细菌素和新的细菌菌株

摘要

新的细菌素和/或新的产乳酸菌株被用于至少减少至少一种目标细菌在动物、特别是家禽中的定植水平。

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及通过使用新的产细菌素产乳酸细菌和/或由这些菌种产生的新细菌素控制 动物、特别是家禽中的疾病。本发明还涉及新细菌素，所述新细菌素的氨基酸序列，以及 产生所述新细菌素的产乳酸细菌菌株。进一步地，本发明涉及含有所述新细菌素和/或产 生它们的产乳酸细菌的菌株的治疗组合物，以及所述治疗组合物的用途。

相关领域的描述

食用未正确处理的家禽产品已经导致人的肠疾病。早已认识到沙门氏菌(Salmonella spp.)是这类疾病的致病菌，近来认识到弯曲杆菌(Campylobacter spp.)，特别是空肠弯 曲杆菌(Campylobacter jejuni)也被牵连其中。这两种微生物可以定植于家禽的胃肠道中， 而对这些鸟类没有任何有害效果，虽然一些已被定植的鸟类可以被检测到，但无症状的带 菌者可以在生产和处理过程中自由传播这些微生物，导致进一步感染活的鸟类和尸体。家 禽在食物供应中作为沙门氏菌和弯曲杆菌的原始贮主(Jones等，Journal of Food Protection (食品保护杂志)，第54卷，No.7，502-507，1991年7月)。在养成生产期间预防在活家 禽中的定植可以消除家禽污染的问题。

许多因素促成细菌在动物消化道内的定植和继续存在。这些因素已被Savage(Progress in Food and Nutrition Science(食品和营养科学进展)，第7卷，65-74，1983)详尽地评述。 在这些因素中所包括的是：(1)胃酸度(Gilliland，Journal of Food Production(食品生产 杂志)，第42卷，164-167，1979)；(2)胆汁盐(Sharpe和Mattick，Milchwissenschaft，第 12卷，348-349，1967；Floch等，American Journal of Clinical Nutrition(美国临床营养学杂志)， 第25卷，1418-1426，1972；Lewis和Gorbach，Archives of Internal Medicine(内科学档案)，第 130卷，545-549，1972；Gilliland和Speck，Journal of Food Protection(食品保护杂志)，第 40卷，820-823，1977)；Hugdahl等，Infection and Immunity(感染和免疫)，第56卷， 1560-1566，1988)；(3)蠕动；(4)消化酶(Marmur，Journal of Molecular Biology(分 子生物学杂志)，第3卷，208-218，1961)；(5)免疫反应；和(6)本源微生物(indigenous microorganism)以及它们产生的抗菌化合物。前四种因素取决于宿主的表现型，可能不是 实际上可控的变量。胃肠(GI)道的免疫反应不易调节。涉及本源微生物及其代谢物的因 素取决于GI道的正常菌群。

控制弯曲杆菌和/或沙门氏菌的定植的一种可能的方法是通过使用竞争性排斥(CE)。 Nurmi和Rantala(Nature(自然)，第241卷，210-211，1973)证明通过将来自健康家禽肠 内物质的细菌管饲给微生物群落还没有建成的年幼的雏鸡(chick)抵抗沙门氏菌定植，有 效控制沙门氏菌的感染。给雏鸡施用不确定的CE制备物加速新孵出鸟类的消化道菌群的 成熟，并提供由成年雌禽向其后代传送微生物群落的自然过程的替代者。实验室和现场实 验的结果提供通过给雏鸡施用正常微生物群落控制弯曲杆菌的优点的证据；降低的鸟群受 弯曲杆菌感染的频率(Mulder和Bolder，IN：Colonization Control of human bacterial enteropathogens in poultry(家禽中人细菌性肠道病原体的定植控制)；L.C.Blankenship(编)， Academic Press，加利福尼亚圣地亚哥，359-363，1991)以及降低的被定植的鸟类的粪便中 空肠弯曲杆菌(C.jejuni)水平已有报道(Stern，Poultry Science(家禽科学)，第73卷，402-407， 1994)。

Schoeni和Wong(Appl.Environ.Microbiol.，第60卷，1191-1197，1994)报道了通过应 用碳水化合物添加剂和三种已被鉴定的拮抗剂(差异柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus)22， 克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)23和大肠杆菌(Escherichia coli)25)显著减 少了肉仔鸡(broiler)中空肠弯曲杆菌的定植。也有在用嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和粪链球菌(Streptococcus faecium)的家禽分离培养物治疗以后，感染肉仔 鸡的肠内样品中空肠弯曲杆菌显著减少的证据(Morishita等，Avian Diseases(禽类疾病)， 第41卷，850-855，1997)。

Snoeyenbos等(美国专利No.4,335,107，1982年6月)通过冻干粪便并厌氧培养这 种制备物开发了预防沙门氏菌定植的竞争性排斥(CE)微生物群落技术。Mikola等(美 国专利No.4,657,762，1987年4月)用肠道粪便和盲肠内容物作为CE微生物群落源用于 预防沙门氏菌定植。Stern等(美国专利No.5,451,400，1995年9月和美国专利6,241,335， 2001年4月)公开一种粘膜CE组合物以保护家禽和家畜抵抗沙门氏菌和弯曲杆菌的定植， 其中预先洗涤的盲肠的粘蛋白层被刮下，被刮下的刮屑保持在无氧环境中，进行厌氧培养。 Nisbet等(美国专利No.5,478,557，1996年12月)公开了一种确定的益生菌(probiotic)， 其可以得自各种家养动物，其是通过连续培养直接来自成年目标动物的粪便，盲肠和/或 大肠内容物的分批培养物获得的。

