NO：6)或5’-生物素-tttttttttttttt gtctggaccatgcattggtc-3’(SEQ ID NO：7)分别替换SEQ IDNO：2所示的引发序列。

测试结果表明，实施例6和7的二种3级复合物可以提高灵敏度约38倍和42倍。

实施例8：不同序列长度的生长序列

重复实施例1和2，制备n＝4的4级复合物。不同点在于用tttttttttttt(SEQID NO：8)替换SEQ ID NO：3所示的生长序列。

测试结果表明，所制备的4级复合物可以提高灵敏度约100倍。

实施例9

携带检测探针的生物素-链亲和素15级复合物用于高危人乳头瘤病毒(HPV)16亚型DNA的分析

1、生物素-链亲和素15级复合物的制备

1.1根序列固定于羧基修饰的磁颗粒

1.1.1原料

根序列：5’NH₂-(T₁₅)GACCAATGCATGGTCCAGAC3’(SEQ ID NO：1)；

粒径为1μm表面羧基化的磁颗粒；

EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺)；

MES(吗啉乙磺酸)

1.1.2操作步骤

01.将根序列寡核苷酸用双蒸水溶解，浓度为0.01mM；

02.用振荡器将磁微球混合均匀；

03.取50μl(约6.0x10⁶磁微球)，放入洁净的Ep管中；

04.施加磁场沉淀磁微球，小心弃取上清液；

05.取消磁场，加入100μl双蒸水，充分振荡悬浮磁微球，施加磁场沉淀磁微球；

06.弃去上清液，取消磁场，用50μl 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮磁微球，并用振荡器混匀；

07.取10μl根序列溶液加到上步骤中的磁微球悬液中，用振荡器混匀；

08.按10mg/mL新鲜配制EDC溶液；

09.取2.5μl上步骤的EDC溶液加入磁微球悬液中，用振荡器混匀；

10.避光，37℃静置30分钟；

11.施加磁场沉淀磁微球；

12.弃去上清液，取消磁场，用1.0mL 0.1％SDS重新悬浮磁微球，并用振荡器混匀；

13.施加磁场沉淀磁微球；

14.弃去上清液，取消磁场，用100μl TE(pH 8.0)重新悬浮磁微球，并用振荡器混匀；

15.将固定了根序列的磁微球避光保存在2-10℃环境中。

1.2引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体

1.2.1原料

引发序列：3’CTGGTTACGTACCAGGTCTG(T₁₀)-生物素5’(或表示为5’-生物素-tttttttttt gtctggaccatgcattggtc-3’，SEQ ID NO：2)；

固定了根序列的磁微球混悬液。

1.2.2操作步骤

01.将引发序列用TE(pH 8.0)溶解，浓度为0.01mM；

02.用振荡器将磁微球混悬液混合均匀；

03.取10μl引发序列溶液加入50μl磁微球混悬液中，混匀后室温放置30min；

04.施加磁场，弃去上清液；

05.取消磁场，加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球；

06.施加磁场，弃去上清液，反复几次得到如图4A复合物的TE混悬液100μl。

1.3连接链亲和素

1.3.1原料

市售链亲和素；

图4A复合物的TE混悬液。

1.3.2操作步骤

01.取10μl市售链亲和素溶液加入图4A复合物的100μl TE混悬液中，混合均匀，室温静置30min；

02.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

03.取消磁场，加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球；

04.施加磁场，弃去上清液，反复几次得到如图4B复合物的TE混悬液100μl。

1.4生物素-链亲和素1级复合物的生成

1.4.1原料

生长序列：3’生物素-TTTTTTTTTTTTTTT-生物素5’寡核苷酸(SEQ ID NO：3)；

图4B复合物的TE混悬液。

1.4.2操作步骤

01.将生长序列用TE缓冲液配制成终浓度为10μM；

02.取10μl生长序列溶液加入图4B复合物的TE混悬液100μl中，混合均匀，室温静置30min；

03.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

04.取消磁场，加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球；

05.施加磁场，弃去上清液，反复几次得到如图4C复合物的TE混悬液100μl；

重复“1.3与1.4”的各项操作直至固相载体上“长出”生物素-链亲和素14级复合物。

1.5连接链亲和素

重复“1.3与1.4”的各项操作

1.6获得生物素-链亲和素15级复合物

1.6.1原料

检测探针：

3’ccagcacctaaagaagatgatcccTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-生物素5’(SEQ ID NO：9)

