具有抗炎免疫作用的轮叶党参总皂苷及其制备方法

摘要

本发明属于医药技术领域，提供了中药轮叶党参总皂苷的制备方法，主要是通过70％乙醇回流提取，大孔吸附树脂吸附，用水洗去杂质，用醇液洗脱，洗脱液再经正丁醇萃取而得到。该总皂苷主要含有codonolaside，codonolaside I，codonolaside II，codonolaside III，codonolaside IV，eclalbasaponin XIII，以及echinocystic acid 3－O－β－D－glucurono－pyranoside等7个三萜皂苷类活性成分。实验结果显示，其抗炎和免疫调节效果显著。该总皂苷作用物质基础和作用机理明确，制备工艺简单，适合工业化生产，可作为制备治疗类风湿性关节炎、慢性支气管炎、系统性红斑狼疮等炎症免疫性疾病的药物原料，按常规工艺制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或复方制剂等临床上可接受的剂型。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，涉及轮叶党参总皂苷及其制备方法，还涉及轮叶党参总皂苷治疗炎症免疫性疾病的医药用途。

背景技术

炎症免疫性疾病，如类风湿性关节炎、慢性支气管炎、系统性红斑狼疮等，为临床上常见的慢性病，以反复发作的慢性过程为特征，其发病原因不仅是病原体直接感染的结果，还涉及到机体免疫功能紊乱等多种机制。目前，对类风湿性关节炎的治疗主要着眼于抗炎、镇痛；对慢性支气管炎的治疗主要着眼于抗炎、抗菌、镇咳、平喘作用的研究，至今尚无令人十分满意的药物。炎症免疫性疾病发病的一个最重要原因为机体的免疫功能紊乱，患者反复应用广谱抗生素、激素等药物，造成菌群失调及抗药性，使机体免疫功能更加低下。

基于中医药治疗慢性病的丰富临床实践及其调整人体动态平衡的用药特点，国内外学者对单味中药和复方进行了广泛研究。例如，发现了雷公藤多苷，白芍总苷，商陆皂苷A，黄芪皂苷、枇杷叶总三萜酸的抗炎和免疫调节作用。中药活性成分具有独特作用机制，能够调节患者的免疫功能，减缓或阻止其病程发展，使其成为非常有前途的炎症免疫性疾病的治疗药物。

轮叶党参(Codonopsis lanceolata，别名：山海螺、羊乳、四叶参)是桔梗科多年生缠绕性草本植物，具有补虚润肺、通乳排脓、解毒消肿、强身壮力等功效，在东北地区资源丰富，而且作为无毒副作用、无污染、风味较佳的天然山野菜，出口韩国和日本。中国专利申请号02109559.0和200510136742.8分别公开了名称为“降血脂保健饮料及其制备方法”和“轮叶党参保健饮料”的发明专利，但未见其它方面的专利申请。近来，我们在前期对清肺汤(治疗老年慢性支气管炎经验方，轮叶党参为处方的主药)的抗炎免疫作用的研究基础上，发现轮叶党参醇提物显示较强活性。对上述醇提物进行提取分离，并选用二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型对几个部位及给药剂量进行正交设计，筛选出抗炎活性部位为轮叶党参总皂苷(CLS)。进一步对CLS进行系统的化学研究，分离得到了多个三萜皂苷化合物，其中，codonolaside，codonolaside I，codonolaside II，codonolaside III，codonolaside IV等5个三萜皂苷化合物为发明人所阐明的的新化合物(Pharmazie，2007，62(6)：463-467；Chin.Chem.Lett.，2006，17(12)：1460-1463)。经初步的动物实验，发现这些三萜皂苷化合物显示了很强的抗炎和免疫调节作用。上述化学和药理研究为其临床应用提供了科学依据。目前，尚未见有关轮叶党参总皂苷在治疗炎症免疫性疾病药物中应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供中药轮叶党参中含有三萜皂苷类活性成分的提取物的制备方法，并明确提出了其治疗类风湿性关节炎、慢性支气管炎、系统性红斑狼疮等炎症免疫性疾病的医药用途，而且提供了一种科学稳定的，适用于工业化生产的制备轮叶党参总皂苷的方法。

轮叶党参总皂苷的制备方法是轮叶党参粉碎后，经70％乙醇回流提取，大孔吸附树脂吸附，用水洗去杂质，用醇液洗脱，洗脱液经正丁醇萃取而得到。其特征包括如下3步骤：

A、70％乙醇提取：轮叶党参粗粉，加6-9倍量的70％乙醇浸泡，加热回流提取，每次1-3小时，提取2-4次，合并各次提取液，减压回收溶剂至溶液所含生药的浓度为30-40g/ml。