微生物产生多种证明有抗细菌性质的化合物。一类这样的化合物，细菌素，由杀菌蛋 白组成，其作用机制类似于离子载体抗生素。细菌素通常具有抵抗与其产生者密切相关的 菌种的活性。它们在由复杂微生物种群，例如肠道，口腔或其他上皮表面分离出的细菌菌 种中的广泛存在表明细菌素可能在细菌生态系统的种群动态方面具有调节作用。细菌素被 定义为由细菌产生的具有生物活性蛋白部分和杀菌作用的化合物(Tagg等，Bacteriological Reviews(细菌学评论)，第40卷，722-256，1976)。其他特性包括：(1)窄谱抑制活性， 集中于密切相关的菌种；(2)与特定的细胞受体结合；以及(3)质粒携带细菌素产生和 宿主细胞细菌素免疫性的遗传决定簇。不完全确定的拮抗性物质被称为“细菌素样物质”。 一些有效对抗革兰氏阳性细菌、相反不对抗革兰氏阴性细菌的细菌素，具有较广谱的活性。 已有建议术语细菌素，当用于描述由革兰氏阳性细菌产生的抑制剂时，应满足(1)是一 种肽和(2)具有杀菌活性的最低标准(Tagg等，同上)。

乳酸细菌是最重要的益生菌微生物之一。它们是革兰氏阳性的，不产生孢子的，过氧 化氢酶阴性的缺乏细胞色素的生物。它们是厌氧但耐氧的、有复杂营养要求的、耐酸的以 及严格可发酵的，并以乳酸作为糖发酵的主要终产物。乳酸产生细菌包括乳酸杆菌 (Lactobacillus)菌种，双歧杆菌(Bifidobacterium)菌种，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)， 屎肠球菌(Enterococcus faecium)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，嗜酸芽孢乳酸菌 (Sporolactobacillus inulinus)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等。这些菌种在 其中广泛存在细菌素方面是受到特别关注的，也广泛应用于发酵奶、食品和肉加工工业中。 它们在食品的保存和风味特征中的作用已有详尽记载。大部分由这些菌种产生的细菌素仅 仅具有抵抗其他乳酸细菌的活性，但有几种显示出对较大种系差异的革兰氏阳性细菌以 及，在特定条件下，对革兰氏阴性细菌的抗菌活性。

乳酸杆菌已被广泛研究其拮抗剂的产生。其中包括充分定性的细菌素(DeKlerk，1967； Upreti和Hinsdill 1975；Barefoot和Klaenhammer 1983；Joerger和Klaenhammer 1986)；可 能的细菌素样物质(Vincent et al.，1959)，和其他与细菌素不必然相关的拮抗剂(Vakil 和Shahni 1965；Hamdan和Mikolajcik 1974；Mikolajcik和Hamdan 1975；以及Shahni等， 1976)。

Klaenhammer(1993)将当时所知的乳酸细菌细菌素分为四个主要类别：

第I类——羊毛硫抗生素(Lantibiotics)，其是＜5kDa的小肽，含有不常见的氨基酸 羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸。它们受到特别关注是因为它们具有相对于其他细菌素而 言非常广谱的活性。实例包括Nisin，Nisin Z，carnocin U 149，lacticin 481，和lactocin 5。

第II类——小的不含羊毛硫氨酸的肽：一类非均质的＜10kDa的小肽。这一类包括具 有抵抗李斯特氏菌(Listeria spp.)的活性的肽。

第III类——大的热不稳定的＞30kDa的蛋白质。实例是Helveticin。

第IV类——含有额外部分例如脂类和碳水化合物的复杂细菌素-蛋白质。

本发明提供含有至少一种产乳酸细菌菌株的新菌株和/或由至少一种新菌株产生的新 细菌素的新的组合物；使用所述菌株或细菌素的方法，所述新菌株，所述新细菌素的氨基 酸序列，以及使用方法，其均与相关技术中的菌株、细菌素和使用方法不同。

发明简述

因此，本发明的一个目的是提供产生新细菌素的乳酸杆菌和肠球菌的新菌株。

本发明的另一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30514的新唾液乳酸杆菌 (Lactobacillus salivarius)菌株PVD32。

本发明的又一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30510的新嗜酸乳酸杆菌 (Lactobacillus acidophilus)LWP320。

本发明的又一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30645的新粪肠球菌(Enterococcus faecalis)LWP21。

本发明的又一个目的是提供鉴定特征为NRRL B-30511的新坚韧肠球菌(Enterococcus durans)菌株LWP26。

本发明的另一个目的是提供由乳酸杆菌和肠球菌的新菌株产生的新细菌素。

本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的新细菌素OR7。

本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的新细菌素 LWP320。

本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的新细菌素LWP21。

本发明的又一个目的是提供具有如SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的新细菌素LWP26。

本发明的另一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包含至少一种产新细菌素的乳酸杆菌或肠球菌的新菌株，至少一种 由乳酸杆菌或肠球菌的新菌株产生的新细菌素，或者所述新菌株和/或新细菌素的组合的 治疗组合物。

本发明的另一个目的是提供至少减低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包含特征为NRRL保藏号B-30514和B-30510的乳酸杆菌；鉴别特 征为NRRL B-30511和NRRL B-30645的肠球菌；和其混合物的新菌株的治疗组合物。

本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包含至少一种鉴别特征为NRRL B-30510，NRRL B-30511，NRRL 30514，NRRL B-30645，和其混合物的新菌株；至少一种具有如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4所示氨基酸序列，和其混合物的细菌素；或新菌株和新细 菌素的组合的治疗组合物。

本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合 物。

本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合 物。

本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合 物。

本发明的又一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包含具有如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的新细菌素的治疗组合 物。

本发明的另一个目的是提供至少降低至少一种目标细菌在动物中定植水平的方法，其 是通过给所述动物施用包括具有鉴别特征为NRRL B-30510或NRRL B-30514的乳酸杆菌 细菌新菌株；具有鉴别特征为NRRL B-30511或NRRL B-30645的肠球菌新菌株，和其混 合物产生的细菌素的治疗组合物。

