双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法。该制备方法可解决双歧杆菌培养困难、发酵剂活力低、保存期短的问题。制备方法包括：菌种活化试管培养、三角瓶一级菌种培养、种子罐二级菌种培养、发酵罐培养、菌体离心收集、添加保护剂、真空包装和冷冻贮藏。该发酵剂主要特点是：活菌含量高，保质期较长，接种用量少，可使每批发酵乳制品质量稳定，也防止了菌种的退化和污染，大大提高了发酵乳制品工业的劳动生产率和产品质量。本发明制备的冷冻浓缩发酵剂相对于真空冷冻干燥法制备的发酵剂，其方法简便，设备投资少，成本较低，容易实现。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法。

背景技术

双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。双歧杆菌的主要生理功能有：1.生物屏障和生物拮抗作用；2.增强免疫和抗肿瘤作用；3.营养作用；4.抑制内毒素的产生；5.廷缓机体衰老等。随着年龄的增长、环境污染及抗生素的使用等影响，该菌在人体肠道内的数量逐渐下降，从而造成肠道内微生态平衡破坏，导致各种疾病衰老的发生。

向肠道内补充双歧杆菌最直接的途径就是体外培养同源双歧杆菌，以活菌制剂作为食品、保健品或药品使用。双歧杆菌的数量及其活性被作为检验产品质量的重要指标，由于双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，且不耐酸，在氧气和酸度较低的条件下，生长缓慢且容易死亡，造成培养的难度大，生产的成本高，给双歧杆菌生产带来很大困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法，以解决双歧杆菌不易培养，发酵剂活力低，保存期短的问题。

本发明双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂的制备方法，包括下列步骤：

A.双歧杆菌菌种扩大培养与双歧杆菌发酵培养

双歧杆菌菌种为双歧杆菌属长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)或两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)；以上菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)，编号AS 1.2186。婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，编号AS1.2202。青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，编号AS 1.2891。短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)，编号AS 1.2213。两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidus)编号AS 1.2212。

①菌种活化试管培养

将培养基pH调至6.0～7.5，在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min后备用；

在菌种活化前，将低温保存的双歧杆菌安瓿瓶在室温下放置2h～3h，然后在无菌室将安瓿瓶用75％浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2ml～0.3ml的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按2％～5％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得3代液体培养物；

②三角瓶一级菌种培养

取试管培养3代液体培养物，按2％～5％(体积百分比)的接种量，接入三角瓶进行一级菌种液体培养，在厌氧条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；

③种子罐二级菌种培养

取三角瓶一级菌种液体培养物，按2％～5％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种液体培养，在普通条件下30℃～42℃培养20h～48h后，终止培养；

④发酵罐培养

将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按2％～5％(体积百分比)的接种量，接入发酵罐，在30℃～42℃培养，当发酵液pH低于5.5时，用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0～6.5之间，培养20h～48h后停止培养；

B.菌体离心收集

设置离心机温度0℃～8℃，离心转速3000r/min～9000r/min、离心时间10min～30min，离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用；

C.添加保护剂

将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/10～1/2的保护剂中；保护剂的添加量优选1/3～1/5。

D.真空包装

用灭菌过的复合铝薄袋，盛装添加保护剂后的离心收集菌体，真空度≤0Mpa后，封口；

E.冷冻贮藏：测定添加保护剂后的离心收集菌体共晶点，以低于共晶点温度5℃～30℃的条件冷冻贮藏双歧杆菌发酵剂，最终得到双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂。

本发明配方1培养基组成和重量配比为：蛋白胨3～15份、牛肉膏1～10份、胰蛋白胨3～10份、酵母浸出粉1～10份、葡萄糖3～15份、K₂HPO₄ 0.5～5份、乙酸钠0.5～5份、柠檬酸氢二铵0.5～5份、ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.5份，MgSO₄·7H₂O 0.05～0.2份、L-半胱氨酸盐酸盐0.1～1份、低聚果糖0.5～5份、CaCO₃ 0.5～2份、吐温-80 1～5份和水1000份。

本发明配方2培养基组成和重量配比为：蛋白胨3～15份、牛肉膏1～10份、酪蛋白胨3～10份、酵母浸出粉1～10份、乳糖3～15份、K₂HPO₄ 0.5～5份、乙酸钠0.5～5份、柠檬酸氢二铵0.5～5份、ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.5份，MgSO₄·7H₂O 0.05～0.2份、L-半胱氨酸盐酸盐0.1～1份、低聚果糖0.5～5份、CaCO₃ 0.5～2份、吐温-80 1～5份和水1000份。

保护剂配方1组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份和水100份；保护剂在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min。

保护剂配方2组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份、蔗糖3～10份和水100份，保护剂在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min。

