传统发酵豆酱中细菌的检测方法

摘要

传统发酵豆酱中细菌的检测方法，它涉及一种豆酱中细菌的检测方法。它解决了目前的PCR－DGGE技术无法准确的检测传统发酵豆酱中细菌的问题。检测方法：一、传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA提取；二、PCR扩增细菌16S rDNA的V3区；三、细菌PCR－DGGE。本发明方法在彻底清除传统发酵豆酱中微生物细胞之外其它成分的同时，尽可能的避免了微生物种类和数量的流失，而且整个检测过程中不改变DNA的含量，减小了最终分析偏差，保证了检测结果的准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种豆酱中细菌的检测方法。

背景技术

传统发酵豆酱中细菌的数量众多、种类丰富，这些细菌是豆酱传统发酵的关键，直接影响豆酱的发酵速度和产品风味，甚至决定了发酵的成败。以往对传统发酵豆酱中细菌的检测多以形态鉴定结果为主，而豆酱中不可培养的微生物以及数量极少的微生物则往往无法被检测出来，导致检测结果不准确。

随着分子生物学的发展，采用PCR-DGGE技术已能够将环境样品中不可培养的微生物以及数量极少的微生物检测出来。但是传统发酵豆酱组成复杂，除微生物细胞外还含有大量的有机物质(脂类、蛋白质和糖类)和无机盐，造成PCR-DGGE检测传统发酵豆酱过程中微生物DNA抽提困难、杂质去除困难；如结合现有的总基因组DNA直接提取法，则残存的杂质会严重地抑制PCR扩增，致使DNA后续分析错误；如结合现有的总基因组DNA间接提取法，则容易造成微生物种类和数量的丢失。所以，目前的PCR-DGGE技术仍无法准确的检测传统发酵豆酱中的细菌。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前的PCR-DGGE技术无法准确的检测传统发酵豆酱中细菌的问题，而提供的一种传统发酵豆酱中细菌的检测方法。

传统发酵豆酱中细菌的检测方法按以下步骤进行：一、传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA提取：

a、传统发酵豆酱样品预处理：用50mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮10g传统发酵豆酱样品，然后加入玻璃珠用振荡器振荡5min，再在200r/min的条件下离心5min，收集上清液，离心沉淀则用pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮、离心并重复3次，其中每次离心转速为200r/min、离心时间为5min，之后汇集离心上清液以9000r/min的转速离心12min，收集离心沉淀，将离心沉淀用50mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮后在9000r/min的条件下离心12min并重复3次，再将离心沉淀用8mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮，并用移液器吹打后置于振荡器上振荡2～3min，即得到传统发酵豆酱样品预处理液；

b、抽提传统发酵豆酱样品细菌总基因组：

(1)取1mL传统发酵豆酱样品预处理液在12000r/min条件下离心1min，弃去上清液；

(2)向b(1)离心沉淀加中加入180μL的裂解缓冲液和20μL蛋白酶K，振荡悬浮；

(3)将b(2)获得的悬浮液在55℃条件下孵育15min后加入20μL的RNase A室温孵育2分钟，然后加入10μL、浓度为10％(体积)的十二烷基硫酸，并立即涡旋5s，再加200μL的结合缓冲液立即涡旋5s，之后在70℃条件下孵育10min，得到细胞裂解液；

(4)将200μL无水乙醇加入b(3)获得的细胞裂解液中涡旋混合5s，然后将全部涡旋混合液加入离心吸附柱中以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液，再加入500μL清洗缓冲液，以12000r/min转速离心30s，并弃去流出液，再加入500μL清洗缓冲液，以12000r/min转速离心30s，并弃去流出液，之后加入500μL洗涤缓冲液，以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液后，再加入500μL洗涤缓冲液，以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液后再以12000r/min的转速离心2min，去除流出液；

(5)将离心吸附柱转入一个新离心管中并在离心吸附柱中央加入200μL溴化乙锭，然后置于室温环境中静置1min，再以12000r/min的转速离心2min，再用洗脱缓冲液进行洗脱DNA，收集洗脱液，即得到传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA；

