O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及方法

摘要

本发明提供了一种O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒。本发明针对O157:H7的O抗原编码rfbE、志贺样毒素stx2、H鞭毛抗原编码flic基因分别设计LAMP引物，提供一种特异性强、灵敏度高的O157:H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及检测方法。本发明有益效果主要体现在：(1)不需要使用昂贵、精密的仪器设备，仅需一金属裂解仪/恒温水浴装置；(2)耗时短，在恒温条件下进行反应，1小时左右即可完成；(3)白光下通过肉眼目测反应体系颜色变化即可进行结果判断，操作简便；(4)本发明方法简易、快速、特异、敏感，在快速检测方面有着较为广泛的应用前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及O157：H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

新发现和重新抬头的病原微生物是当前世界医学面临的新课题，肠出血性大肠菌O157：H7就是其中的一种。O157：H7是肠出血性大肠艾希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)最主要的血清型，于1982年首次在美国发现，为新发病原菌。其致病性强，感染剂量极低，食入不足10个细菌即可引起疾病。该菌主要引起出血性肠炎(HC)、溶血性尿毒综合症(HCS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，病死率高达30％以上，是全球关注的世界性公共卫生问题。我国自1988年在江苏徐州检出首株EHEC O157：H7后，各地加强了对肠道门诊、畜禽及肉制品等的食品检测，相继从腹泻病人、家畜、家禽及食品中多次检出O157：H7大肠菌。通过对近几年我省O157分离株毒力基因检测(PCR法)发现我省主要以Stx2为主，同时携带Stx2和Stx1基因的菌株则比较少，这与国内其他省市分离出的大多数菌株相似，但与Fagan等报道则不同，故本研究主要选取stx2基因为靶基因进行检测。rfbE与fliC基因分别编码O157：H7菌体抗原O抗原及鞭毛抗原H抗原，针对这两种基因的检测将有助于O157：H7血清型诊断的进一步验证。

目前，大多数基层实验室鉴定O157：H7大肠菌仍主要依赖于传统培养方法、生化和血清学鉴定方法，检验方法繁琐，费时费力，报告检验结果时间长，难以适应快速检测的要求。近年来，PCR法检测O157：H7大肠菌得到了迅速发展，主要有常规PCR、多重PCR、Real-time PCR等，但这些方法均需特殊的仪器，不适合在基层或小型实验室推广使用。Notomi等是2000年开发出的一种新的DNA环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，因其具有操作简便易行、结果判读简单等特点，可以在基层实验室推广使用，该方法已在一些国家地区被广泛应用，而国内对此技术研究则刚刚起步，应用LAMP技术检测O157：H7大肠菌目前未见文献报道。

环介导等温扩增技术原理：环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术是Notomi等2000年开发出的一种新的DNA环介导的恒温扩增法，即利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的4-6条引物，特异地识别靶序列上的6个特定区域，在60～65℃等温条件下高效特异地扩增目的靶基因，终产物是具有与目的靶基因反相重复序列的茎环DNA。如果再设计1-2条环引物，则可大大提高扩增反应速度。该方法的一大特点是，可以通过反应副产物—白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在，抑或在体系中加入荧光染色试剂，在紫外灯下观察，对反应产物实时监测。

(三)发明内容

本发明就是根据上述原理，针对O157：H7的O抗原编码rfbE、志贺样毒素stx2、H鞭毛抗原编码flic基因分别设计LAMP引物，提供一种特异性强、灵敏度高的O157：H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

O157：H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、Bst DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸混合物、PCR缓冲液，所述特异性扩增引物序列如下：

rfbE FIP(O抗原编码rfbE特异性扩增内引物FIP)：

CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT；

rfbE BIP(O抗原编码rfbE特异性扩增内引物BIP)：

TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；

rfbE F3(O抗原编码rfbE特异性扩增外引物F3)：

AACAGTCTTGTACAAGTCCA；

rfbE B3(O抗原编码rfbE特异性扩增外引物B3)：

GGTGCTTTTGATATTTTTCCG；

rfbE LB(O抗原编码rfbE特异性扩增环引物LB)：

CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC；

stx2 FIP(志贺样毒素stx2特异性扩增内引物FIP)：

GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT；

stx2 BIP(志贺样毒素stx2特异性扩增内引物BIP)：

TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；

stx2 F3(志贺样毒素stx2特异性扩增外引物F3)：

GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG；

stx2 B3(志贺样毒素stx2特异性扩增外引物B3)：

GGCCACATATAAATTATTTTGCTC；

flic FIP(H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增内引物FIP)：

GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT；

flic BIP(H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增内引物BIP)：

TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG；

flic F3(H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增外引物F3)：

GAACTGACGGTTCAGGCC；

flic B3(H鞭毛抗原编码flic基因特异性扩增外引物B3)：

AGCCATTCAGACCCAGAGT。

上述为试剂盒的组要成分，其他辅助成分可按本领域常规方法选择。其中脱氧三磷酸核苷混合物(dNTP)为dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合，通常为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1：1：1：1的混合物。

