一种黄腐植酸的改性方法,及所得产品、及其在制备提高免疫力或防治HIV药物中的应用

摘要

本发明公开了一种黄腐植酸的改性方法，其包括如下步骤：(1)将含黄腐植酸的原料或黄腐植酸，在水中，在降解剂的作用下，经定向降解，制得黄腐植酸降解物；所述的降解剂为HNO

说明书

技术领域

本发明涉及一种黄腐植酸的改性方法，及所得产品及其在制备提高免疫力或防治HIV药物中的应用。

背景技术

腐植酸(Humic Acid，简写HA)是动植物遗骸，主要是植物的遗骸，经过微生物的分解和转化，以及一系列的化学过程和积累起来的一类有机物质。其由芳香族及其多种官能团构成的高分子有机酸，具有良好的生理活性和吸收、络合、交换等功能。腐植酸广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋，以及泥炭(又称草炭)、褐煤和风化煤等中。根据腐植酸在溶剂中的溶解度，可分为三个组分：①溶于丙酮或乙醇的部分称为棕腐酸；②不溶于丙酮部分称为黑腐酸；③溶于水或稀酸的部分称为黄腐酸(又称富里酸)。

人类对腐植酸的研究，自1786年从土壤中首次得到已有214年历史。如果以我国“药圣”明代著名医药学家李时珍《本草纲目》著作中编入的“乌金散”为个例的话，那腐植酸的应用已有四百多年。目前，腐植酸作为有机物原料，已广泛地应用于农、林、牧、石油、化工、建材、医药、卫生、环保等各个领域。我国腐植酸资源非常丰富，它储量大，分布广，品位好。据有关资料统计，有泥炭124.8亿吨，居世界第四位；褐煤1265亿吨，还有大量的风化煤。因此，对腐植酸资源的研究开发具有极大的发展前景。

艾滋病(AIDS)，即获得性免疫缺陷综合征，是由人类免疫缺陷病毒(HIV，Human Inununode ficiency Vires，)引起的一种免疫缺陷性疾病。当前，艾滋病病毒正以每天1.5万人受感染的速度在全球蔓延。随着现代人类物质文明的进步，艾滋病已经不仅仅是现代社会所面临的一个科学问题，而且日益成为人类所关注的社会问题。因此，当法国西诺西(Francoise Barre-Sinoussi)和蒙塔尼(Luc Montagnier)发现人类免疫缺陷病毒，美国盖洛(Robert Gallo)第一个分离出人逆转录病毒-人T细胞白血病病毒HTLV(通称为HIV)以后，研制高效的抗艾滋病药物一直是世界各国新药开发的重要课题之一。目前，人们常采用HIV蛋白酶作为治疗艾滋病(HIV)的主要药物，但存在HIV蛋白酶抑制剂生物活性低，副作用强，价格昂贵等缺点。因此，亟待寻求新的防治HIV病的药物。

目前，在医药领域中，腐植酸(包括黄腐植酸)的总临床应用示例多达1000以上，但尚未见在提高免疫力、防治HIV方面的相关文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种黄腐植酸的改性方法，及由该方法制得的黄腐植酸改性物，及其在制备提高免疫力或防治HIV的药物中的应用。

本发明的方法包括如下步骤：

(1)将含黄腐植酸的原料或黄腐植酸，在水中，在降解剂的作用下，经定向降解，制得黄腐植酸降解物；所述的降解剂为HNO₃、HNO₃和H₂SO₄，或者醋酸和H₂O₂。

其中，所述的含黄腐植酸的原料主要为含腐植酸的泥炭、褐煤或风化煤等天然原料。本发明中优选资源丰富的天然泥炭，尤其优选天然低位泥炭。所述的天然低位泥炭是由低洼处、季节性积水或常年积水地方生长的需要无机盐养分较多的植物，如苔草属、芦苇属和冲积下来的各种植物残枝落叶多年积累形成的泥炭，其一般分解程度较高，酸度较低，灰分含量较高。天然低位泥炭在我国西南、华中、华北及东北有大量的分布，本发明优选云南石屏的天然低位泥炭。所述的黄腐植酸为由上述各种天然原料中提取的溶于水或稀酸的腐植酸部分，或按现有技术由人工生化发酵制得的黄腐植酸，优选从天然低位泥炭中提取的黄腐植酸。所述的含黄腐植酸的原料或黄腐植酸可经过粉碎和/或风化后使用。

其中，所述的水的用量以使得含黄腐植酸的原料或黄腐植酸溶解为宜，较佳的，含黄腐植酸的原料或黄腐植酸与水的质量体积比为1g/0.5～10ml，更佳的为1g/0.6～2ml，最佳的为1g/1ml。

其中，所述的降解剂的用量较佳的为10～50％，更佳的为25～40％，百分比为降解剂在水中的质量浓度百分比。当使用HNO₃和H₂SO₄作为降解剂时，HNO₃和H₂SO₄的质量比较佳的为8：1～3：1。当使用醋酸和H₂O₂作为降解剂时，醋酸和H₂O₂的质量比较佳的为1.2：1～2：1。