本发明的其他目的和优点根据下述说明将变得明显。

微生物的保藏

唾液乳酸杆菌，标明为NRRL B-30514(菌株PVD32)，嗜酸乳酸杆菌标明为NRRL B-30510(菌株LWP320)；坚韧肠球菌标明为NRRL B-30511(菌株LWP26)于2001年 8月3日保藏，粪肠球菌标明为NRRL B-30645(菌株LWP21)于2003年4月1日保藏。 所有上述菌株已按照布达佩斯条约的规定保藏于美国农业部农业研究服务中心专利培养 物保藏中心(国家农业应用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research)， 1815N.University Street，Peoria，Illinois 61604)。

附图简述

图1是SDS-PAGE后对OR7直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖以确定哪个 条带具有抗菌活性以及具有活性的条带的分子量。第1道——6,500-97,000的MMW分子 量标记(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)：97,000，66,000，43,000，30,000，21,000， 14,400和6,500Da。第2道的条带——纯化的lactocin OR7，第3道的条带——被空肠弯曲 杆菌吸收后的CAP lactocin OR7，具有抗菌活性，生长抑制的区域(见箭头)，质量为大 约6,000Da，第4道的条带——CAP lactocin OR7。其他条带没有显示出抗菌活性。

图2是SDS-PAGE后对细菌素LWP320和LWP26直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲 杆菌覆盖以确定哪个条带具有抗菌活性以及具有活性的条带的分子量。第3 道——3,000-43,000的LMW分子量标记(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)：3,000， 11,400，18,000，21,000和43,000Da。第1道的条带——细菌素LWP320，第2道的条带—— 细菌素LWP26，具有抗菌活性，生长抑制的区域，质量分别为大约6,000和大约3,000Da。 其他条带没有显示出抗菌活性。

图3是SDS-PAGE后对肠球菌素LWP21直接检测的照片。凝胶用空肠弯曲杆菌覆盖 以确定哪个条带具有抗菌活性以及活性条带的分子量。第4道——1060-43,000的LMW分 子量标记(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)：1,060，2,500，3,500，14,400，20,000， 30,000和43,000Da。第1道的条带(SP-琼脂糖凝胶后的肠球菌素LWP21)，和第2道的 条带(苯基-琼脂糖凝胶CL-4B后的第2峰)具有抗菌活性，生长抑制的区域(见箭头)， 质量为大约6,000Da。第3道的条带(phenyl-Sepharose CL-4B后的峰)，具有大约3,000Da 的质量。其他条带没有显示出抗菌活性。

发明详述

肠感染在人中的重要性已经被日益充分地认识到，家禽污染和人感染之间的关系也有 详尽记载。通过干预家禽加工厂消除这种健康危险的能力也是众所周知的。在肉仔鸡生产 和加工过程中，含有病原体的粪便物转移到肉上，并继续存在于加工食品的厨房中。

竞争性生物的代谢物可能有助于控制病原体例如空肠弯曲杆菌和沙门氏菌。本发明的 新拮抗菌种从肉仔鸡的盲肠和嗉囊粘膜表面分离而来。表征的拮抗物的天然组分是低分子 量的肽，细菌素，其具有广谱的拮抗活性。

本发明提供了新乳酸杆菌和肠球菌菌株，新细菌素，所述细菌素的氨基酸序列，含有 所述新细菌素和/或产生它们的菌株的治疗组合物，以及使用所述新治疗组合物的方法。

嗜酸乳酸杆菌LWP320分离菌是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，过氧化氢酶阴性的， 革兰氏阳性的非运动性的多形态的棒状细菌，其在MRS琼脂上在大约37℃延迟生长。当 在MRS琼脂上生长时，该分离菌在大约24小时的微需氧培育后产生直径为大约0.5mm 至大约0.8mm的发白色的、半透明的菌落。在MRS肉汤中，菌株LWP320只在培养管底 部生长。

唾液乳酸杆菌PVD32菌株是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，革兰氏阳性的，过氧化 氢酶阴性的，非运动性的，多形态的棒状杆菌。菌落在大约37℃微需氧培育大约18-24小 时后产生直径为大约1mm至大约3mm的圆形至规则形状的、光滑的、凸面的具有清晰边 缘的菌落。该菌株产生乳酸和H₂O₂。

粪肠球菌LWP21菌种是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，革兰氏阳性球菌，过氧化氢 酶阴性。在MRS琼脂上在37℃生长延迟。当在MRS琼脂上培养时、该菌株在大约37℃ 在大约24小时的微需氧培育后产生直径为大约0.2mm的发白色的，半透明的菌落。在大 约37℃在大约48小时的微需氧培育后，菌落的直径为大约1mm至大约1.2mm。该菌株 在MRS肉汤中仅生长在培养管底部大约2/3体积中。

坚韧肠球菌LWP26菌种是兼性厌氧菌(微需氧性细菌)，革兰氏阳性球菌，过氧化 氢酶阴性的，在大约37℃在MRS琼脂上延迟生长。当在MRS琼脂上生长时，该菌株产 生发白色的、半透明的菌落，并在大约37℃微需氧培育大约24小时后变透明。在大约37℃ 微需氧培育大约48小时后，菌落大小平均为大约0.8mm至大约1.0mm。在MRS肉汤中， 该菌株生长在管中的全部体积。

对分离的乳酸杆菌和肠球菌菌种产生细菌素活性的筛选通过在营养琼脂上用感兴趣 的不同目标细菌接种的培养物进行。其他检测菌株在有氧条件下在大约37℃培养大约 14-24小时。小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶氏菌(Y. pseudotuberculosis)在大约28℃在有氧条件下培养大约14-24小时。抵抗空肠弯曲杆菌的 活性的检测在用空肠弯曲杆菌接种的含有大约5％裂解血液的弯曲杆菌琼脂上进行。血的 使用是本领域普通技术人员熟知的，包括例如羊，马等。抵抗空肠弯曲杆菌的活性的检测 在大约5％O₂，大约10％CO₂，和大约85％N₂的微量需氧条件下在大约42℃进行大约24-48 小时。将大约0.2ml生理盐水中悬浮的拮抗细菌平板接种于乳酸杆菌琼脂上，培育大约24 小时。大约0.5cm³的琼脂块被切下并转移到添加有裂解血、大约10mg/ml利福平、大约 2.4U/ml多粘菌素，并接种了大约10⁷个空肠弯曲杆菌细胞的布鲁氏菌或弯曲杆菌琼脂上。 平板在微量需氧条件下在大约42℃培育大约24-48小时。活性通过测量生长抑制的区域来 评价。