所述试剂盒中还可包括：甜菜碱(Betaine)、MgSO₄、MnCl₂和钙黄绿素(Calcein)。本发明方法主要参照2008年Tomita等报道，可在LAMP反应体系中加入适量MgSO₄、MnCl₂、钙黄绿素，反应结果在白光下通过肉眼观察绿色是否生成进行判定，实现反应及产物检测一步完成。该方法是在Notomi等的方法基础上加以改进的最新方法，结果可通过在白光下肉眼观察是否产生绿色钙锰复合物来判断靶基因存在与否，它比以往在白光下通过肉眼观察有否产生白色焦磷酸镁沉淀更易于判断。

本发明还涉及O157：H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测方法，所述方法包括：

(1)设计特异性扩增引物序列如下：

rfbE FIP：

CTCTCTTTCCTCTGCGGTCCGATGTTTTTCACACTTATTGGAT；

rfbE BIP：

TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；

rfbE F3：AACAGTCTTGTACAAGTCCA；

rfbE B3：GGTGCTTTTGATATTTTTCCG；

rfbE LB：CGAAACAAGGCCAGTTTTTTACC；

stx2 FIP：

GGTTAATAACAGACACCGATGTGG-ACAGAGATATCGACCCCT；

stx2 BIP：

TAAGGAATCACCTTGCAGATAAACTAGTACATTGGCATCGTGT；

stx2 F3：GTCTCTTCGTTAAATAGTATACGG；

stx2 B3：GGCCACATATAAATTATTTTGCTC；

flic FIP：

GCCGGATACGCGGTCAATTTCACTCCGATTCTGACCTGGACT；

flic BIP：

TGAACGTGCTGGCGAAAGACGTTTCAGGTCGATCGTGATGG；

flic F3：GAACTGACGGTTCAGGCC；

flic B3：AGCCATTCAGACCCAGAGT；

(2)提取待测样品DNA，在以待测样品DNA为模板、步骤(1)中序列rfbE FIP、rfbE BIP、rfbE B3、rfbE LB、stx2 FIP、stx2 BIP、stx2 F3、stx2 B3、flic FIP、flic BIP、flic F3和flic B3为引物的反应体系中进行LAMP反应；

(3)LAMP反应结束后，进行分析，若LAMP反应结果为阳性，则待测样品中含有O157：H7大肠菌。

所述反应体系中主要成分终浓度组成如下：

Bst DNA聚合酶缓冲液               终浓度为1×

引物rfbE FIP、stx2 FIP、flic FIP          各1.2～2.0μM

引物rfbE BIP、stx2 BIP、flic BIP          各1.2～2.0μM

引物rfbE F3、stx2 F3、flic F3             各0.1～0.5μM

引物rfbE B3、stx2 B3、flic B3             各0.1～0.5μM

引物rfbE LB、                             0.1～0.5μM

dNTP                                      0.4mM～1.0mM

Bst DNA聚合酶                             5～10U/反应

溶剂为DEPC水。所述的DEPC水指diethypyrocarbonate(焦碳酸二乙酯)处理过并经高温、高压消毒的MiliQ级纯水。

所述缓冲液终浓度为1×，是指缓冲液中各组分在反应体系终浓度与1×Bst DNA聚合酶缓冲液相同，即表示缓冲液中各组分在反应液中终浓度如下：20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄、4mMMgSO₄、0.1％ TritonX-100。

所述反应体系中还包括终浓度如下的组分：0.5～1.0M的甜菜碱、2～6mM的MgSO₄、0.3～0.8mM的MnCl₂和10～30μM的钙黄绿素。

所述步骤(2)LAMP反应条件设置为：60℃ 1h，80℃ 2min。

具体的，所述方法如下：

(1)设计特异性扩增引物序列rfbE FIP、rfbE BIP、rfbE F3、rfbE B3、rfbELB、stx2 FIP、stx2 BIP、stx2 F3、stx2 B3、flic FIP、flic BIP、flic F3和flic B3；

