法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-04-06
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N9/00 授权公告日:20120523 终止日期:20150220 申请日:20100220
专利权的终止
2012-05-23
授权
授权
2010-09-08
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/90 申请日:20100220
实质审查的生效
2010-07-07
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种具有高产D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶及其突变方法,以及利用该突变体酶生产D-塔格糖的技术,属于生物工程、基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖属于天然稀有糖的一种,在许多食品中都发现少量存在,如高温灭菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美国食品与药物管理局(FDA)确定D-塔格糖为普遍公认安全食品(GRAS),并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中;随后联合国粮农组织和世界卫生组织的联合食品添加剂委员会第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂;欧盟也于2003年批准D-塔格糖在欧洲上市。
目前,国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段,国外对其研究已较为深入,方法主要有两种:化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化学法生产的。由于一方面化学法生产存在许多不利因素,如化学污染物多,碱性条件下异构化反应副产物多,分离困难等;另一方面由于消费者消费观念的转变,天然食品的需求日益增长,因此近年来对D-塔格糖生产的研究集中在生物法上。
研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4,缩写为L-AI)可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖,是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。但是L-AI是一种非专一性酶,它可以分别催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖为L-核酮糖和D-塔格糖。研究表明L-AI催化L-阿拉伯糖的效率明显高于D-半乳糖。本发明所使用的来源于(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-AI酶是一种高耐热性酶,具有工业应用前景。因此,进一步提高该酶催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖的能力将赋予其更好的应用潜能。
发明内容
本发明的一个目的是:提供提高来源于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolytics)ATCC 43068的L-AI酶产D-塔格糖能力的方案。
本发明的另一个目的是:提出具有更高生产D-塔格糖能力的单突变体酶L20A,及其构建方法。
同时本发明还提供了一种利用该单突变体酶L20A生产D-塔格糖的方法。
本发明的技术方案:一种L-可拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A,将来源于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖异构酶L-AI酶(其基因序列详见Appl Microbiol Biotechnol DOI10.1007/s00253-009-2322-z),进行突变所得的单突变体酶L20A;其为L-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突变成了丙氨酸Ala,命名为L20A;它相比于野生型L-AI酶具有更高的产D-塔格糖的能力。
所述的L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A的制备方法,根据ATCC43068的L-AI酶基因序列,设计突变引物,对L-AI酶进行定点突变,测定DNA序列,鉴定出第20位Leu密码子突变成Ala密码子,并将其表达于大肠杆菌中,经诱导即得L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A;步骤为:
(1)定点突变
利用重叠延伸PCR技术,以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版,经PCR1,PCR2及PCR3,引入L20A突变点,定点突变的引物为:
上游外侧引物:5’-TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3’,
下游外侧引物:5’-TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3’,
正向突变引物:5’-CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3’,下划线为突变碱基,
反向突变引物:5’-CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3’,下划线为突变碱基,
PCR1反应体系为:10×PCR buffer 5μL,2mM dNTP 4μL,10μM上游外侧引物1μL,10μM反向突变引物1μL,模版DNA 1μL,5U/mL taq plus 0.5μL,加入双蒸水至50μL。
PCR2反应体系为:10×PCR buffer 5μL,2mM dNTP 4μL,10μM下游外侧引物1μL,10μM正向突变引物1μL,模版DNA 1μL,5U/mL taq plus 0.5μL,加入双蒸水至50μL。
PCR1、PCR2扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min的35个循环;最后72℃保温10min;
PCR1、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测,割胶回收纯化;
PCR3反应体系为:10×PCR buffer 10μL,2mM dNTP 8μL,10μM上游外侧引物1μL,10μL下游外侧引物1μL,PCR1纯化产物10μL,PCR2纯化产物10μL,5U/mL taq plus 1μL,加入双蒸水至100μL;
PCR3扩增条件为:94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸5min;随后进行94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min的35个循环;最后72℃保温10min。
(2)突变体载体质粒的构建
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶NdeI和HindIII消化后连接至载体pET-22b(+),并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,在含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后,挑单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养,后提取突变质粒,将突变质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,突变质粒经测序鉴定为正确的突变;