发现有拮抗性的乳酸杆菌分离菌被评价其细菌素的产生。粗制的抗菌制备物(CAP) 通过仅对在需氧条件下在大约37℃在饥饿培养基(starvation medium)上生长大约18小时 的拮抗菌株的培养物进行硫酸铵沉淀来制备，所述的饥饿培养基为：

K₂HPO₄        6.0g

KH₂PO₄        0.2g

(NH₄)₂SO₄     0.2g

MgSO₄         0.1g

葡萄糖        9.0g

组氨酸        0.08g

精氨酸        0.02g

加蒸馏水至1000ml，pH值为大约7.2。

然后将培养物流体以大约12,000×g离心大约10分钟。得到的上清然后加入1N NaOH调 整pH值至大约6.2并加入大约130U/ml过氧化氢酶以除去有机酸和过氧化氢，和抑制因 子。通过组合进行硫酸铵沉淀、脱盐色谱和凝胶过滤从上清中分离拮抗肽，得到粗制的抗 菌制备物(CAP)。CAP样品通过0.22μ过滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。

发现有拮抗性的肠球菌分离菌被评价其细菌素的产生。粗制的抗菌制备物(CAP)通 过仅对在有氧条件下在大约37℃在MRS肉汤中生长大约18小时的拮抗菌株培养物进行 硫酸铵沉淀来制备，所述的MRS肉汤为：

MRS肉汤     15.0g

乳糖        0.05g

加蒸馏水至大约1000ml，pH 7.2。

然后将培养物流体以大约12,000×g离心大约10分钟。得到的上清然后加入1N NaOH调 整pH值至大约6.2并加入大约130U/ml过氧化氢酶以除去有机酸和过氧化氢，和抑制因 子。通过组合进行硫酸铵沉淀、脱盐色谱和凝胶过滤从上清中分离拮抗肽，得到粗制的抗 菌制备物(CAP)。CAP样品通过0.22μ过滤器(Millipore，Bedford，MA，USA)过滤。

所有上述肽的分子量通过SDS-PAGE电泳确定。所述肽的pI通过等电聚焦确定。氨 基酸序列通过Edman降解法使用，例如，491cLC自动测序仪(Applied Biosystems，Inc.) 确定。

为本发明的目的，术语“肽”指至少两个或更多个氨基酸或氨基酸类似物的化合物。氨 基酸或氨基酸类似物可以通过肽键相连。在另一个实施方案中，氨基酸可以通过其他键， 例如酯，醚等相连。肽可以是任何结构构型，包括线性，分支，或环状构型。本文所用的 术语“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光学异构体，和氨基酸类似物。

本发明的肽衍生物和类似物包括但不限于那些包含作为一级氨基酸序列的包括其序 列中的残基被功能等同的氨基酸残基替换从而导致保守性氨基酸替换的改变的序列的肽 的全部或部分氨基酸序列。

例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可以被另一个具有类似极性的，作为功能等同 物的氨基酸替换，导致沉默的改变。序列中氨基酸的替换可以选自该氨基酸所属类别的其 他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸， 苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。 极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天门冬酰胺，和谷氨 酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸，和组氨酸。带负电荷的(酸性) 氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这种改变不会显著影响聚丙酰胺凝胶电泳确定的分子量或 等电点。非保守性氨基酸替换也可以被引入以替换氨基酸，使之具有特别偏好的性质。例 如，Cys可以被引入到可能的位置以与另一个Cys形成二硫桥。Pro可以因其特别的平面 结构而被引入。

本发明的肽可以被化学合成。合成肽可以用熟知的固相液相技术，或肽浓缩(peptide condensation)技术，或其组合制备，可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的 氨基酸可以是标准的Boc(N^α-氨基保护的N^α-t-丁基氧羰基)氨基酸树脂，进行Merrifield 的原始固相程序的标准进行去保护、中和、耦联和洗涤步骤(J.Am.Chem.Soc，第85卷， 2149-2154，1963)，或碱敏感的N^α-氨基保护的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino 和Han，J.Org.Chem.，第37卷，3403-3409，1972)。此外，本发明的方法可以使用本领域 技术人员熟知的其他N^α-保护的基团。固相肽合成可以用本领域的普通技术(参见例如 Stewart和Young，Solid Phase Synthesis(固相合成)，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford， I11.，1984；Fields和Noble，Int.J.Pept.Protein Res.，第35卷，161-214，1990)，或用自动合 成仪实现。

根据本发明，所述肽和/或所述新细菌菌株可以置于治疗可接受的载体内局部、肠胃 外、经粘膜，例如口服，经鼻，或经直肠，或经皮肤给药。本发明的肽如果需要的话可以 进行修饰以增加所述肽穿过细胞膜的能力，例如通过增加所述肽的疏水性，使所述肽与载 体(例如特异性受体的配体)相接合等。

本发明还提供将靶分子与本发明的肽相接合。为本发明目的的靶分子指当体内给药 时，定位于所希望的一个或多个区域的分子。在本发明的各种实施方案中，靶分子可以是 肽或蛋白质、抗体、凝集素、碳水化合物或类固醇。靶分子可以是在靶细胞上的受体的肽 配体或抗体，如单克隆抗体。为了便于交联，抗体可以减少到两个重链和轻链的异质二聚 体，或者F(ab’)₂片段可以被还原，并通过还原的巯基与所述肽交联。

