抗庆大霉素禽源单链抗体的筛选及间接竞争ELISA检测方法的建立

摘要

庆大霉素(Gentamicin，Gent)属于氨基糖苷类抗生素药物，对革兰阴性菌和革兰阳性菌有极好的抑制作用，因此，广泛的应用于医药和兽药领域。然而，庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对肾脏、听觉以及脑神经的损害严重。随着庆大霉素在国内外医疗机构、畜牧养殖业中越来越广泛地应用，它所带来的负面问题日益严重，其残留检测也渐渐被人们所重视，我国及欧盟均对庆大霉素的残留制订了严格的检测标准。因此，开发一种高通量、快速、灵敏的检测技术对庆大霉素的残留监控及保证动物源性食品安全具有重要意义。本研究在总结前人工作的基础上，探讨了禽源单抗用于抗生素残留检测的可行性并建立了ic-ELISA快速检测方法。主要研究内容如下:
　　1.庆大霉素(Gent)人工抗原的合成与鉴定
　　根据庆大霉素的结构特点，采用戊二醛法将庆大霉素与载体蛋白（牛血清白蛋白、卵清蛋白）偶联。通过紫外可见分光光度法、SDS-PAGE鉴定偶联产物，初步认为Gent人工抗原合成成功。
　　2.抗-Gent特异性单链抗体的筛选及原核表达
　　使用免疫原Gent-BSA免疫青年白来航产蛋鸡，待第四次加强免疫后第7天安乐死产蛋鸡，取脾脏并分离脾脏B淋巴细胞，提取总RNA并反转录成cDNA，再以cDNA为模板分别扩增抗体的轻链与重链可变区基因，并经Overlap PCR组装为单链抗体(scFv)基因。分别通过SfiⅠ/NotⅠ酶切scFv与pCANTAB5E后，将scFv基因片段连接入pCANTAB5E噬菌粒载体，并将重组载体经热激法转化入TG1宿主菌中，构建噬菌体展示抗体库。经4轮固相生物淘选后，使特异性抗体得到有效富集，库容分别为:3.7×105、6.7×106、3.71×109和1.65×109。第4轮淘选后，随机挑选33个克隆，进行phage-ELISA检测。选取2株（S-1和S-5）反应性良好的phage-scFv,并将这两株抗体基因克隆入pET-30a载体，然后将重组载体转化入BL21(DE3)中，诱导表达，发现重组scFv蛋白主要以包涵体形式存在，将其变性复性后用于后续实验。
　　3.间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法的建立
　　通过优化ic-ELISA的工作条件，建立了快速检测Gent的ic-ELISA检测方法，并通过交叉反应实验与添加回收实验评估该检测方法的可行性。结果显示:该方法的相关回归方程分别为:S-1:y=0.74407-0.23033x(R2=0.9849)，S-5:y=0.76066-0.23479x(R2=0.97475)，IC50分别为:12.418ng/mL和14.674ng/mL，与Gent类似物（卡那霉素和阿米卡星）的交叉反应不超过0.04％。添加回收检测显示组内回收率在70.70％-118.09％之间，组间回收率在60.91％-118.04％之间。以上表明该检测方法可行。
　　本研究成功制备了Gent人工抗原，建立了抗Gent的鸡源scFv噬菌体抗体库，并制备了高特异性scFv抗体;并进一步建立了ic-ELISA检测方法，为开发动物源可食性组织中Gent快速检测ELISA试剂盒奠定了基础。同时证明了禽源单链抗体可用于抗生素残留检测。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 兽用抗生素残留现状

1．2 抗生素残留常用分析检测技术

1．2．1 理化检测法

1．2．2 微生物测定法

1．2．3 免疫学检测法

1．3 抗体技术

1．3．1 嵌合抗体与改型抗体技术

1．3．2 小分子抗体技术

1．3．3 抗体库技术

1．4 单链抗体(scFv):制备原理及临床应用

1．4．1 单链抗体的制备

1．4．2 单链抗体(scFv)的应用

1．5 本研究的目的和意义

第二章 庆大霉素人工抗原的合成与鉴定

2．1 材料

2．1．1 试剂

2．1．2 主要溶液的配置

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 Gent人工抗原的制备

2．2．2 Gent人工抗原的鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 紫外分光度法鉴定结果

2．3．2 SDS-PAGE鉴定结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 禽源抗庆大霉素单链抗体的筛选及原核表达

3．1 材料

3．1．1 试剂

3．1．2 菌株与质粒

3．1．3 主要溶液的配置

3．1．4 主要培养基的配置

3．1．5 主要仪器

3．1．6 实验动物

3．2 试验方法

3．2．3 抗庆大霉素单链抗体库的构建

3．2．4 特异性抗庆大霉素单链抗体的淘选

3．2．5 phage-ELISA及特异性抗庆大霉素单链抗体的表达

3．3 结果与分析

3．3．1 总RNA的提取及scFv目的基因的获得

3．3．2 噬菌体抗体库的淘选效率分析

3．3．3 scFv的表达纯化分析

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 庆大霉素ic-ELISA检测方法的建立

4．1 材料

4．1．1 试剂

4．1．2 主要溶液的配置

4．1．3 所用仪器

4．2 试验方法

4．2．1 棋盘ELISA

4．2．2 ic-ELISA检测庆大霉素标准曲线的建立

4．3．2 ic-ELISA检测方法的交叉反应性分析

4．3．3 ic-ELISA检测方法的评价

4．4 讨论

4．5 小结

结论

参考文献

致谢

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