二、PCR扩增细菌16S rDNA的V3区：

PCR扩增引物为F338GC和R518，引物F338GC的序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，引物R518的序列为5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

PCR扩增反应体系为50μL，由5.0μL 10×Taq Buffer、4.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture、5.0μL浓度为1pmol/L的引物F338GC、5.0μL浓度为1pmol/L的引物R518、5.0μL浓度为25mmol/L的MgCl₂、1.0μL浓度为5U/μL的Taq、5.0μL的Template和余量的双蒸水组成；

PCR扩增反应程序：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃1min，延伸72℃40s，35个循环；72℃7min；

三、细菌PCR-DGGE：其中DGGE胶体为浓度是8.0％(体积)的丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围为40％～70％，电泳电压为150V，电泳时间为9h、每隔1h点样一次；

即完成传统发酵豆酱中细菌的检测；其中步骤三中凝胶变性梯度范围100％为7mol/L尿素、40％(体积分数)甲酰胺。

本发明方法在彻底清除传统发酵豆酱中微生物细胞之外其它成分的同时，尽可能的避免了微生物种类和数量的流失，而且整个检测过程中不改变DNA的含量，减小了最终分析偏差，保证了检测结果的准确性。

采用本发明方法可以准确的检测传统发酵豆酱中的细菌，而且还可以对发酵过程中的豆酱进行检测，时时了解豆酱中的微生物群落结果，为科学研究发酵豆酱奠定了基础。

附图说明

图1是具体实施方式五步骤三变性梯度凝胶制备示意图；图2是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验1中凝胶变性梯度范围为20％～50％的检测结果图；图3是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验1中凝胶变性梯度范围为30％～60％的检测结果图；图4是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验1中凝胶变性梯度范围为40％～70％的检测结果图；图5是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验2中第一组检测结果图；图6是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验2中第二组检测结果图；图7是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验2中第三组检测结果图；图8是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验3中选用丙烯酰胺浓度为6.0％(体积)的DGGE胶银染后检测结果图；图9是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验3中选用丙烯酰胺浓度为8.0％(体积)的DGGE胶银染后检测结果图；图10是具体实施方式五细菌PCR-DGGE条件对比试验4不同电泳时间的检测结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式传统发酵豆酱中细菌的检测方法按以下步骤进行：一、传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA提取：

a、传统发酵豆酱样品预处理：用50mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮10g传统发酵豆酱样品，然后加入玻璃珠用振荡器振荡5min，再在200r/min的条件下离心5min，收集上清液，离心沉淀则用pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮、离心并重复3次，其中每次离心转速为200r/min、离心时间为5min，之后汇集离心上清液以9000r/min的转速离心12min，收集离心沉淀，将离心沉淀用50mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮后在9000r/min的条件下离心12min并重复3次，再将离心沉淀用8mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮，并用移液器吹打后置于振荡器上振荡2～3min，即得到传统发酵豆酱样品预处理液；

b、抽提传统发酵豆酱样品细菌总基因组：

(1)取1mL传统发酵豆酱样品预处理液在12000r/min条件下离心1min，弃去上清液；

(2)向b(1)离心沉淀加中加入180μL的裂解缓冲液(Lysis Buffer 2)和20μL蛋白酶K，振荡悬浮；

(3)将b(2)获得的悬浮液在55℃条件下孵育15min后加入20μL的RNase A室温孵育2分钟，然后加入10μL、浓度为10％(体积)的十二烷基硫酸，并立即涡旋5s，再加200μL的结合缓冲液(Binding Buffer 2)立即涡旋5s，之后在70℃条件下孵育10min，得到细胞裂解液；

(4)将200μL无水乙醇加入b(3)获得的细胞裂解液中涡旋混合5s，然后将全部涡旋混合液加入离心吸附柱中以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液，再加入500μL清洗缓冲液(Clean Buffer)，以12000r/min转速离心30s，并弃去流出液，再加入500μL清洗缓冲液，以12000r/min转速离心30s，并弃去流出液，之后加入500μL洗涤缓冲液(Wash Buffer1)，以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液后，再加入500μL洗涤缓冲液，以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液后再以12000r/min的转速离心2min，去除流出液；