本发明的另一个方面是提供治疗组合物。所述治疗组合物可以用于口服、经鼻、肺部 给药、注射等。所述治疗组合物包含有效量的本发明的至少一种细菌素和它们的衍生物和 /或至少一种新菌株以至少降低至少一种目标细菌定植的水平，还包括可接受的稀释剂、 防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。稀释剂可以包括缓冲液，如，举例而言，Tris-HCl， 醋酸盐，磷酸盐；添加剂可以包括去垢剂和增溶试剂，如，举例而言，Tween 80，聚山梨 醇酯80等；抗氧化剂包括，如，举例而言，抗坏血酸，焦亚硫酸钠等；防腐剂可以包括， 例如，Thimersol，苯甲醇等；以及膨胀物质如乳糖，甘露醇等。

本发明的治疗组合物可以被合并入聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚乳酸，聚乙醇酸等的 微粒制备物中，或被合并入脂质体中。脂质体的包封包括各种聚合物的包封。各种不同的 聚合物载体都可用于贮含和/或递送上面所讨论的一种或更多种治疗试剂，包括例如生物 可降解的和不能生物降解的组合物。生物可降解组合物的代表性实例包括白蛋白，胶原， 明胶，透明质酸，淀粉，纤维素(甲基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲 基纤维素，醋酸纤维素苯二甲酸酯，醋酸纤维素琥珀酸酯，羟丙基甲基纤维素苯二甲酸酯)， 酪蛋白，右旋糖苷，多糖，纤维蛋白原，聚(D，L丙交酯)，聚(D，L-丙交酯共乙交酯)， 聚(乙交酯)，聚(羟基丁酸酯)，聚(烷基碳酸酯)和聚(原酸酯)，聚酯，聚(羟基 戊酸)，聚二噁烷酮，聚(对苯二甲酸乙二酯)，聚(苹果酸)，聚(丙醇二酸)，聚酐， 聚磷腈，聚(氨基酸)和它们的共聚物(通常参见，Ilium，L.，Davids，S.S.(编)″Polymers in Controlled Drug Delivery(受控药物释放中的聚合物)″Wright，Bristol，1987；Arshady，J. Controlled Release 17：1-22，1991；Pitt，Int.J.Phar.59：173-196，1990；Holland等，J.Controlled Release 4：155-0180，1986)。

不能降解的代表性实例包括聚(乙烯-醋酸乙烯酯)(“EVA”)共聚物，硅橡胶，丙 烯酸聚合物(聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸甲酯，聚氰基丙烯酸烷基酯)， 聚乙烯，聚丙烯，聚酰胺(尼龙6，6)，聚氨酯，聚(酯型聚氨酯)，聚(醚型聚氨酯)， 聚(酯-脲)，聚醚(聚(环氧乙烯)，聚(环氧丙烷)，Pluronics和聚(四亚甲基二醇)， 硅橡胶和乙烯基聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，聚(乙烯醇)，聚(醋酸乙烯苯二甲酸酯)。 聚合物也可以被开发出来的，或者是阴离子的(例如藻酸盐，卡拉胶，羧甲基纤维素和聚 丙烯酸)，或者是阳离子的(例如壳聚糖，聚L赖氨酸，聚氮丙啶，和聚烯丙胺)(通常 参见Dunn等，J.Applied Polymer Sci.50：353-365，1993；Cascone等，J.Materials Sci.： Materials in Medicine(药物中的材料)5：770-774，1994；Shiraishi等，Biol.Pharm.Bull.16 (11)：1164-1168，1993；Thacharodi和Rao，Int′l J.Pharm.120：115-118，1995；Miyazaki等， Int′1 J.Pharm.118：257-263，1995)。

聚合物载体可以制成各种形式的，具有希望的释放特性和/或具有特定的所希望的性 质。例如，聚合物载体可以被制成当暴露于特定的触发事件(如pH)时释放治疗试剂(参 见例如Heller等，″Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems，(以化学的方式自调整 的药物递送系统)″，自iPolymers in Medicine III(药物中的聚合物III)，Elsevier Science Publishers B.V.，阿姆斯特丹，1988，pp.175-188；Kang等，J.Applied Polymer Sci. 48：343-354，1993；Dong等，J.Controlled Release 19：171-178，1992；Dong和Hoffman，J. Controlled Release 15：141-152，1991；Kim等，J.Controlled Release 28：143-152，1994； Cornejo-Bravo等，J.Controlled Release 33：223-229，1995；Wu和Lee，Pharm.Res. 10(10)：1544-1547，1993；Serres等，Pharm.Res.13(2)：196-201，1996；Peppas， ″Fundamentals of pH-and Temperature-Sensitive Delivery Systems，(pH及温度敏感递送系统 基础)″，自Gurny等(编)，Pulsatile Drug Delivery(脉动的药物递送)，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH，斯图加特，1993，pp.41-55；Doelker，″Cellulose Derivatives，(纤维素 衍生物)″1993，自Peppas和Langer(编)，Biopolymers I(生物聚合物I)，Springer-Verlag， Berlin)。pH敏感的聚合物的代表性实例包括聚丙烯酸及其衍生物(包括例如均聚物如聚 氨基羧酸；聚丙烯酸；聚甲基丙烯酸，这些均聚物的共聚物，以及聚丙烯酸和如上所讨论 的丙烯单体的共聚物。其他pH敏感的聚合物包括多糖如醋酸纤维素苯二甲酸酯；羟丙基 甲基纤维素苯二甲酸酯；醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯；trimellilate醋酸纤维素偏苯三 酸酯(trimellilate)；和壳聚糖。其他pH敏感的聚合物还包括任何pH敏感的聚合物和水 溶性聚合物的混合物。

