一种酵母蔗糖酶的化学修饰方法

摘要

本发明公开了一种酵母蔗糖酶的化学修饰方法，包括酵母蔗糖酶的活化和采用多糖类大分子作为修饰剂对活化酵母蔗糖酶进行修饰等步骤，本发明优化了酵母蔗糖酶的修饰步骤和条件，得到了酶活性提高了1.5倍以上的修饰产物，其耐酸性和耐热性同时得到提高，对部分有机溶剂和变性剂尿素的抗性有所增加，克服了现有技术对酶进行化学修饰后修饰酶存在的稳定性和催化活性不能同时得到提高的技术缺陷，具有很高的应用于推广价值。

说明书

技术领域

本发明涉及化学、生物化学和酶工程等学科的交叉技术领域，更具体地说涉及一种蔗糖酶的化学修饰方法。

背景技术

利用大分子或小分子修饰剂对酶分子的侧链进行改造，以获得具有临床和工业应用价值的酶蛋白，是目前应用最广泛的酶化学修饰技术。

当前修饰技术中被广泛应用的小分子化合物有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐等，如环糊精转糖基酶经丁二酸酐修饰后，其环化、偶合和水解的活性降低，而歧化活性却提高了30％。D-葡糖胺与未糖基化的RNase A进行化学偶联，得到单糖基化酶和双糖基化酶，其中53位的天冬氨酸和49位的谷氨酸被认为可能是糖基化位点，经过修饰的单糖基化RNase A活力比天然酶低，但是热稳定性大大提高。

大分子化合物对酶分子的化学修饰是目前国际上酶工程的研究热点之一。大分子化合物如聚乙二醇、羧甲基纤维素、右旋糖酐等对酶蛋白表面进行修饰，可以降低酶的免疫原性和增加酶的热稳定性。一般而言，化学修饰可以快速改变酶分子的酶学、理化特性及其医学性质，因而有着重要的应用研究价值。

然而在实际应用中，由于大分子化学修饰的随机性，修饰后往往会降低酶的催化活性和稳定性。也就是说现有技术对酶进行化学修饰后修饰酶存在缺陷：要么稳定性有所提高但催化活性急剧下降；要么催化活性有所提高但稳定性直线下降。因此寻找科学的方法同时提高修饰酶的活性和稳定性是大分子化合物修饰酶分子技术的重点和难点。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，针对酶蛋白经大分子化合物修饰后往往酶活性降低的缺陷，提供了一种利用大分子化合物对酵母蔗糖酶进行化学修饰的方法，合理的设计了修饰的步骤和条件，修饰产物的催化活性大幅度提高且稳定性有所增加，可以在常温常压下发挥其高效催化性能。

本发明的技术方案是提供一种酵母蔗糖酶的化学修饰方法，包括以下步骤：

(1)酵母蔗糖酶的活化；

(2)采用多糖类大分子作为修饰剂对活化酵母蔗糖酶进行修饰。

步骤(1)所述酵母蔗糖酶的活化包括以下步骤：

(a)酵母蔗糖酶溶于缓冲液中并定容，使酵母蔗糖酶浓度为5mg/mL，加入与定容后体积相等的高碘酸钠水溶液；

(b)在上述(1)体系中以酵母蔗糖酶∶底物＝1∶20～100的比例加入保护底物；

(c)将上述(2)体系置于0～70℃培养箱内反应0.5～4小时后，加入乙二醇，迅速混匀后静置2小时，对0.1mol/L缓冲液透析过夜，得到活化的蔗糖酶。

上述步骤(a)所述高碘酸钠水溶液的浓度为10～80mg/mL。

步骤(2)所述活化酵母蔗糖酶的修饰包括以下步骤：

(d)活化后的蔗糖酶中加入与活化步骤中等质量的底物进行保护；加入溶于pH8.0缓冲液中的修饰剂溶液，置于0～70℃下搅拌反应0.5～48小时；

(e)在不断搅拌的条件下往(1)中加入NaBH₄水溶液，持续搅拌4小时后，对0.1mol/L缓冲液透析过夜，得到修饰的蔗糖酶。

上述步骤(e)所述NaBH₄的用量为与酵母蔗糖酶的比例为5∶8～16，浓度为40～80mg/mL蒸馏水。

本发明所述缓冲液为醋酸缓冲液，浓度为0.1mol/L，pH范围为2.0～10.0。

所述底物为蔗糖。

步骤(d)所述修饰剂与酵母蔗糖酶的比例为5∶2～16，浓度为5～40mg修饰剂/mL缓冲液。

所述修饰剂为分子量为3000～18000的壳聚糖。

本发明的有益效果是：

(1)本发明针对天然酵母蔗糖酶催化活性低、稳定性差等问题，用一种大分子化合物对天然酶进行化学修饰后得到催化活性大大提高而稳定性也有所提高的修饰产物，修饰产物的催化活性大幅度提高且稳定性有所增加，可以在常温常压下发挥其高效催化性能等优点。