(5)将离心吸附柱转入一个新离心管中并在离心吸附柱中央加入200μL溴化乙锭，然后置于室温环境中静置1min，再以12000r/min的转速离心2min，再用洗脱缓冲液(Elution Buffer)进行洗脱DNA，收集洗脱液，即得到传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA；

二、PCR扩增细菌16S rDNA的V3区：

PCR扩增引物为F338GC和R518，引物F338GC的序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，引物R518的序列为5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

PCR扩增反应体系如表1所示：

表1

  PCR反应体系 加入体积  终浓度  10×Taq Buffer(Mg²⁺Free) 5.0μL  2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0μL  各0.2mmol/μL  引物F338GC(1pmol/L) 5.0μL  0.1μmol/μL  引物R518(1pmol/L) 5.0μL  0.1μmol/μL  25mmol/L MgCl₂ 5.0μL  0.2mmol/μL  Taq(5U/μL) 1.0μL  0.5U/μL  Template 5.0μL  双蒸水 Up to 50μL

PCR扩增反应程序：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃1min，延伸72℃40s，35个循环；72℃7min；

三、细菌PCR-DGGE：其中DGGE胶体为浓度是8.0％(体积)的丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围为40％～70％，电泳电压为150V，电泳时间为9h、每隔1h点样一次；

即完成传统发酵豆酱中细菌的检测；其中步骤三中凝胶变性梯度范围100％为7mol/L尿素、40％(体积分数)甲酰胺。

本实施方式在去除传统发酵豆酱中微生物细胞之外其它成分的同时，尽可能的避免了微生物种类和数量的流失，而且整个检测过程中不改变DNA的含量，减小了最终分析偏差，保证了检测结果的准确性。

本实施方式步骤一a中预处理好的样品分装于体积为2mL的EP管中，置于-20℃环境中冻存。

本实施方式步骤二PCR扩增产物可置于4℃环境中保存。

本实施方式方法对DNA的提取方法进行优化，提高了抽提率及DNA产物的纯度，在彻底清除传统发酵豆酱中微生物细胞之外其它成分的同时，尽可能的避免了微生物种类和数量的流失，而且整个检测过程中不改变DNA的含量，减小了最终分析偏差，保证了检测结果的准确性。

本实施方式步骤三中采用美国CBS公司生产的2401DGGE电泳装置进行细菌PCR-DGGE。本实施方式中使用的药品、试剂和酶等均容易购得，若无注明则浓度为产品标注浓度。本实施方式步骤一b中使用的裂解缓冲液、清洗缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、RNase A、蛋白酶K和离心吸附柱都选自北京全式金生物技术有限公司的Easypure Genomic DNA Extraction Kit。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中每次点样量为5.0μL，由2.5μL步骤二获得的PCR扩增产物与2.5μL中性上样液混合组成。其它步骤及参数与实施方式一相同。

本实施方式步骤三中直接用步骤二获得的PCR扩增产物，无需对PCR扩增产物进行纯化。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：中性上样液10mL由2g蔗糖、100μL浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl、20μL浓度为0.5mol/L、pH值为8.0的EDTA、10mg溴酚蓝和余量的去离子水组成。其它步骤及参数与实施方式二相同。

本实施方式中性上样液置于4℃环境中保存。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点是：用上海华舜生物工程有限公司DNA胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)回收步骤二获得的PCR产物检测16S rDNA的V3区扩增结果。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。

取0.5μL PCR扩增产物加入2.5μL 6×loading buffer混合均匀，以DL2000为Marker，于浓度为1％(体积)的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。将PCR扩增结果置于凝胶成像系统中观察，有约230bp的荧光条带出现说明16SrDNA的V3区扩增成功，若没有约230bp的荧光条带出现说明16S rDNA的V3区扩增失败。