同样地，聚合物载体可以被制成是温度敏感的(参见例如，Chen等，″Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery，(用于阴道药物递送的接枝到生物粘附聚丙烯酸骨架的温度敏感型 Pluronic的新型凝胶)″，自Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.22：167-168， Controlled Release Society，Inc.，1995；Okano，″Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Delivery，(用于时序受控药物递送的刺激响应型水 凝胶的分子设计)″自Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.22：111-112， Controlled Release Society，Inc.，1995；Johnston等，Pharm.Res.9(3)：425-433，1992；Tung， Int′1 J.Pharm.107：85-90，1994；Harsh和Gehrke，J.Controlled Release 17：175-186，1991；Bae 等，Pharm.Res.8(4)：531-537，1991；Dinarvand和D′Emanuele，J.Controlled Release 36：221-227，1995；Yu和Grainger，″Novel Thermo-sensitive Amphiphilic Gels：Poly N-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis and Physicochemical Characterization，(新型热敏感型两亲凝胶：聚N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯 酸钠-共-n-N-烷基丙烯酰胺网络合成和物化特性)″，俄勒冈科学与技术研究生院化学和 生物科学系，Beaverton，俄勒冈州，pp.820-821；Zhou和Smid，″Physical Hydrogels of Associative Star Polymers，(缔合的星型聚合物的物理水凝胶)″，纽约州立大学环境科学 和林学院化学系聚合物研究所，Syracuse，纽约州，pp.822-823；Hoffman等，″Characterizing Pore Sizes and Water′Structure′in Stimuli-Responsive Hydrogels，(刺激响应型水凝胶中的孔 径和水‘结构’特征)″，华盛顿大学生物工程中心，p.828；Yu和Grainger，″Thermo-sensitive Swelling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks：Cationic，Anionic and Ampholytic Hydrogels，(交联的N-异丙基丙烯酰胺网络中的热敏感型溶胀性能)″，俄勒 冈科学与技术研究生院化学和生物科学系，Beaverton，俄勒冈州，pp.829-830；Kim等， Pharm.Res.9(3)：283-290，1992；Bae等，Pharm.Res.8(5)：624-628，1991；Kono等，J. Controlled Release 30：69-75，1994；Yoshida等，J.Controlled Release 32：97-102，1994；Okano 等，J.Controlled Release 36：125-133，1995；Chun和Kim，J.Controlled Release 38：39-47，1996； D′Emanuele和Dinarvand，Int′1 J.Pharm.118：237-242，1995；Katono等，J.Controlled Release 16：215-228，1991；Hoffman，″Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species，(包含生物活性物质的热可逆型水凝胶)″，自Migliaresi等(编)，Polymers in Medicine III(药物中的聚合物III)，Elsevier Science Publishers B.V.，阿姆斯特丹，1988，pp.161-167； Hoffman，″Applications of Thermally-Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics，(热可逆型聚合物和凝胶在治疗学和诊断学中的应用)″，自第三届药物递送 系统中的新进展国际研讨会，盐湖城，犹他州，1987年2月24-27日，pp.297-305；Gutowska 等，J.Controlled Release 22：95-104，1992；Palasis和Gehrke，J.Controlled Release 18：1-12， 1992；Paavola等，Pharm.Res.12(12)：1997-2002，1995)。

热胶凝聚合物的代表性实例，以及它们的凝胶温度(LCST(℃))包括均聚物如聚 (N-甲基-N-n-丙基丙烯酰胺)，19.8；聚(N-n-丙基丙烯酰胺)，21.5；聚(N-甲基-N- 异丙基丙烯酰胺)，22.3；聚(N-n-丙基甲基丙烯酰胺)，28.0；聚(N-异丙基丙烯酰胺)， 30.9；聚(N，n-二乙基丙烯酰胺)，32.0；聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)，44.0；聚(N- 环丙基丙烯酰胺)，45.5；聚(N-乙基甲基丙烯酰胺)，50.0；聚(N-甲基-N-乙基丙烯酰 胺)，56.0；聚(N-环丙基甲基丙烯酰胺)，59.0；聚(N-乙基丙烯酰胺)，72.0。而且， 热胶凝聚合物可以通过制备上述两个或多个单体之间的共聚物，或者将这种均聚物与其他 水溶性聚合物如丙烯醛基单体(acrylmonomer)(例如丙烯酸及其衍生物如甲基丙烯酸， 丙烯酸酯及其衍生物如甲基丙烯酸丁酯，丙烯酰胺，和N-n-丁基丙烯酰胺)组合来制造。 热胶凝聚合物的其他代表性实例包括纤维素醚衍生物如羟丙基纤维素，41℃；甲基纤维素， 55℃；羟丙基甲基纤维素，66℃；和乙基羟乙基纤维素，和Pluronics如F-127，10-15℃； L-122，19℃；L-92，26℃；L-81，20℃；和L-61，24℃。

利用和本发明的聚合物载体可以制成多种不同的形式，包括例如棒状设计(rod-shaped device)、丸、厚片(slab)或胶囊(参见例如，Goodell et al.，Am.J.Hosp.Pharm.43：1454-1461， 1986；Langer等，″Controlled release of macromolecules from polymers(大分子从聚合物的受 控释放)″，自Biomedical Polymers，Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use(生物医学，用于生物医学应用的聚合物材料和药物)，Goldberg，E.P.，Nakagim，A.(编) Academic Press，pp.113-137，1980；Rhine等，J.Pharm.Sci.69：265-270，1980；Brown等，J. Pharm.Sci.72：1181-1185，1983；以及Bawa等，J.Controlled Release 1：259-267，1985)。

治疗试剂可以通过封闭在聚合物基质中与聚合物共价连接被连接，或者可以封装在微 胶囊中。在本发明的特定优选的实施方案中，治疗组合物以非胶囊的制剂如微球(尺寸范 围在纳米到微米)、糊剂、各种尺寸的丝状剂(thread)、薄膜剂和喷雾剂被提供。

