利用β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶由乳糖生产D-塔格糖

摘要

作为一种新型低热量功能性甜味剂，D-塔格糖具有许多重要的生理功能，降血糖、改善肠道菌群、抗龋齿、促进血液健康、增强细胞对毒素的敏感性等。它的甜度是蔗糖的92％，能量远低于传统的甜味剂，具有良好的应用前景，能够应用在食品、饮料、肉制品、糖类等众多工业中。通过生物法生产D-塔格糖，L-阿拉伯糖异构酶(LAI)是目前最有效的酶，以D-半乳糖为底物。D-半乳糖可以通过β-半乳糖糖苷酶水解廉价乳糖来生产同时产生等摩尔的D-葡萄糖。在本课题研究中，联合β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶以廉价的乳糖为底物来转化生产D-塔格糖。
　　本研究首先比较用来固定β-半乳糖苷酶的氨基化硅胶不同制作方法，得到了最佳的氨基化硅胶制作工艺。对β-半乳糖苷酶的固定方法进行了优化:2％戊二醛交联3h，固定pH6.0，温度30℃过夜，固定载体(g)与酶(U)的比例为1∶1000(g∶U)。酶在最佳条件下固定化，酶活回收率达到60％。固定酶的最适反应条件:温度55℃，pH5.0。在此最佳条件下，固定酶的酶活性达到了560±10U/g。固定化酶经10个批次反应，酶活性仅略有下降，表现出良好的重复利用性，适合应用于工业化生产。水解反应2h后，乳糖水解率达到95％以上，为后续生产D-塔格糖提供了原料。
　　对Lactobacillus.fermentum CGMCC2921中的L-阿拉伯糖异构酶基因（araA）(GenBank∶HM150718.1)进行了合成、克隆，构建了重组质粒pET-22b-araA并将其成功转化到了大肠杆菌Escherichia coli BL21-GroEL-GroES(DE3)中。用1mM IPTG、25℃诱导重组菌Ecoli BL21(DE3)(pET-22b-araA)。超声破碎菌液以获得游离酶，游离酶的最佳反应条件为:温度60℃，pH8.0。酶的耐热性良好，并且pH7.0-9.0的碱性条件下耐碱性好。1mM的Mn2+对游离酶活性有显著影响。
　　氨基树脂SQ-100EA对L-阿拉伯糖异构酶粗酶液的固定化效果最好。优化酶的固定条件:1.0％戊二醛固定3h，固定温度25℃，固定pH7，载体与粗酶液的比例为1∶130(g∶U)。通过实验发现，在固定期间添加1mM的Mn2+不仅增加了固定化酶的酶活性，而且大大增加了固定化酶的耐热性。固定化酶的最适反应条件为:60℃，pH7.5。在最佳条件下，固定化酶的酶活性达到49±2U/g，酶活回收率接近40％。另外，固定酶的热稳定性和pH稳定性显著提高。固定酶以D-半乳糖为底物的转化实验中，2hD-塔格糖的转化率达到12％，48hD-塔格糖的转化率达到23％。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 功能性甜昧剂简介

1．2．2 D-塔格糖的生理功能

1．2．3 D-塔格糖的应用

1．3 β-半乳糖苷酶的简介

1．4 L-阿拉伯糖异构酶

1．4．2 L-阿拉伯糖异构酶的来源

1．5 大肠杆菌表达系统

1．6 酶的固定化技术

1．6．1 酶固定化技术概述

1．6．2 酶的固定化方法

1．7 选题依据及研究内容

第二章 β-半乳糖苷酶的固定化

2．1 前言

2．2 实验材料、试剂和仪器

2．2．1 主要实验材料

2．2．2 主要实验试剂

2．2．3 主要实验仪器

2．3 实验方法

2．3．3 β-半乳糖苷酶的固定化方法

2．3．4 固定化的β-半乳糖苷酶酶学性质研究

2．3．6 固定的β-半乳糖苷酶水解乳糖实验

2．4 实验结果与讨论

2．4．2 β-半乳糖苷酶的固定化

2．4．3 固定化酶酶学性质及稳定性

2．4．4 固定化酶的重复利用稳定性

2．4．5 固定化奠的水解乳糖实验

2．5 本章小结

第三章 重组大肠杆菌构建及L-阿拉伯糖异构酶(LAI)可溶性表衣

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 基因、菌株和载体

3．2．2 酶、试剂盒和药品

3．2．3 主要实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21-GroEL-GroES(DE3)(pET22b-araA)的构建

3．3．2 反应液中D-塔格糖的测定方法

3．3．3 L-阿拉伯糖异构酶的诱导表达优化方法

3．3．4 L-阿拉伯糖异构酶酶学性质的研究方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 大肠杆菌重组菌Escherichia coli BL21-GroEL-GroES(DE3)(pET22b-araA)的构建

3．4．2 反应液中D-塔格糖的测定

3．4．3 大肠杆菌重组酶LAI的诱导表达优化

3．4．4 重组酶L-阿拉伯糖异构酶的酶学性质

3．5 本章小结

第四章 L-阿拉伯糖异构酶(LAI)固定化及转化生产D-塔格糖

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 主要实验材料

4．2．2 主要实验试剂

4．2．3 培养基和试剂配制

4．2．4 主要实验仪器

4．3 实验方法

4．3．2 固定化L-阿拉伯糖异构酶酶活测定方法

4．3．3 L-阿拉伯糖异构酶固定化条件优化方法

4．3．4 固定化重组酶LAJ的酶学性质研究方法

4．3．5 固定化L-阿拉伯糖异构酶转化生产D-塔格糖

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 L-阿拉伯糖异构酶固定化载体的选择

4．4．2 重组酶LAI的固定化条件优化

4．4．3 固定化LAI的酶学性质及稳定性

4．4．4 利用固定化L-阿拉伯糖异构酶转化生产D-塔格糖

4．5 本章小结

5．1 全文总结

5．2 创新点

5．3 本文的不足之处与展望

参考文献

致谢