具体实施方式五：结合图1说明本实施方式，本实施方式传统发酵豆酱中细菌的检测方法按以下步骤进行：一、传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA提取：

a、传统发酵豆酱样品预处理：用50mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮10g传统发酵豆酱样品，然后加入玻璃珠用振荡器振荡5min，再在200r/min的条件下离心5min，收集上清液，离心沉淀则用pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮、离心并重复3次，其中每次离心转速为200r/min、离心时间为5min，之后汇集离心上清液以9000r/min的转速离心12min，收集离心沉淀，将离心沉淀用50mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮后在9000r/min的条件下离心12min并重复3次，再将离心沉淀用8mL、pH值为7.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液悬浮，并用移液器吹打后置于振荡器上振荡2～3min，即得到传统发酵豆酱样品预处理液；

b、抽提传统发酵豆酱样品细菌总基因组：

(1)取1mL传统发酵豆酱样品预处理液在12000r/min条件下离心1min，弃去上清液；

(2)向b(1)离心沉淀加中加入180μL的裂解缓冲液和20μL蛋白酶K，振荡悬浮；

(3)将b(2)获得的悬浮液在55℃条件下孵育15min后加入20μL的RNase A室温孵育2分钟，然后加入10μL、浓度为10％(体积)的十二烷基硫酸，并立即涡旋5s，再加200μL的结合缓冲液立即涡旋5s，之后在70℃条件下孵育10min，得到细胞裂解液；

(4)将200μL无水乙醇加入b(3)获得的细胞裂解液中涡旋混合5s，然后将全部涡旋混合液加入离心吸附柱中以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液，再加入500μL清洗缓冲液，以12000r/min转速离心30s，并弃去流出液，再加入500μL清洗缓冲液，以12000r/min转速离心30s，并弃去流出液，之后加入500μL洗涤缓冲液，以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液后，再加入500μL洗涤缓冲液，以12000r/min的转速离心30s，弃去流出液后再以12000r/min的转速离心2min，去除流出液；

(5)将离心吸附柱转入一个新离心管中并在离心吸附柱中央加入200μL溴化乙锭，然后置于室温环境中静置1min，再以12000r/min的转速离心2min，再用洗脱缓冲液进行洗脱DNA，收集洗脱液，即得到传统发酵豆酱样品细菌总基因组DNA；

二、PCR扩增细菌16S rDNA的V3区：

PCR扩增引物为F338GC和R518，引物F338GC的序列为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，引物R518的序列为5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

PCR扩增反应体系如表1所示：

表1

  PCR反应体系 加入体积  终浓度  10×Taq Buffer(Mg²⁺Free) 5.0μL  2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0μL  各0.2mmol/μL  引物F338GC(1pmol/L) 5.0μL  0.1μmol/μL  引物R518(1pmol/L) 5.0μL  0.1μmol/μL  25mmol/L MgCl₂ 5.0μL  0.2mmol/μL  Taq(5U/μL) 1.0μL  0.5U/μL  Template 5.0μL  双蒸水 Up to 50μL

PCR扩增反应程序：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃1min，延伸72℃40s，35个循环；72℃7min；

三、细菌PCR-DGGE：

(1)胶外套垫圈的安装：

A、将玻璃板垂直放置在桌面上胶条的凹口中，使玻璃板底边与封口胶条的凹口嵌合；

B、当用封口条围绕玻璃板的两个底角进行封口时，要确定封条的凹口与玻璃板平衡，当封条固定在玻璃板两个底角后，开始玻璃板两边的封口；

C、将有封条的玻璃板水平放在实验台上，保持封口向上，然后将两条隔离条沿着封条内边缘插进去，使每条隔离条的边角贴紧玻璃板的底部；

D、将玻璃板的底边放置在实验台上，从底部边缘慢慢放开，确定边缘封条已经封好后，用2#夹子A2沿底部进行固定；

E、将底部已夹好2#夹子A2的玻璃板垂直放置在实验台上，确定的底部两个2#夹子A2完全固定好水平性，然后用2#夹子A2对称夹玻璃板的两边，确定在板之间的封条是平衡的；