本发明的另一个方面是提供治疗组合物和动物饲料。本发明的治疗组合物可以用上述 的聚合物载体包封，然后通过任何已知的将其应用于饲料中的方法添加到饲料中，例如通 过机械搅拌，喷洒等。所述治疗组合物包括，例如，能有效地至少降低至少一种目标细菌 在动物中定植的水平的量的至少一种细菌素和/或拮抗细菌，例如大约0.5g每种的lactocin 和/或肠球菌素/1000g，大约1.25g聚合物载体例如聚乙烯吡咯烷酮/1000g，和大约8.6％稀 释剂例如水/1000g，与可消化的任何颗粒组分，例如磨碎的玉米谷物；谷物例如燕麦，小 麦，荞麦；磨碎的果实例如梨等混合。然后将所述治疗组合物以有效地至少降低至少一种 目标细菌的定植水平的量加入任何类型的动物饲料中，例如细菌素对饲料的比为大约1∶10 至大约1∶100。为本发明的目的，动物饲料的实例包括青饲料，青贮饲料，干燥的青饲料， 根，块茎，肉质果，谷类，种子，啤酒糟，果渣，啤酒酵母，蒸馏残渣，面粉加工副产品， 糖、淀粉或油生产的副产品，和各种食品废弃物。该产品可以添加到饲养牛、家禽、兔、 猪、或羊等的动物饲料中。它可以与用于这些家畜的其他饲料添加剂混合使用。

下述实施例仅仅是为了进一步举例说明本发明，并非要限制由权利要求确定的本发明 的范围。

实施例1

产生细菌素的两种新拮抗菌株，唾液乳酸杆菌，标明为NRRL B-30514(菌株PVD32) 和嗜酸乳酸杆菌，标明为NRRL B-30510(菌株LWP320)从肉仔鸡的盲肠和嗉囊中分离 出来。所述盲肠和嗉囊预先排空并用大约100ml无菌的0.85％w/v盐水溶液(生理盐水) 洗涤两次。盲肠和嗉囊物悬浮于pH为大约7.0的无菌盐水溶液中。将大约0.1ml的10倍 稀释的悬液直接平板接种于选择性MRS琼脂上。平板在大约37℃厌氧培育大约16-18小 时。从每个样品选择至少10个乳酸杆菌特异的菌落。乳酸杆菌用APO 50CHL微检测系 统(bioMerieux，法国)进行鉴别。

菌株唾液乳酸杆菌PVD32和嗜酸乳酸杆菌LWP320在大约37℃在MRS琼脂上培养 大约24小时。这两个菌株是兼性厌氧菌，革兰氏阳性的非运动性的棒状细菌，能够在大 约30℃，37℃，和42℃生长。菌株PVD32在MRS琼脂上生长，在大约37℃微需氧培育 大约18-24小时后，产生直径为大约1-3mm的圆形至规则形状的、光滑的、凸面的具有清 晰边缘的菌落。菌株LWP320在MRS琼脂上生长，在37℃微需氧培育大约24小时后， 产生直径大约为0.5到0.8mm的发白的，半透明的菌落。

粪肠球菌LWP21和坚韧肠球菌LWP26在大约37℃在MRS琼脂上生长大约24小时。 它们是革兰氏阳性的兼性厌氧菌，非运动性的球菌，能在大约30℃，37℃，和42℃生长。 菌株LWP21在MRS琼脂上生长，产生发白色的半透明菌落，微需氧培育大约24小时后 变得透明。在大约37℃微需氧培育大约48小时后，菌落直径为大约0.8至大约1.0mm。

使用API 50CHL悬浮介质，在API 50CHL和EN-COCCUS图表种类中的结果如下述 表1所示。下述表2显示的结果表明菌株PVD32是唾液乳酸杆菌，菌株LWP320是嗜酸 乳酸杆菌，菌株LWP21是粪肠球菌，菌株LWP26是坚韧肠球菌。

评价拮抗分离物的拮抗活性的目标细菌包括从俄罗斯的肉仔鸡中分离的空肠弯曲杆 菌的菌株L4和B1，空肠弯曲杆菌ATCC 11168，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的几个种， 绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株ATCC 9027，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytongenes)，用作检测培养物以评价分 离菌的拮抗活性。空肠弯曲杆菌在大约37℃在大约5％O₂，大约10％CO₂，和大约85％N₂的微需氧条件下，在添加有大约0.02％亚硫酸氢钠，大约0.05％硫酸亚铁，和大约5％部分 裂解羊血的布鲁氏菌琼脂或弯曲杆菌琼脂上生长大约18-24小时。其他菌株小肠结肠炎耶 氏菌(Y.enterocolitica)和假结核耶氏菌(Y.pseudotuberculosis)在营养琼脂上在大约37℃ 或大约28℃在有氧条件下培养大约18-24小时。分离菌对弯曲杆菌的拮抗活性被评价。大 约0.2ml生理盐水悬液被平板接种于MRS琼脂上，在大约37℃培育大约24小时。大约 0.5cm³的琼脂块被切割下来并转移到添加有大约5％-10％部分裂解羊血，大约10mg/ml利 福平，和大约2.5u/ml多粘菌素，接种量为每个平板大约10⁷个空肠弯曲杆菌细胞的布鲁 氏菌琼脂或弯曲杆菌琼脂上。平板在大约42℃在如上所述的微量需氧条件下培育大约24 小时。拮抗活性通过测量空肠弯曲杆菌抑制区域的直径大小得以评价。

对空肠弯曲杆菌的拮抗活性用11,790种分离菌进行评价，其中279种分离菌显示出对 空肠弯曲杆菌的拮抗作用。

表1.API 50CHL和EN-COCCUS检测的鉴定结果

  菌株   检测(得分)   菌种   PVD32   API 50CHL(99.9％)   唾液乳酸杆菌   LWP320   API 50CHL(96.6％)   嗜酸乳酸杆菌   LWP21   EN-COCCUS-检测(96％)   粪肠球菌   LWP26   EN-COCCUS-检测(98％)   坚韧肠球菌

表2a.乳酸杆菌菌种的特征(API 50CHL的结果)