(3)突变体的表达
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,按2%接种量接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中;37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8时,加入0.4mM终浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并在30℃继续振荡培养12h后,将发酵液于4℃、1000rpm离心10min收集菌体;
(4)单突变体酶的纯化
将步骤(3)收集的突变体菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中,经超声波破碎后,于4℃、1000rpm离心20min去除细胞碎片,收集上清,经强阴离子交换柱Q-Sepharose进行初步纯化,随后收集活性部分再经分子筛Sephodex S200纯化,得到单突变体酶L20A的纯酶制品。
本发明的有益效果:本发明构建了一个有工业经济价值的单突变体酶L20A,实现了L-AI酶活力的提高,比野生型L-AI酶更有利于D-塔格糖的工业化生产。
附图说明
图1野生型L-AI酶和单突变体酶L20A的D-塔格糖转化图。▲表示野生型L-AI酶;■表示单突变体酶L20A。
具体实施方式
实施例1:本例说明单突变体酶L20A的制备。
(1)定点突变
利用重叠延伸PCR技术,以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版,经PCR1,PCR2及PCR3,引入L20A突变点,定点突变的引物为:
上游外侧引物:5’-TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3’,
下游外侧引物:5’-TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3’,
正向突变引物:5’-CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3’(下划线为突变碱基)
反向突变引物:5’-CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3’(下划线为突变碱基)
PCR1反应体系为:10×PCR buffer 5μL,2mM dNTP 4μL,10μM上游外侧引物1μL,10μM反向突变引物1μL,模版DNA 1μL,5U/mL taq plus 0.5μL,加入双蒸水至50μL。
PCR2反应体系为:10×PCR buffer 5μL,2mM dNTP 4μL,10μM下游外侧引物1μL,10μM正向突变引物1μL,模版DNA 1μL,5U/mL taq plus 0.5μL,加入双蒸水至50μL。
PCR1、PCR2扩增条件为:94℃预变性4min;随后进行94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min的35个循环;最后72℃保温10min。
PCR1、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测,并通过胶回收纯化。
PCR3反应体系为:10×PCR buffer 10μL,2mM dNTP 8μL,10μM上游外侧引物1μL,10μL下游外侧引物1μL,PCR1纯化产物10μL,PCR2纯化产物10μL,5U/mL taq plus 1μL,加入双蒸水至100μL。
PCR3扩增条件为:94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸5min;随后进行94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min的35个循环;最后72℃保温10min。
(2)突变体载体质粒的构建
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶NdeI和HindIII消化后连接至载体pET-22b(+),并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,在含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后,挑单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养,后提取突变质粒,将突变质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,突变质粒经测序鉴定为正确的突变。
(3)突变体的表达
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,按2%接种量接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中;37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8时,加入0.4mM终浓度的IPTG进行诱导表达,并在30℃继续振荡培养12小时后,将发酵液于4℃、1000rpm离心10min收集菌体。
(4)突变体酶的纯化
将表达的突变体菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中,经超声波破碎后,于4℃、1000rpm离心20min去除细胞碎片,收集上清,经强阴离子交换柱Q-Sepharose进行初步纯化,随后收集并浓缩活性部分再经分子筛Sephodex S200纯化,得到单突变体酶L20A的纯酶制品,经SDS-PAGE检测为单一条带。
实施例2:本例说明酶活分析。
1)酶活的测定方法:半胱氨酸-咔唑法测定L-AI的活力:取适当稀释的酶液20μL,加入装有980μL预先用50mM Tris-HCL(pH6.0)配置的50mM D-半乳糖溶液中,在75℃水浴中反应10min后,于冰上终止反应。取适当稀释的反应液50μL,加入950μL去离子水,加入200μL 1.5%的盐酸-半胱氨酸溶液,再加入6mL 75%的硫酸,混匀,然后加入200μL 0.12%的咔唑酒精溶液,立即混匀并于60℃水浴保温10min后冰浴终止反应,在560nm处测定吸光度。一个酶活单位的定义为在该条件下每分钟生成1μmol D-塔格糖所需的酶量。
2)酶活的比较:将突变体酶L20A的纯酶制品与野生型L-AI纯酶制品相比,可以发现:突变体酶L20A的产D-塔格糖的能力明显上升,其酶活为野生型的2.2倍;而其产L-核酮糖的能力,与野生型相比基本保持不变,说明该突变体酶L20A对催化生产D-塔格糖的底物专一性有明显改善作用。
实施例3:利用突变体酶L20A转化生产D-塔格糖。
在两份50mM Tris-HCl配置的终浓度为50mM的D-半乳糖溶液中,每份中分别加入一定量的野生型L-AI酶或突变体酶L20A,使反应体系中酶活为0.1U/mL,75℃水浴条件下进行转化反应,分别在1、2、4、6、8、10、12、24小时取样,煮沸10min灭酶,1000rpm离心10min,取上清后利用高效液相色谱(HPLC)测定生成的D-塔格糖含量。
HPLC进行产物分析的色谱条件为:Agilent 1200 HPLC色谱仪,色谱柱Shodex NH2P-504E,Shodex RI-101示差折光检测器,流动相为65%(V/V)乙腈水溶液,柱温35℃,流速1mL/min。
结果列于图1,突变体酶L20A与野生型L-AI相比,其催化速度显著提高,转化率提高了8%。突变体酶L20A反应1h,其转化率达50%;反应4h,转化率即达到最高61%;而野生型L-AI酶反应1h,其转化率只有20%;10h以后反应才达到平衡,最高转化率为53%。
机译: 具有增强的d-塔格糖转化活性的己糖醛酸c4-表异构酶突变体以及使用该突变体生产d-塔格糖的方法
机译: 具有增强的d-塔格糖转化活性的己糖醛酸c4-表异构酶突变体以及使用该突变体生产d-塔格糖的方法
机译: 具有增强的d-塔格糖转化活性的己糖醛酸c4-表异构酶突变体以及使用该突变体生产d-塔格糖的方法