(2)制胶过程：

a、将GM-40梯度灌胶器放置在已抬高的磁力搅拌器上，并将一个小型的磁力搅拌子放置靠近出口的灌胶器右筒C-2里，调节灌胶阀V-2与玻璃板顶部的垂直距离为12cm；

b、将高浓度变性液灌进梯度灌胶器右筒C-2内，并打开内部阀V-1赶走阀中气泡，让大约1mL的高浓度变性液回流到梯度灌胶器左筒C-1内，用吸管将左筒C-1内1mL高浓度变性液吸回右筒C-2内，并用吸水纸将残留在左筒C-1内的残余液体吸干；

c、将低浓度变性液灌进梯度灌胶器左筒C-1内；

d、打开磁力搅拌器；

e、用胶带固定出口管的针头于玻璃板的凹口处；

f、先打开内部阀V-1，然后打开外部阀V-2，让混合的变性液自动流出，并将外部阀V-2开关调制最大；

g、0.75mm厚度隔条的胶体积约23mL，如胶体不足以添充满玻璃板的整个空间，可以用0％变性剂[浓度是8.0％(体积)的丙烯酰胺凝胶]来补充；

h、根据实验需要插入16孔的梳子，将胶置于在室温聚合过夜或置于45℃烘箱中聚合40min；

(3)胶板电泳前的准备：

a、将20×电泳缓冲液稀释成1×TAE电泳缓冲液，倒入DGGE装置中；

b、用蒸馏水冲洗玻璃板上残余的未聚合的丙烯酰胺及变性剂；

c、小心拔出梳子，拔开胶板底部的封条，并快速将胶板上的2#夹子A2全部移走后放到胶板盒上正确的位置，用1#夹子将胶板固定在胶盒上；

d、将胶板盒浸入预热至60℃的电泳缓冲液箱里，将循环的流通管与电泳槽连接好，用1×TAE电泳缓冲液冲洗上样孔，并加满电泳槽的上槽，打开热循环搅拌器进行Buffer循环；

(4)变性梯度凝胶电泳：

a、50V恒压预电泳约30min；

b、调整上样样品浓度，2.5μL步骤二获得的PCR扩增产物与2.5μL中性上样液(10mL中性上样液由2g蔗糖、100μL浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl、20μL浓度为0.5mol/L、pH值为8.0的EDTA、10mg溴酚蓝和余量的去离子水组成)混合，点样；

c、连接黑色电源线到胶盒上；

d、盖好盖子，打开电源开关，150V恒压电泳；

e、电泳时间为9h、每隔1h点样一次；

(5)银染检测：

a、电泳结束后，关掉电源，将连接管和电泳线断开，拿出胶板盒，将胶板盒上的玻璃板取出；

b、将玻璃板分离楔伸进两块玻璃板的缝隙，将两块玻璃板分开；

c、固定凝胶：将凝胶浸没入塑料盘内固定液中，充分震荡直至样品中染料完全消失，整个过程约15min；

d、洗胶：将去凝胶浸没在去离子水中振荡洗胶3次，每次2min；

e、凝胶染色：沥净凝胶上的去离子水后把凝胶移至银染溶液中充分摇动20min；

f、凝胶显影：在500mL预冷的显影液中加入1.5mL甲醛和200μL硫代硫酸钠溶液，混匀；从染色液中取出的凝胶放入装有去离子水的盘中浸洗5～10s，然后立刻将凝胶取出迅速沥干，再将凝胶转移至预冷的显影液中充分振荡，显影时间为3～5min；

g、固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定液，停止显影反应；

h、在去离水中浸洗凝胶两次，每次2min；

i、封胶，扫描照相：在干净玻璃板上铺上已经浸湿的玻璃纸，用玻璃棒赶走气泡；将丙三醇均匀覆盖到玻璃纸上，并将凝胶轻轻置于玻璃纸上，铺平；在凝胶上再均匀覆盖一层丙三醇；用浸湿玻璃纸平铺到凝胶上，赶走气泡；用夹子夹好玻璃板，室温避光风干；待凝胶干燥后，小心地将其从玻璃板上取下，扫描照相；即完成传统发酵豆酱中细菌的检测。

本实施方式步骤三中采用美国CBS公司生产的2401DGGE电泳装置进行细菌PCR-DGGE；步骤三中所用的玻璃板用洗衣粉刷洗后用自来水冲净，再用去离子水冲洗、自然风干。本实施方式步骤三中DGGE胶体为浓度是8.0％(体积)的丙烯酰胺凝胶，凝胶变性梯度范围为40％～70％(高浓度变性液为70％，低浓度变性液为40％)，步骤三中凝胶变性梯度范围100％为7mol/L尿素、40％(体积分数)甲酰胺。