(2)提取待测样品DNA，配制LAMP反应体系终浓度组成如下：

10×Bst DNA聚合酶缓冲液           终浓度为1×

引物rfbE FIP、stx2 FIP、flic FIP   各1.6μM

引物rfbE BIP、stx2 BIP、flic BIP              各1.6μM

引物rfbE F3、stx2 F3、flic F3                 各0.2μM

引物rfbE B3、stx2 B3、flic B3                 各0.2μM

引物rfbE LB                                   0.4μM

dNTP混合物                                    0.6mM

甜菜碱                                        0.8M

钙黄绿素                                      25μM

MnCl₂                                         0.5mM

MgSO₄                                         4mM

Bst DNA聚合酶                                 8U/反应

样品DNA                                       适量

溶剂为DEPC水；

LAMP反应条件设置为：60℃ 1h，80℃ 2min；

(3)LAMP反应结束后，肉眼观察产物颜色变化，呈现明显绿色判定为阳性，即样品含有O157：H7大肠菌，呈现橙色判断为阴性，呈现橙绿色则通过2％琼脂糖进行凝胶电泳观察条带是否出现，电泳条带明显者判定为阳性，不明显者判定为阴性(或取相应LAMP产物2ul再次LAMP，观察颜色变化)。每次试验均做阴阳性对照。

本发明有益效果主要体现在：

1.本方法不需要使用昂贵、精密的仪器设备，仅需一金属裂解仪/恒温水浴装置；

2.耗时短，在恒温条件下进行反应，1小时左右即可完成，大大缩短了该菌的检测周期(从菌株核酸的提取至检测完成仅需1.5h左右)；

3.白光下通过肉眼目测反应体系颜色变化即可进行结果判断，实现反应及产物检测一步完成，操作简便；

4.该方法为快速基因检测提供了又一新的方法手段；

5.该方法简易、快速、特异、敏感，其特点和优势是，它不仅适合于科研工作，还可以作为基层检验部门及小型实验室疾病应急诊断等使用，如对流行病学人员稍加培训，即可自行在应急车上或开展现场流行病学调查时使用，在快速检测方面有着较为广泛的应用前景。

(四)附图说明

图1为16株O157标准株及地方分离株rfbE基因LAMP扩增结果；

图2为16株O157标准株及地方分离株Stx2基因LAMP扩增结果；

图3为16株O157标准株及地方分离株fliC基因LAMP扩增结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

利用本发明所述的LAMP扩增检测方法对56株O157菌株(包括标准株O157：H7、地方O157分离株及其它肠道实验株)进行检测，将该结果与普通PCR、定量PCR法结果进行比较，以验证本方法特异性。实验中大肠菌O28ac84-1373、LT-85-44及84-135其fliC基因LAMP结果为阳性，结果其普通PCR与定量PCR结果也均为阳性，推测认为这可能与该三株菌均携带编码O157：H7鞭毛抗原H抗原的fliC基因有关。

反应体系如下：

10×缓冲液                                2.5μL

引物rfbE FIP、stx2 FIP、flic FIP          各1.6μM

引物rfbE BIP、stx2 BIP、flic BIP           各1.6μM

引物rfbE F3、stx2 F3、flic F3              各0.2μM

引物rfbE B3、stx2 B3、flic B3              各0.2μM

引物rfbE LB                                0.4μM

dNTP混合物(1:1:1:1)                       共0.6mM

甜菜碱                                     0.8M

钙黄绿素                                   25μM

MnCl₂                                      0.5mM

MgSO₄                                      4mM

Bst聚合酶                                  8U酶/反应

样品菌株DNA                                4μL

DEPC水补足至25μL。

LAMP扩增条件设置为60℃ 1h，80℃ 2min。

其中16株O157标准株及地方分离株rfbE、Stx2、fliC基因LAMP扩增结果分别见图1、图2和图3；(图中1～16菌株依次为882364标准株、W933标准株、97-1(O157：H7)、99-1(O157：H7)、00-2(O157：H-)、00-4(O157：H7)、00-5(O157：H7)、05-1(O157：H7)、00-6(O157：H7)、00-7(O157：H7)、06-12(O157：H7)、杭3-325(O157：H-)、杭3-189(O157：H-)、HZ1-68(O157：H-)、杭4-257(O157：H-)、杭3-307(O157：H-))。

通过实验部分菌株的LAMP扩增结果，可以看出，使用本发明方法检测，可针对目标菌株进行检测鉴定，特异性好。

灵敏度检测：

取菌量为5×10⁷cfu/mL的O157：H7大肠菌，用双蒸水进行10倍稀释，分别从10^-1～10^-8稀释液中吸取100uL，经100℃15min裂解再高速离心后，各制成100uL的DNA模板，按照上述条件进行LAMP敏感性试验。

以最低检出稀释度模板量计算灵敏度，本体系检测三种靶基因的最低检出限均为26cfu/反应，灵敏度高。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江省疾病预防控制中心

<120>O157：H7大肠菌的环介导等温扩增快速检测试剂盒及方法

<130>

<160>13

<170>PatentIn version 3.4

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<211>43

<212>DNA

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<220>

<223>人工序列

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<212>DNA

<213>Unknown

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<223>人工序列

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<212>DNA

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<223>人工序列

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