其中，下划线区域为与HPV16DNA互补的序列；双下划线区域为与信号探针互补的人工序列。

生物素-链亲和素14级复合物的TE混悬液。

1.6.2操作步骤

01.将检测探针用TE缓冲液配制成终浓度为10μM；

02.取10μl检测探针溶液加入生物素-链亲和素14级复合物的TE混悬液100μl中，混合均匀，室温静置30min；

03.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

04.取消磁场，加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球；

05.施加磁场，弃去上清液，反复几次得到生物素-链亲和素15级复合物的TE混悬液100μl；

06.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

07.取消磁场，加入100μl纯水，混合均匀，提高温度至50℃，静置5min，使引发序列与根序列解离；

08.施加磁场，沉淀磁微球，吸取上清液，得到生物素-链亲和素15级复合物，2-8℃保存备用。

2、捕获探针固定于磁颗粒

2.1捕获探针

3’acagggccacaataatggcatttgTTTTTTTTTTTTTTT-生物素5’(SEQ ID NO：10，其中下划线区域为与HPV16DNA互补的序列)

用去离子水配制成10μM的溶液100μl备用。

2.2表面经链亲和素修饰的磁性微球

选取粒径为200nm的表面经链亲和素修饰的磁性微球。

2.3捕获探针固定

捕获探针10μl和1磁性微球10μl加入pH7.4的磷酸盐缓冲液中，经生物素与链亲和素的特异性反应将捕获探针稳定地固定于磁微球表面；

经pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，将磁微球混悬液贮存于2～8℃备用。

3、“夹心物”的形成

3.1“夹心物”的生成

01.将固定有捕获探针的磁微球、经变性的HPV16DNA、生物素-链亲和素15级复合物各5μl加入35μl的杂交液中，混合均匀后保持溶液温度在63℃2小时；

02.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

03.取消磁场，加入杂交液100μl洗涤，弃上清，重复洗涤2次，最后加入45μl杂交液；

04.加入5μl信号探针，混合均匀后保持溶液温度在45℃1小时；

05.施加磁场，沉淀磁微球，弃去上清液；

06.取消磁场，加入杂交液100μl洗涤，弃上清，重复洗涤2次，最后加入25μl杂交液，形成“夹心物”混悬液。

4、信号探针的富集

使混悬液的温度升高至55℃，结合在“夹心物”上的信号探针解离，施加磁场，吸取上清备用。

5、金纳米颗粒溶液颜色的改变

5.1含与信号探针互补的单链的金纳米颗粒溶液的配制

取30μl金纳米颗粒溶液，加入5μl信号探针的互补单链，使其在35μl中的摩尔数为2.5pmol，再加入盐离子溶液15μl(10mM PBS和0.2M NaCl)，溶液颜色呈粉红色(图8A)。

5.2信号探针与其互补探针形成双链

取上一步“4”得到的信号探针溶液10μl加入“5.1”的溶液中，颜色变为淡紫色或浅蓝色(图8B)，这提示HPV DNA的存在。

上述结果说明，因目标核酸的存在，生物素-链亲和素n级复合物可以富集到大量的单链寡核苷酸，用于金纳米颗粒溶液颜色的改变，可方便地通过目测进行目标核酸分析。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海透景生命科技有限公司

<120>一种免PCR扩增无需检测仪器的核酸分析方法

<130>088286

<160>10

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>根序列

<400>1

tttttttttt tttttgacca atgcatggtc cagac    35

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引发序列

<400>2

tttttttttt gtctggacca tgcattggtc          30

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>生长序列

<400>3

tttttttttt ttttt                             15

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>根序列

<400>4

tttttttttt tttgaccaat gcatggtcca ga          32

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>根序列

<400>5

tttttttttt tttttttttt gaccaatgca tggtccagac   40

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引发序列

<400>6

tttttttttg tctggaccat gcattggt                28

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引发序列

<400>7

tttttttttt ttttgtctgg accatgcatt ggtc                               34

<210>8

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>生长序列

<400>8

tttttttttt tt                                                       12

<210>9

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>检测探针

<400>9

ccagcaccta aagaagatga tccctttttt ttttcattga aacgttcgtt ttttttttt    59

<210>10

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>捕获探针

<400>10

acagggccac aataatggca tttgtttttt ttttttttt                          39