本实施方式所采用的传统发酵豆酱样品采集于齐齐哈尔市拜泉县，传统发酵豆酱样品分酱醅发酵阶段和稀态发酵阶段两阶段采集：酱醅发酵阶段每隔7天取样1次，共采集12次，稀态发酵阶段每隔14天取样1次，共采集5次。采用本实施方式方法两阶段共检测出细菌18种[其中包括嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、魏斯氏菌(Weissella cibaria)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，中间气单胞菌(Aeromonas media)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)，6种不可培养的细菌(unculture species)]，且多组平行实验结果相同。对于相同的传统发酵豆酱样品，采用形态鉴定法两阶段只确定出10种细菌(为嗜水气单胞菌、魏斯氏菌、木糖葡萄球菌、短乳杆菌，乳明串珠菌、单核细胞增生李斯特菌、枯草芽孢杆菌、模仿葡萄球菌、坚硬芽胞杆菌和嗜盐四联球菌)；采用现有PCR-DGGE检测法与总基因组DNA直接提取法结合两阶段共检出8种细菌，而且与形态鉴定法(及本实施方式方法)对照发现有2种鉴定结果明显错误；采用现有PCR-DGGE检测法与总基因组DNA间接提取法结合两阶段共只检出7种细菌。实验结果说明本实施方式检测方法检测结果稳定、准确。

说明本实施方式方法可有效的去除样品中的杂质、减小对检测结果的影响，而且避免了微生物种类和数量的大量流失，确保了检测结果的准确性。

细菌PCR-DGGE条件对比试验(除对比实验条件外其它条件与本实施方式方法相同)：

对比试验1、凝胶变性梯度范围为20％～50％的检测结果如图2所示，DGGE条带均有堆积现象，条带分离效果不好；凝胶变性梯度范围为30％～60％的检测结果如图3所示，DGGE条带无堆积现象，条带分离效果较好，但是电泳时间延长，会出现条带逸出凝胶的现象，造成信息丢失；凝胶变性梯度范围为40％～70％的检测结果如图4所示，DGGE条带无堆积现象，条带分离效果较好，并能够避免条带逸出的现象。

对比试验2、一般认为PCR扩增产物纯化后检测效果更好。第一组直接用步骤二获得的PCR扩增产物进行步骤三检测(本实施方式)，检测结果如图5所示；第二组用经PCR产物纯化试剂盒纯化后的PCR扩增产物进行步骤三检测，检测结果如图6所示；第三组用DNA胶回收试剂盒回收的凝胶进行步骤三检测，检测结果如图7所示。第一组和第二组电泳效果无明显差别，条带都比较清晰，且条带分离程度好；所以选用本实施方式可以在不降低检测效果的情况下更好的节约成本；而第三组电泳条带分离程度不好，模糊不清。

对比试验3、选用丙烯酰胺浓度为6.0％(体积)的DGGE胶软，在银染过程中易断裂，断裂的DGGE胶不适于银染分析(如图8所示)；选用丙烯酰胺浓度为10％(体积)的DGGE胶较硬，在其灌制过程中易聚合，不易制备；选用丙烯酰胺浓度为8.0％(体积)的DGGE胶软硬适中，在银染过程中不易断裂，且容易灌制，条带分离效果好(如图9所示)。

对比试验4、不同电泳时间(每隔1h点样一次)的检测结果如图10所示，电泳8h、7h、6h、5h、4h的DGGE条带分离效果均不好，且条带不清晰，而电泳10h的DGGE条带分离效果较好，但出现了二次堆积现象；只有电泳9h的DGGE条带的分离效果相对较好。

序列表

<110>黑龙江大学

<120>传统发酵豆酱中细菌的检测方法

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<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>细菌16S rDNAV3区的PCR扩增上游引物F338GC。

<400>1

actcctacgg gaggcagcag 20

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>细菌16S rDNA V3区的PCR扩增下游引物R518。

<400>2

attaccgcgg ctgctgg    17