其中，所述的定向降解的温度较佳的为50～125℃，更佳的为70～120℃，最佳的为80～110℃。所述的定向降解的时间较佳的为10～200min，更佳的为60～180min。

较佳的，所述的定向降解在超声波条件下进行。超声波的频率较佳的为100～800KHZ，更佳的为460～520KHz。

最优选的定向降解的条件为：降解剂的用量为质量百分比25～40％，超声波460KHz，温度80～110℃，定向降解的时间为60～180min。

(2)微波条件下，将步骤(1)制得的黄腐植酸降解物，与曲酸或含曲酸的提取物反应，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

其中，所述的曲酸即5-羟基-2-羟甲基1-4-吡喃酮。所述的含曲酸的提取物可按下述方法制备：取玉米或甜高粱等秸秆发酵制取生物乙醇的残糖液(具体方法可参考文献：陶建，汤晓玉等，膜生物反应器封闭循环乙醇发酵残液的处理技术研究，四川化工，2006，6，41～44；栗伟、吕伟民、刘群，以淀粉为原料发酵生产曲酸.酿酒，2006，32，2，35～36)，在75～105℃下蒸发浓缩为原体积的1/10～1/20后，加入浓缩液体积1～3倍的乙醚或乙酸乙酯，之后5～15℃下冷却1～3h，分层后固体相即为含曲酸的提取物，其曲酸含量一般为75～90wt％(陆正清、王艳，曲酸的发酵法生产及其在食品加工中的应用，中国调味品，2008，347，1，65～67)。

所述的曲酸或含曲酸的提取物的用量较佳的为0.5～2mol曲酸/1mol黄腐植酸降解物。本发明中，所述的黄腐植酸降解物的摩尔量以下述公式计算：黄腐植酸降解物质量÷黄腐植酸降解物平均分子量；所述的黄腐植酸降解物平均分子量可用乌式粘度计或沸点升高法测定(具体方法参考文献：李善祥，腐植酸产品分析及标准，化学工业出版社，2007年9月，p110～112，p112～113)，一般测得黄腐植酸降解物平均分子量为130～420。

其中，所述的微波频率较佳的为915～2450MHz，微波的功率较佳的为200～550W。所述的反应时间较佳的为5～30min。

较佳的，反应结束后，将所得产物经活性炭吸附或过活性炭柱，以去除杂质。

由上述方法制得的黄腐植酸改性物可直接单独使用，也可与柴胡、黄芩或甘草等中药配伍使用。

本发明的改性方法中，上述各步骤的优选条件任意组合，即得到本发明的各较佳实例。

本发明还涉及由上述方法制得的黄腐植酸改性物。该黄腐植酸改性物具有显著的提高免疫力，尤其是提高HIV患者免疫力的效果。

因此，本发明进一步涉及本发明的黄腐植酸改性物在制备提高免疫力的药物或防治HIV的药物中的应用。所述的防治HIV的药物较佳的为HIV疫苗剂或HIV疫苗佐剂。根据需要，可将本发明的黄腐植酸改性物与药学可接受的各种常规辅料混合，制得各种剂型的产品，如膏剂、液体剂或粉剂。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的黄腐植酸改性物具有显著的提高免疫力等作用，尤其是提高HIV患者免疫力的效果，且毒副作用小，耐药性小，靶向性明确，且制备方法简单易行，成本低。本发明为充分利用黄腐植酸提供了新途径。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

以下实施例中，天然泥炭黄腐植酸由云南石屏县科技局提供，医用活性炭购自上海活性炭有限公司。腐植酸降解物平均分子量由沸点升高法测定(具体参考文献：李善祥，腐植酸产品分析及标准，化学工业出版社，2007年9月，p112～113)。

参考实施例

取玉米、甜高粱等秸秆发酵制取生物乙醇残糖液(陶建，汤晓玉等，膜生物反应器封闭循环乙醇发酵残液的处理技术研究，四川化工，2006，6，41～44)，在85℃下蒸发浓缩为原体积1/10ml后，加入浓缩液体积2倍的乙醚，之后放入10℃的冰箱内冷却2h，分层，固相即为曲酸提取物，曲酸含量为85wt％。

实施例1

将100g天然泥炭黄腐植酸，在含HNO₃和H₂SO₄的水溶液(100ml，总浓度25wt％，HNO₃和H₂SO₄的质量比为4：1)中，温度110℃下，150KHz的超声波下，定向降解反应120min，得到平均分子量为140的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物与参考实施例制得的曲酸提取物(含1.5mol曲酸)在微波频率2450Hz，微波功率500W下，反应30min，再经医用活性炭吸附去杂，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例2