(2)本发明所采用的大分子化学修饰剂具有原料丰富，修饰条件温和，降低酵母蔗糖酶在工业应用上的生产成本，拓宽其应用，具有重要的应用价值。

(3)本发明方法简单易行，技术成熟，容易推广。

附图说明

图1修饰酶的pH-酶活性试验结果

图2天然酶和修饰酶的温度-酶活性试验结果

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。本发明采用一种大分子化合物对天然酶进行化学修饰后得到催化活性大大提高而稳定性也有所提高的修饰产物，下述实施例所给出的具体数据用以说明本发明思想，本申请人所做大量的实施例不能在实施例中一一赘述，但并不因此限定本发明的范围。实施例中所用试剂与仪器均为市购的常规产品，参照常规的实验室常规即可。

实施例1

(1)酵母蔗糖酶的活化；

(a)称取25mg酵母蔗糖酶溶于0.1mol/L pH7.0的缓冲液中并定容至5mL，加入含50mg高碘酸钠的高碘酸钠水溶液5mL；

(b)在(a)制备的体系中加入2.5g底物对酵母蔗糖酶进行保护；

(c)将(b)步制备的体系置于40℃的培养箱内反应2小时后，加入800μL乙二醇，迅速混匀后静置2小时，对2.5L 0.1mol/L pH7.0缓冲液透析过夜，得到活化的蔗糖酶。

(2)采用多糖类大分子作为修饰剂对活化酵母蔗糖酶进行修饰。

(d)经步骤(1)活化后的蔗糖酶中加入2.5g底物进行保护；加入溶于2mL pH4.0缓冲液中的10mg壳聚糖，壳聚糖的分子量为10000，置于40℃下搅拌反应24小时。

(e)将80mg NaBH₄溶于1mL蒸馏水，在不断搅拌的条件下，将(d)步骤制备的体系加入NaBH₄溶液，持续搅拌4小时后，对2.5L0.1mol/L pH7.0缓冲液透析过夜。得到化学修饰的蔗糖酶。

酶活性的定义：酶催化蔗糖水解的反应在50℃，pH5.0的条件进行时，每毫克蛋白质在1分钟内每催化蔗糖水解产生1微克还原糖定义为1个酶活性单位(U)。

实验结果：天然蔗糖酶活力为46362U/mg Pro，修饰后蔗糖酶活力为57786U/mg Pro，修饰酶的活力是天然酶的1.25倍。天然酶和修饰酶的pH-酶活性试验结果见附图1，其中曲线1为修饰酶的pH-酶活性实验结果，曲线2为天然酶的pH-酶活性实验结果。

实施例2

(1)酵母蔗糖酶的活化；

(a)称取25mg酵母蔗糖酶溶于0.1mol/L pH7.0的缓冲液中并定容至5mL，加入含100mg高碘酸钠的高碘酸钠水溶液5mL；

(b)在(a)制备的体系中加入1g底物对酵母蔗糖酶进行保护；

(c)将(b)步制备的体系置于70℃的培养箱内反应0.5小时后，加入800μL乙二醇，迅速混匀后静置2小时，对2.5L 0.1mol/LpH7.0缓冲液透析过夜，得到活化的蔗糖酶。

(2)采用多糖类大分子作为修饰剂对活化酵母蔗糖酶进行修饰。

(d)经步骤(1)活化后的蔗糖酶中加入1g底物进行保护；加入溶于2mL pH4.0缓冲液中的10mg壳聚糖，壳聚糖的分子量为18000，置于70℃下搅拌反应0.5小时。

(e)将100mg NaBH₄溶于2.5mL蒸馏水，在不断搅拌的条件下，将(d)步骤制备的体系加入NaBH₄溶液，持续搅拌4小时后，对2.5L0.1mol/L pH7.0缓冲液透析过夜。得到化学修饰的蔗糖酶。

实施例3

(1)酵母蔗糖酶的活化；

(a)称取25mg酵母蔗糖酶溶于0.1mol/L pH8.0的缓冲液中并定容至5mL，加入含400mg高碘酸钠的高碘酸钠水溶液5mL；

(b)在(a)制备的体系中加入0.5g底物对酵母蔗糖酶进行保护；

(c)将(b)步制备的上述体系置于0℃的培养箱内反应1小时后，加入800μL乙二醇，迅速混匀后静置2小时，对2.5L 0.1mol/LpH8.0缓冲液透析过夜，得到活化的蔗糖酶。

(2)采用多糖类大分子作为修饰剂对活化酵母蔗糖酶进行修饰。

(d)经步骤(1)活化后的蔗糖酶中加入5g底物进行保护；加入10mg溶于2mL pH4.0缓冲液中的壳聚糖(分子量2000)溶液，置于0℃下搅拌反应24小时。

(e)在不断搅拌的条件下加入溶于1mL蒸馏水的80mg NaBH₄，持续搅拌4小时后，对2.5L 0.1mol/L pH8.0缓冲液透析过夜，得到化学修饰的蔗糖酶。

酶活性的定义：酶催化蔗糖水解的反应在50℃，pH5.0的条件进行时，每毫克蛋白质在1分钟内每催化蔗糖水解产生1微克还原糖定义为1个酶活性单位(U)。

实验结果：天然蔗糖酶活力为46362U/mg Pro，修饰后蔗糖酶活力为49162U/mg Pro，修饰酶的活力是天然酶的1.06倍。天然酶和修饰酶的温度-酶活性试验结果见附图2，其中曲线3为修饰酶的温度-酶活性实验结果，曲线4为天然酶的温度-酶活性实验结果。