一种临床磁共振成像检测庆大霉素的方法

摘要

一种临床磁共振成像检测庆大霉素的方法，属于免疫检测技术领域。本发明将庆大霉素修饰磁性纳米粒子，庆大霉素标准或待测上清液，庆大霉素抗体，羊抗兔二抗，抗体与庆大霉素修饰磁性纳米粒子免疫聚合物的形成，由此产生磁共振信号，进行磁共振检测。磁共振信号检测是利用抗体与庆大霉素修饰磁性纳米粒子形成免疫聚合物，有效的缩短水中质子横向驰豫时间T2值而产生信号。通常样品中庆大霉素浓度越大，被抗体捕获的庆大霉素量越多，则与磁性纳米粒子表面的庆大霉素结合的抗体越少，测得的T2数值越大。本法不需复杂的样品前处理；操作简便，只需加待测样品孵育后直接测定T2值，一步就可完成；用于标记超顺磁性纳米粒子的粒径约为10nm，水溶性高，分散性稳定性好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种磁性纳米粒子标记抗体定量检测庆大霉素的方法，属于免疫检测技术领域。

背景技术

庆大霉素是由小单孢菌产生的多组分抗生素，含C₁、C₂、C_1a等组分，结构见附图1。硫酸庆大霉素是白色粉末，有吸湿性，易溶于水，难溶于一般有机溶剂，对温度和酸、碱都稳定，抗菌谱和卡那霉素基本相同。特点是对绿脓杆菌、变形杆菌和耐青霉素金葡萄都具抑制作用。与新霉素、卡那霉素有交叉耐药现象。主要用于上述敏感菌的严重感染如败血症、呼吸道感染、肺炎、肠道感染、胆道感染、尿路感染、软组织感染等的治疗。庆大霉素的毒理作用同氨基糖苷类其它药物类似，具有很强的肾毒性和肝毒性，毒害很大。

当今国际上常用的庆大霉素残留检测的方法有：微生物法、液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等。微生物检测不准确且检测灵敏度不高，而仪器分析方法不仅需要昂贵的仪器设备，对操作人员的要求也比较高，需要经过复杂的样品前处理才能进行。国外早已经开展了对氨基糖苷类抗生素免疫分析方法的研究，常用的方法为酶联免疫分析法(ELISA)或称为免疫酶定量分析法(IEMA)，这类方法是将包被原包被酶标板，加入药物及抗药物抗体，再加入酶标二抗，即检测抗体，最后加入底物显色，一定时间后，用酶标仪检测某一特定波长的吸光度值，根据已知标准品含量计算样品中待测药物的浓度，此操作繁琐，费时。

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技术由于可以用来对生物内脏器官和软组织进行无损的快速检测，已经成为诊断软组织病变尤其是检测肿瘤的最为有效的临床诊断方法之一。对于超顺磁性纳米颗粒而言，其主要作用是缩短横向驰豫时间(T₂)，而对纵向驰豫时间(T₁)影响不大。国内目前为止尚未见有利用超顺磁性纳米粒子的磁共振信号达到对体外目标物检测的报道，本发明弥补了这一空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有灵敏性、特异性、准确度、操作方法简单的磁性纳米粒子标记抗体的免疫检测方法，用于庆大霉素残留的快速检测。

本发明的技术方案：一种临床磁共振成像检测庆大霉素的方法，首先将庆大霉素修饰磁性纳米粒子，加庆大霉素标准或待测上清液，庆大霉素抗体，羊抗兔二抗，抗体与庆大霉素修饰磁性纳米粒子形成免疫聚合物，由此产生磁共振信号，进行磁共振检测；步骤为：

(1)庆大霉素与磁性纳米粒子的藕联：

1μL碳二亚胺EDC和2.4mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺sulfo-NHS加入到0.5mL、1.3mg/mL的Fe₃O₄水溶液中，反应15min活化，活化后的Fe₃O₄加入1mg庆大霉素(GM药品)，室温反应4小时，于0.01M、pH7.4的PBS中透析24小时，除去未反应的庆大霉素小分子，制得庆大霉素修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子；

(2)磁共振检测，绘制驰豫时间T₂～C庆大霉素浓度标准曲线：

20μL、150μg/mL的庆大霉素修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子中加入20μL不同浓度的庆大霉素标准品，加入1μL、5mg/mL庆大霉素抗体，再加入1μL羊抗兔二抗，孵育2小时后，稀释到体积为250μL，加入到微孔板中，测磁共振，以横向驰豫时间T₂绘制T₂～C庆大霉素浓度标准曲线；

对照组设置：庆大霉素抗体用地塞米松抗体代替，其它操作同上；

所用的溶液皆为0.01M、pH7.4的PBS缓冲液；庆大霉素标准品浓度分别为0、8、12、16、32、48、72、100、120、144ng/mL；

用德国西门子临床磁共振成像设备(MAGNETOM Avanto 1.5T MRI)测磁共振，回波时间(echo time)TE为20-120ms，脉冲重复间隔时间(repetitiontime)TR为2000ms，所用线圈为头线圈；