将500g在天然泥炭黄腐植酸，于100KHz的超声波下，在含HNO₃和H₂SO₄的水溶液(250ml，总浓度50wt％，HNO₃和H₂SO₄的质量比为4：1)中，温度120℃下，经定向降解反应90min，得到平均分子量为276的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物，与参考实施例制得的曲酸提取物(含0.5mol曲酸)在微波频率2450Hz，微波功率200W下，反应30min，再经医用活性炭吸附去杂，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例3

将100g经15℃自然风干10天的天然泥炭黄腐植酸，于800KHz的超声波下，在含HNO₃和H₂SO₄的水溶液(150ml，总浓度10wt％，HNO₃和H₂SO₄的质量比为5：1)中，温度100℃下，经定向降解反应50min，得到平均分子量为420的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物，与参考实施例制得的曲酸提取物(含0.8mol曲酸)在微波频率915Hz，微波功率550W下，反应30min，再经医用活性炭吸附去杂，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例4

将100g经恒温干燥箱50℃烘干3小时的天然泥炭黄腐植酸，于460KHz的超声波下，在含HNO₃和H₂SO₄的水溶液(50ml，总浓度20wt％，HNO₃和H₂SO₄的质量比为8：1)中，温度100℃下，经定向降解反应120min，得到平均分子量为390的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物与参考实施例制得的曲酸提取物(含1mol曲酸)在微波频率2450Hz，微波功率550W下，反应20min，再经医用活性炭吸附去杂，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例5

将100g经恒温干燥箱75℃烘干1小时的天然泥炭黄腐植酸，于460KHz的超声波下，在含HNO₃和H₂SO₄的水溶液(60ml，总浓度30wt％，HNO₃和H₂SO₄的质量比为3：1)中，温度110℃下，经定向降解反应180min，得到平均分子量为139的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物与参考实施例制得的曲酸提取物(含2mol曲酸)在微波频率1500Hz，微波功率500W下，反应20min，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例6

将100g天然泥炭黄腐植酸，于460KHz的超声波下，在含HNO₃和H₂SO₄的水溶液(80ml，总浓度40wt％，HNO₃和H₂SO₄的质量比为6：1)中，温度80℃下，经定向降解反应60min，得到平均分子量为275的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物，与参考实施例制得的曲酸提取物(含1.7mol曲酸)在微波频率2450Hz，微波功率500W下，反应10min，再经过活性炭柱去杂，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例7

将100g天然泥炭黄腐植酸，于600KHz的超声波下，在含15wt％HNO₃的水溶液(100ml)中，温度70℃下，经定向降解反应150min，得到平均分子量为285的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物，与1.2mol曲酸在微波频率1500Hz，微波功率400W下，反应25min，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例8

将100g天然泥炭黄腐植酸，于520KHz的超声波下，在含醋酸和H₂O₂的水溶液(1000ml，总浓度30wt％，醋酸和H₂O₂的质量比为1.2：1)中，温度50℃下，经定向降解反应10min，得到平均分子量为310的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物与1.3mol曲酸在微波频率1500Hz，微波功率500W下，反应5min，再经医用活性炭吸附去杂，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

实施例9

将100g天然泥炭黄腐植酸，在含醋酸和H₂O₂的水溶液(500ml，总浓度30wt％，醋酸和H₂O₂的质量比为2：1)中，温度125℃下，经定向降解反应30min，得到平均分子量为130的黄腐植酸降解物。

将1mol黄腐植酸降解物与参考实施例制得的曲酸提取物(含0.8mol曲酸)在微波频率1500Hz，微波功率500W下，反应20min，再经医用活性炭吸附去杂，即制得本发明的黄腐植酸改性物。

效果实施例

取昆明小鼠30只(购自中国医药大学)，参照下述文献的方法建立试验模型：(1)李振宇，徐开林，潘秀英等，HIV-l慢病毒载体的构建及结构改造，中华血液学杂志，2004，25，9，571-572；(2)桑威，徐开林，潘秀英等，shRNA介导的RNA干扰对小鼠T淋巴细胞CD28基因的沉默效应，中华血液学杂志，2007，28，12，808～810。

将小鼠随机分成大、中、小剂量组和对照组，分别给予0.6g/kg体重、0.4g/kg体重、0.2g/kg体重的黄腐植酸改性物(实施例1)，连续灌输7天，7天后断头取血检测T淋巴细胞亚群(TLS，采用BeckmanCoulter Epics XL流式细胞仪，CD4+-FITC/CD8+-PE/CD3+-PECYS三色荧光标记抗体，测定方法参考：黄晶，早期梅毒血清固定患者淋巴细胞的检测及意义，中国皮肤性病学杂志，2008，22，9，546～547；Nicolini G，et al，Efect of trans-resveratrolon signal transduction pathways involved inpaclitaxel-induced apoptosis inhuman neuroblastoma SH.SY5 Y cells，Neurochemistry Int，2003，42，5，419)，结果如表1和2所示。

表1 对昆明小鼠LgT₁的影响

表2 对昆明小鼠L₃T₄的影响

由表1和2可见，本发明的黄腐植酸改性物具有显著的提高HIV感染小鼠免疫力的效果，且有良好的量效关系。