保护剂配方3组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份、L-半胱氨酸盐酸盐或抗坏血酸0.1～1份和水100份，保护剂中脱脂牛奶或脱脂奶粉和甘油及水在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min，保护剂中L-半胱氨酸盐酸盐和抗坏血酸采用过滤除菌。

保护剂配方4保护剂组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5～30份、甘油0.5～5份、L-半胱氨酸盐酸盐或抗坏血酸0.1～1份、蔗糖3～10份和水100份；保护剂中脱脂牛奶或脱脂奶粉、甘油和蔗糖及水在0.05Mpa～0.14Mpa湿热灭菌15min～30min，保护剂中L-半胱氨酸盐酸盐和抗坏血酸采用过滤除菌。

本发明保护由双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂的制备方法制备的发酵剂。

本发明制备的发酵剂是一种在冷冻条件下呈固态状的高浓度双歧杆菌发酵剂，主要特点是：活菌含量高，保质期较长，接种用量少，可使每批发酵产品质量稳定，也防止了菌种的退化和污染，大大提高了发酵乳制品工业的劳动生产率和产品质量。

表1显示了不同配方的保护剂对双歧杆菌冷冻后的保护作用结果。

表1保护剂对双歧杆菌冷冻存活率的影响

结果表明：4种保护剂配方对双歧杆菌冷冻贮藏均有较好的保护作用，其中保护剂配方2优于保护剂配方1，保护剂配方3优于保护剂配方2，保护剂配方4优于保护剂配方3。

本发明制备的发酵剂活菌数达到1×10¹⁰cfu/g～9.9×10¹²cfu/g，-55℃～-18℃贮藏3个月后存活率可保持在50％以上，6个月后存活率可保持在10％以上。

本发明双歧杆菌活菌保持数高，在应用中可充分发挥发酵剂作用和益生作用。在普通条件下使用，发酵活性高，使用方便。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：

培养基组成为蛋白胨15g，牛肉膏10g，胰蛋白胨3g，酵母浸出粉1g，葡萄糖15g，K₂HPO₄ 5g，乙酸钠0.5g，柠檬酸氢二铵0.5g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，低聚果糖0.5g，CaCO₃ 0.5g，吐温-80 5g和水1000g。将培养基pH调至7.5，0.05Mpa湿热灭菌30min后备用。

在菌种活化前，将4℃保存的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)安瓿瓶在室温下放置2h，然后在无菌室将安瓿瓶用75％浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2ml的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物按5％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下37.5℃培养36h后，终止培养。以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得3代液体培养物。

将第3代培养物按5％(体积百分比)的接种量接入三角瓶进行一级菌种培养，在厌氧条件下37.5℃培养24h后，终止培养。

取三角瓶一级菌种液体培养物，按5％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种培养，在非厌氧条件下37.5℃培养24 h后，终止培养。

发酵罐培养：将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按5％(体积百分比)的接种量，接入发酵罐，在非厌氧条件下37.5℃条件下培养，当发酵液pH低于5.5时，用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0～6.5之间，培养24h后停止培养。

设置离心温度4℃，离心转速6000r/min，离心时间15min。离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用。

添加保护剂：以保护剂配方4作为保护剂保护菌体，脱脂奶粉15g、甘油2g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、蔗糖10g和水100g。将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/3的保护剂中；

进行共晶点测定，共晶点为-20℃，真空包装，对双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂采取-25℃的冷冻贮藏。双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂贮藏3个月后，存活率64％，贮藏6个月后，存活率为15％。

实施例2：

培养基组成为蛋白胨15g，牛肉膏10g，酪蛋白胨3g，酵母浸出粉1g，乳糖15g，吐温-80 5g，K₂HPO₄ 5g，乙酸钠0.5g，柠檬酸氢二铵0.5g，ZnSO₄·7H₂O 0.1g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，低聚果糖0.5g，CaCO₃ 0.5g和水1000g。将培养基pH调至6.0，0.14Mpa湿热灭菌15min后备用。

在菌种活化前，将4℃保存的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)安瓿瓶在室温下放置3h，然后在无菌室将安瓿瓶用75％浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.3ml的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按3％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下42℃培养24h后，终止培养。以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得3代液体培养物。

将第3代培养物按3％(体积百分比)的接种量接入三角瓶进行一级菌种培养，在厌氧条件下42℃培养20h后，终止培养。

取三角瓶一级菌种液体培养物，按3％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种培养，在非厌氧条件下42℃培养20h后，终止培养。

发酵罐培养：将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按3％(体积百分比)的接种量，接入发酵罐，在非厌氧条件下42℃条件下培养，当发酵液pH低于5.5时用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0～6.5之间，培养20h后停止培养。