B、大孔树脂吸附：A步水提浓缩液经大孔吸附树脂吸附，用稀醇(0-20％)洗去杂质，再用70-75％醇液洗脱，收集醇洗脱液，减压回收溶剂，得到总皂苷粗品。

C、除杂与脱色：B步所得总皂苷粗品，混悬于水溶液中，经正丁醇萃取，减压回收溶剂，得到该总皂苷。

进一步，该提取物经反复的Sephadex LH-20柱色谱及反相ODS柱色谱，水-甲醇混合溶剂梯度洗脱，得到多个三萜皂苷类化合物，经理化方法和核磁共振谱学分析，确定了它们的结构，结构通式为：

式中R¹是氢或糖基(含1～2个糖基)，R²是糖基(含3～4个糖基)，以上所指糖基是指吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖醛酸基、吡喃木糖基、吡喃阿拉伯糖基、吡喃鼠李糖基，糖链可为直链或支链，连接方式可为(1-2)、(1-3)、或(1-4)连接。主要三萜皂苷为codonolaside，codonolaside I，codonolaside II，codonolaside III，codonolaside IV，eclalbasapo-nin XIII，以及echinocystic acid 3-O-β-D-glucuronopyranoside等成分。其中，codonolaside，codonolaside I，codonolaside II，codonolasideIII，codonolaside IV为发明人所阐明的新化合物。上述化合物的分离及结构鉴定阐明了轮叶党参总皂苷的物质基础。

发明人分别采用大鼠足肿胀法、小鼠耳肿胀法、碳粒廓清法，考察了轮叶党参总皂苷的抗炎和免疫调节作用。实验结果表明，轮叶党参总皂苷的抗炎作用与阿司匹林相似，且具有显著的免疫调节作用。

综上所述，本发明提取物具有作用物质基础和作用机理明确，制备工艺简单，适合工业化生产的特点，可作为治疗类风湿性关节炎、慢性支气管炎、系统性红斑狼疮等炎症免疫性疾病的原料，可按常规工艺制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或复方制剂等临床上可接受的剂型。

照。2h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下双耳，用7mm直径打孔器冲下两耳同部位圆片，分析天平称重。

左右耳片重量之差为鼠耳肿胀度。取肿胀度平均值计算抑制率，抑制率计算：

抑制率I(％)＝(E₀-E_t)/E₀×100％

其中E₀和E_t分别代表阴性对照组和给药组的平均耳肿胀度。

(3)实验结果

轮叶党参总皂苷(按小鼠体重30，20mg/kg给药)，阿司匹林对照组(30mg/kg^-1，i.g.)，以及吲哚美辛对照组(10mg/kg^-1，i.g.)的耳肿胀抑制率分别为37.6％，28.2％，35.7％和44.8％，显示出与阳性药阿司匹林相似的抗炎作用。结果见表1。

表1轮叶党参总皂苷对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀的抑制作用[X±S.E.M.(n＝10)]

*与模型组比较p＜0.01

实施例4轮叶党参总皂苷对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀的抑制作用

(1)试验材料

动物：雄性Wister大鼠(160-180g)，给药前禁食24小时，自由饮水。

试剂：生理盐水，角叉菜胶，0.5％CMCNa，阿司匹林(aspirin)(沈阳万融药业有限公司，产品批号：061205)。

材料与仪器：1ml小鼠灌胃器，1ml注射器，手术剪，镊子，千分尺，容量瓶，TG328A(S)型分析天平(上海精科仪器厂)。

(2)实验方法

动物随机分成4组，每组9只：对照组(1％CMCNa，10mL kg^-1，p.o.)，阿司匹林对照组(100mg/kg^-1，p.o.)，药物组(100，200mg/kg，p.o.)。给药1h后于大鼠右后足趾皮下注射新配制的0.1％(w/v)角叉菜胶溶液1mL。之后每隔1h，连续6h，分别用千分尺测量炎足厚度，致炎前后足趾厚度之差为鼠足肿胀度，并按下式计算足肿胀抑制率：

Inhibition(％)＝(D₀-D_t)/D₀×100％

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步说明本发明，实施例仅用于说明，不能限制本发明的范围。

实施例1

取轮叶党参粗粉5kg，加35L 70％乙醇浸泡，加热回流提取3次，提取时间分别为2、2、1小时，合并醇提取液，滤过，60℃减压浓缩至至溶液所含生药的浓度为30g/ml，滤过；滤液经大孔吸附树脂吸附，树脂用量10kg，分别用水和20％乙醇洗去杂质，再用75％乙醇液洗脱，收集醇洗脱液，减压回收溶剂，所得粗品混悬于水溶液中，再用正丁醇萃取，减压回收溶剂，得到该总皂苷281g。

