资木瓜总皂苷制备工艺优化及对佐剂性关节炎大鼠抗炎免疫作用的影响

摘要

目的：资丘皱皮木瓜[Chaenomeles Speciosa(sweet)Nakai]，别名铁脚梨、资木瓜等，系蔷薇科木瓜属植物贴梗木瓜的果实。本实验室前期研究发现，资木瓜粗提物具有镇痛、抗炎免疫等作用。为了明确抗炎免疫的活性部位和有效成分，本文以木瓜总皂苷(Total suponins of Chaenomeles Speciosa，TSCS)提取总量为考察指标，进行提取分离的工艺优化；观察TSCS对佐剂性关节炎(AA)大鼠的抗炎作用及对大鼠外周T淋巴细胞亚群、淋巴细胞增殖，局部组织中PGE2的影响。以期探讨和评价TSCS抗风湿关节炎的生物活性及其药理学机制，为TSCS抗炎免疫和后期的深度开发提供理论依据。
　　 方法：(1)TSCS提取分离工艺的优化选用齐墩果酸为标准品，采用分光光度法，以5[％]冰乙酸一香草醛溶液和高氯酸为显色剂，于550nm处测定吸光度。以齐墩果酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准曲线，经计算得回归方程A=0.0029X+0.0255，r=0.9987，方程在30～130 μg范围内线性关系良好，以此计算TSCS的含量。以乙醇为提取溶剂，采取正交试验法考察乙醇浓度、溶媒用量、提取时间、提取次数4个因素，每个因素设置三个水平，确定最佳提取条件。采用D101大孔树脂柱，分离纯化TSCS。(2)TSCS对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用将40只雄性wistar大鼠随机分为5组：空白组；模型对照组；TSCS高、低剂量组和雷公藤多苷(Tripterygium Glycosides,TG)阳性对照组。建立完全弗氏佐剂诱导的AA模型，致炎后14天灌胃给药，连续13天，其间观察TSCS对AA大鼠右后继发性足肿胀度，左后原发性足肿胀度的影响。第28天处死动物，用MTT法测定淋巴细胞增殖活性；流式细胞术检测外周血中CD4+、CD8+的表达水平；使用HE染色观察AA大鼠右后踝关节病理形态学改变；检测AA大鼠左后足趾PGE2的含量。
　　 结果：(1)以70[％]乙醇为提取溶剂，料液比1:10，提取次数为3次，时间为 1.5 h，TSCS的提取率最高(1.7[％])。(2)与模型组比较，TSCS可明显减轻AA大鼠右后继发性和左后原发性足肿胀度(P<0.01)；同时，TSCS可降低AA大鼠外周血CD4+表达水平，但CD8+表达水平无明显变化；TSCS还可明显降低炎性足趾中PGE2的含量。HE染色发现，TSCS高剂量可有效抑制滑膜细胞增生，减少炎性细胞浸润及新生血管翳的形成。
　　 结论：(1)最佳提取条件为A2B1C2D3。D101大孔树脂具有吸附快、解吸率高，吸附容量大、洗脱率高和树脂再生容易等优点，在分离纯化皂苷类物质方面具有推广应用价值。(2)TSCS抗炎免疫主要作用机制是通过影响T细胞功能和下调炎症因子(PGE2)，同时调节紊乱的免疫系统，恢复免疫平衡，从而达到治疗RA作用。