设置离心温度8℃，离心转速3000r/min，离心时间30min。

添加保护剂：以保护剂配方3作为保护剂保护菌体，脱脂牛奶20.0g、甘油1.0g、抗坏血酸1g、和水100g，将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/5的保护剂中，进行共晶点测定，共晶点为-23℃，-30℃的条件下冷冻贮藏双歧杆菌发酵剂。

实施例3：

培养基组成为蛋白胨5g，牛肉膏5g，酪蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，乳糖10g，吐温-80 1g，K₂HPO₄ 2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵0.2g，ZnSO₄·7H₂O0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，低聚果糖2.5g，CaCO₃ 1g，和水1000g。将培养基pH调至7.0，0.1Mpa湿热灭菌25min后备用。

在菌种活化前，将4℃保存的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)安瓿瓶在室温下放置2.5h，然后在无菌室将安瓿瓶用75％浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.3ml的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按2％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下30℃培养48h后，终止培养。以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得3代液体培养物。

将第3代培养物按2％(体积百分比)的接种量接入三角瓶进行一级菌种培养，在厌氧条件下30℃培养48h后，终止培养。

取三角瓶一级菌种液体培养物，按2％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种培养，在非厌氧条件下30℃培养48h后，终止培养。

发酵罐培养：将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按2％(体积百分比)的接种量，接入发酵罐，在非厌氧条件下30℃条件下培养，当发酵液pH低于5.5时用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0～6.5之间，培养48h后停止培养。

设置离心温度0℃，离心转速9000r/min，离心时间10min。

添加保护剂：以保护剂配方2作为保护剂保护菌体，脱脂牛奶25g、甘油1g、蔗糖10g、和水100g，将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/10的保护剂中，-18℃的条件下冷冻贮藏双歧杆菌发酵剂。

实施例4：重复实施例1，有以下不同点：培养基组成为蛋白胨3g，牛肉膏1g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，葡萄糖3g，吐温-80 1g，K₂HPO₄ 0.5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵5g，ZnSO₄·7H₂O 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，L-半胱氨酸盐酸盐1g，低聚果糖5g，CaCO₃ 2g，和水1000g。将培养基pH调至6.5，0.1Mpa湿热灭菌灭菌20min后备用。

双歧杆菌菌种为短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)，设置离心温度3℃，离心转速5000r/min、离心时间20min。以保护剂配方1作为保护剂保护菌体，脱脂奶粉20g、甘油5g、和水100g；作为保护剂保护菌体，将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/2的保护剂中，-55℃的条件冷冻贮藏双歧杆菌发酵剂。

实施例5：重复实施例2，有以下不同点：培养基组成为蛋白胨3g，牛肉膏1g，酪蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，乳糖3g，K₂HPO₄ 0.5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵5g，ZnSO₄·7H₂O 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，L-半胱氨酸盐酸盐1g，低聚果糖5g，CaCO₃ 2g，吐温-80 1g，和水1000g。将培养基pH调至6.0，0.14Mpa湿热灭菌15min后备用。

双歧杆菌菌种为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)以保护剂配方4作为保护剂保护菌体，脱脂奶粉30g、甘油0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1g、蔗糖3g、和水100g作为保护剂保护菌体。

实施例6：重复实施例1，有以下不同点：培养基组成为蛋白胨5g，牛肉膏5g，胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，葡萄糖10g，吐温-80 1g，K₂HPO₄ 2g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵0.2g，ZnSO₄·7H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，低聚果糖2.5g，CaCO₃ 1g，和水1000g。将培养基pH调至7.0，0.1Mpa湿热灭菌25min后备用

以保护剂配方4作为保护剂保护菌体，即脱脂奶粉5g、甘油5g、L-半胱氨酸盐酸盐1g、蔗糖10g和水100g。

实施例7：重复实施例1，有以下不同点：以保护剂配方3作为保护剂保护菌体，即脱脂奶粉30g、甘油0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.1g和水100g。

实施例8：重复实施例1，有以下不同点：以保护剂配方3作为保护剂保护菌体，即脱脂奶粉5g、甘油5g、L-半胱氨酸盐酸盐1g和水100g。

实施例9：重复实施例1，有以下不同点：以保护剂配方2作为保护剂保护菌体，即脱脂牛奶30g、甘油0.5g、蔗糖3g、和水100g。

实施例10：重复实施例1，有以下不同点：以保护剂配方2作为保护剂保护菌体，即脱脂牛奶5g、甘油5g、蔗糖10g、和水100g。

实施例11：重复实施例1，有以下不同点：以保护剂配方1作为保护剂保护菌体，即脱脂牛奶30g、甘油0.5g、和水100g。

实施例12：重复实施例1，有以下不同点：以保护剂配方1作为保护剂保护菌体，即脱脂奶粉5g、甘油5g、和水100g。

表2显示了按实施例1制备的双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂在不同贮藏期存活率结果。

表2双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂的贮存稳定性