结构通式为：

实施例2

取北沙参粗粉5kg，加35L 70％乙醇浸泡，加热回流提取3次，提取时间分别为2、2、1小时，合并提取液，滤过，滤过，60℃减压浓缩至至溶液所含生药的浓度为40g/ml，滤过；滤液经大孔吸附树脂吸附，树脂用量8kg，分别用水和20％乙醇洗去杂质，再用70％乙醇液洗脱，收集醇洗脱液，减压回收溶剂，所得粗品混悬于水溶液中，再用正丁醇萃取，减压回收溶剂，得到该总皂苷264g。

实施例3轮叶党参总皂苷对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀的抑制作用

(1)实验材料

动物：雄性KM小鼠(25±2g)，给药前禁食24小时，自由饮水。

试剂：生理盐水，二甲苯，0.5％CMCNa，阿司匹林(aspirin)(沈阳万融药业有限公司，产品批号：061205)，吲哚美辛(indomethacin)(山西云鹏制药有限公司，产品批号：A070801)。

材料与仪器：1ml小鼠灌胃器，1ml注射器，手术剪，镊子，打孔器，容量瓶，TG328A(S)型分析天平(上海精科仪器厂)。

(2)实验方法

小鼠随机分为5组，每组10只：阴性对照组(0.2％CMCNa，10ml/kg，i.g.)，阿司匹林对照组(30mg/kg^-1，i.g.)，吲哚美辛对照组(10mg/kg^-1，i.g.)，药物组(30，20mg/kg，i.g.)。给药后30分钟，用微量进样器吸取30μL二甲苯涂于各鼠右耳局部致炎，前后两面各15μL；左耳作正常对

D₀：对照组炎足厚度

D_t：药物组炎足厚度

(3)实验结果

轮叶党参总皂苷组(200mg/kg，p.o.)致炎后第3，4h足肿胀抑制率分别为51.8％，46.30％(P＜0.05，n＝9)，显示出一定的抗炎作用。阿司匹林对照组(100mg/kg^-1，p.o.)致炎后第3，4h足肿胀抑制率分别为78.9％，71.2％(P＜0.05，n＝9)。

实施例5轮叶党参总皂苷对环磷酰胺诱导免疫低下的小鼠单核巨噬细胞系统的作用

(1)实验材料

动物：雄性KM小鼠(25±2g)，给药前禁食24小时，自由饮水。

试剂：生理盐水，0.5％CMCNa，0.1％Na₂CO₃溶液，印度墨水(北京市西中化工厂，批号：060315)，环磷酰胺(Cy，山西普德药业有限公司，批号：20070307)。

材料与仪器：1ml小鼠灌胃器，1ml注射器，手术剪，镊子，打孔器，容量瓶，TG328A(S)型分析天平(上海精科仪器厂)，721E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

(2)实验方法

小鼠随机分为5组，每组10只：空白对照组(0.5％CMCNa，10ml/kg，i.g.)，模型组(0.5％CMCNa，10ml/kg，i.g.)，药物组(200，100mg/kg，i.g.)。连续灌胃给药7天。给药第4天，除空白对照组外，各组分别腹腔注射环磷酰胺40mg kg^-1造模，空白对照组腹腔注射等量的生理盐水。于末次给药1h后，各鼠由右眼眶注入配制好的印度墨水0.1mL 10g^-1，并于第2min、10min用毛细玻管于左眼球后静脉丛取血，置于载玻片上，用微量移液管吸取20μl，加入0.1％Na₂CO₃ 2mL中，摇匀，取完血后，以2mL质量分数为0.1％的Na₂CO₃溶液校零，置分光光度计于波长650nm处比色，测定吸光度(OD)。将小鼠颈椎脱臼处死，称体重，取肝、脾并称湿重。按下式计算廓清指数(K)和吞噬指数(α)。结果见表2。

廓清指数K＝(logOD₁-logOD₂)/(t₂-t₁)(OD₁，OD₂分别为2min，10min时的吸光度)

吞噬指数α＝K^1/3×体重/(肝重+脾重)

(2)实验结果

与空白对照组比较，高剂量给药组廓清指数(K)，吞噬指数(α)均有显著性提高，与模型组比较，低剂量给药组，高剂量给药组廓清指数(K)，吞噬指数(α)均有显著性提高。

结果表明(见表2)，轮叶党参总皂苷可提高免疫低下小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α，显著提高单核巨噬细胞吞噬能力，增强小鼠非特异性免疫功能。

表2轮叶党参总皂苷对环磷酰胺诱导免疫低下的小鼠单核巨噬细

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与空白对照组比较；^△P＜0.05，^△△P＜0.01，与模型组比较