(3)磁共振定量检测：

20μL、150μg/mL的庆大霉素修饰的Fe₃O₄磁性纳米粒子中加入20μL的待测上清液，加入1μL、5mg/mL庆大霉素抗体，再加入1μL羊抗兔二抗，孵育2小时后，稀释到体积为250μL，加入到微孔板中，测磁共振，以横向驰豫时间T₂与绘制的T₂～C庆大霉素浓度标准曲线对照，求出样品中庆大霉素的浓度。

所述的庆大霉素修饰的磁性纳米粒子是将庆大霉素用藕联方法藕联到羧基修饰的磁性纳米粒子的表面；磁性纳米粒子是双羧基修饰的磁性纳米粒子，其核心部分是Fe₃O₄。

所述的抗体是抗庆大霉素的多克隆抗体，经硫酸铵沉淀法纯化的特异性抗体。

所述的抗体与庆大霉素修饰的磁性纳米粒子形成免疫聚合物：于庆大霉素修饰的磁性纳米粒子中加入庆大霉素抗体后，磁性纳米粒子表面的庆大霉素与溶液中游离的庆大霉素竞争抗体，通过抗原与抗体的特异性结合形成抗原-抗体免疫聚合物。

所述的磁共振信号检测是利用抗体与庆大霉素修饰磁性纳米粒子形成免疫聚合物，有效的缩短水中质子横向驰豫时间T₂值而产生信号。通常样品中庆大霉素浓度越大，被抗体捕获的庆大霉素量越多，则与磁性纳米粒子表面的庆大霉素结合的抗体越少，则测得的T₂数值越大。

本发明的有益效果：

(1)本法不需复杂的样品前处理，即使对于全血，尿液，组织液。

(2)本法操作简便，只需加待测样品孵育后进行直接测定T₂值，只需一步就可完成。

(3)本法用于标记超顺磁性纳米粒子，粒径为10nm，水溶性高，分散性稳定性好。饱和磁化强度为65emu g^-1。

附图说明

图1庆大霉素结构式。

图2磁共振成像图(左)与微彩图(右)。

图3磁共振检测标准曲线。

具体实施方式

实施例1庆大霉素与磁性纳米粒子的藕联：

1μL碳二亚胺EDC和2.4mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺sulfo-NHS加入到0.5mL、1.3mg/mL的Fe₃O₄水溶液中，反应15min左右活化。活化后的Fe₃O₄加入1mg庆大霉素(GM药品)，室温反应4小时，于0.01M、pH 7.4的PBS中透析24小时，除去未反应的药物小分子。

实施例2磁共振：

20μL、150μg/mL的庆大霉素修饰的Fe₃O₄中加入20μL不同浓度的庆大霉素标准品，加入1μL庆大霉素抗体(5mg/mL)，再加入1μL羊抗兔二抗，孵育2小时后，稀释到体积为250μL，加入到微孔板中，测磁共振。

对照组设置：庆大霉素抗体用地塞米松抗体代替，其它操作同上。

所用的溶液皆为0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。庆大霉素标准品浓度分别为0、8、12、16、32、48、72、100、120、144ng/mL。

实施例3磁共振定量检测

磁共振设备为MAGNETOM Avanto 1.5T MRI，德国西门子临床磁共振成像设备。

本实验所用扫描时间参数为：回波时间(echo time)TE为20-120ms，脉冲重复间隔时间(repetition time)TR为2000ms，所用线圈为头线圈。

磁共振检测目标物的原理是通过抗体与药物修饰磁性纳米粒子免疫聚合物的形成引起水质子T₂值的大小，达到检测目标物目的。水中加入的庆大霉素越多则聚合物形成的越少，T₂值则越大。通过建立的T₂～C/庆大霉素浓度标准曲线可对比求出样品中庆大霉素的浓度。标准曲线见附图3。

实施例4实际样品测定

实际样品处理：取猪肉组织样品1g，于50mL离心管中，10mL、0.2M的PB(磷酸缓冲液)与组织样品混合，混合液在60℃孵育30min，然后4000r/min离心15min，取上清液待测。

20μL、150μg/mL的庆大霉素修饰的Fe₃O₄中加入20μL待测上清液，加入1μL庆大霉素抗体(5mg/mL)，再加入1μL羊抗兔二抗，孵育2小时后，稀释到体积为250μL，加入到微孔板中，用德国西门子临床磁共振成像设备(MAGNETOMAvanto 1.5T MRI)测磁共振，回波时间(echo time)TE为20-120ms，脉冲重复间隔时间(repetition time)TR为2000ms，所测为水中氢质子的T₂，故选TR为2000ms比较合适，所用线圈为头线圈，以T₂～C/庆大霉素浓度标准曲线对照，求出样品中庆大霉素的浓度。

表1实际样品添加回收

标准曲线的绘制，以标准品浓度为横坐标，以ΔT₂纵坐标，数据见下表，作图，见附图3。

表2磁共振数据

  A  B  C  D  E  F  G  H  I  庆大霉素浓度ng/ml  144  120  100  72  48  32  16  12  8  ΔT₂  47.5  39.8  34.4  21.9  15.1  7.8  3.5  2.1  1