表2b.用EN-COCCUS检测获得的肠球菌菌种的特性

表3.分离菌对空肠弯曲杆菌检测菌株的抑制活性

实施例2

两种产细菌素的新拮抗菌种，粪肠球菌21(NRRL B-30645)，和坚韧肠球菌26(NRRL B-30511)，从健康肉仔鸡的盲肠和嗉囊涂片分离出来。盲肠和嗉囊被排空并用无菌的大 约pH7.0的0.085％w/v盐水溶液(生理盐水)洗涤两次。盲肠和嗉囊物悬浮于大约pH7.0 的无菌生理盐水中。大约0.1ml的10倍稀释的悬浮液被直接平板接种于MRS选择性培养 基上，平板在大约37℃培育大约24-48小时。肠球菌用微检测试剂盒EN-COCCUS鉴别。

空肠弯曲杆菌ATCC 11168被用作检测培养物以评价分离菌的拮抗活性，如上述实施 例1中所述。三十三种其他菌种被用作检测培养物以评价分离物的拮抗活性，如上述实施 例1中所述。分离菌对弯曲杆菌的拮抗活性也如上述实施例1所述进行评价。

对空肠弯曲杆菌的拮抗活性用源自大约125只肉仔鸡的1,200种分离菌进行评价。其 中63种分离菌显示出对空肠弯曲杆菌ATCC 11168的拮抗性。对12种最有活性的分离菌 (见上述表1-3)研究了其在MRS肉汤中培养期间产生细菌素的能力。

实施例3

粗制抗菌制备物通过仅对在饥饿培养基上在37℃在有氧条件下生长大约18小时的乳 酸杆菌拮抗菌株培养物进行硫酸铵沉淀来制备，所述饥饿培养基为：

K₂HPO₄         6.0g

KH₂PO₄         0.2g

(NH₄)₂SO₄      0.2g

MgSO₄          0.1g

葡萄糖        9.0g

组氨酸        0.08g

精氨酸        0.02g

加蒸馏水至1000ml，pH值为大约7.2

将培养物流体以大约12,000×g离心大约10分钟。得到的上清加入1N NaOH调整pH至 大约6.2，并加入大约130U/ml过氧化氢酶以除去有机酸，过氧化氢，和抑制因子。通过 组合进行硫酸铵沉淀，脱盐色谱和凝胶过滤从上清中分离拮抗肽，获得粗制的制备物 (CAP)。CAP样品通过0.22μ过滤器(Millipore，Bedford，MA)过滤。

实施例4

上述实施例2中显示出抗菌活性的肠球菌分离菌在中在大约37℃在有氧条件下培养 大约18小时，所述MRS肉汤(HiMedia)为：

MRS肉汤     15.0g

乳糖        0.05g

加蒸馏水至大约1000ml，pH大约7.2

收获培养物流体并以大约12,000×g离心大约10分钟。得到的上清加入1N NaOH调 整pH至大约6.2，并加入大约130U/ml过氧化氢酶以除去有机酸和过氧化氢，和抑制因 子。通过组合进行硫酸铵沉淀，脱盐色谱和凝胶过滤从上清中分离拮抗肽，得到粗制的抗 菌制备物(CAP)。CAP样品通过0.22μ过滤器(Millipore)过滤。

实施例5

CAP的抗菌活性谱通过斑点实验确定。大约1ml的如上述实施例3和4中获得的无 菌粗制抗菌制备物(CAP)用大约1ml磷酸钠缓冲液(pH大约7.0)稀释，并灭菌，如上 述实施例3和4中所述。大约10ml的每种样品平板接种于添加血的弯曲杆菌琼脂或事先 接种了目标细菌细胞的营养琼脂上。含有空肠弯曲杆菌培养物的平板在大约42℃在微需氧 条件下生长，小肠结肠炎耶氏菌和假结核耶氏菌在大约28℃有氧培育，其他细菌菌株在大 约37℃有氧培育，培育大约24或48小时。鉴别是基于目标细菌产生的抑制区域。CAP 的活性表达为培养物生长显示出可见抑制区域时每一毫升制备物的任意单位(AU) (Henderson等，Archives of Biochemistry and Biophysics(生物化学和生物物理档案)，第 295卷，5-12，1992；在此通过引用并入本文)。所有的实验均重复两次。

下述表4和5给出了针对实施例3中的乳酸杆菌以及实施例4中的肠球菌制备的粗制 抗菌制备物的拮抗活性。

乳酸杆菌菌种的两种分离菌抑制空肠弯曲杆菌的生长(表3)。分离菌用API 50CHL 检测(bioMerieux，法国)鉴别为唾液乳酸杆菌-PVD32(NRRL B-30514)和嗜酸乳酸杆 菌LWP320(NRRL B-30510)。如表4中所示，所有这些菌株产生具有广谱抗菌活性的 lactocin。它们抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的生长。Lactocin OR-7抵抗空肠弯曲 杆菌的活性最强。

肠球菌菌种的两种分离菌抑制空肠弯曲杆菌的生长(表3)。分离菌用ENCOCCUS 检测鉴别为粪肠球菌(分离菌LWP21)(NRRL B-30645)和坚韧肠球菌(分离菌LWP26) (NRRL B-30511)。两种菌株产生广谱活性的肠球菌素(enterocins)，抑制革兰氏阳性 和革兰氏阴性微生物。粪肠球菌产生的肠球菌素21是唯一抑制所有33种检测菌株、包括 特别对不同来源的细菌素具有抗性的普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和摩氏摩根菌 (Morganella morganii)的生长的细菌素。

表4.斑点实验中由乳酸杆菌和乳酸球菌(Lactococcus spp.)产生的lactocin和lactococcin 的活性(AU/ml)

 检测菌株   OR-7Lactcin   LWP320Latocin  空肠弯曲杆菌ATTC 11168   3200   1600  空肠弯曲杆菌L4   3200   1600  空肠弯曲杆菌UV3   3200   800  空肠弯曲杆菌F2   3200   800  肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)1   1600   800  肠炎沙门氏菌4   1600   800  肠炎沙门氏菌204   800   800  肠炎沙门氏菌237   1600   800  鸡雏白痢沙门氏菌(S.gallinarum pullorum)   800   400  鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)320   1600   400  鼠伤寒沙门氏菌383/60   1600   800  猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)370   1600   800  猪霍乱沙门氏菌434/4   800   400  大肠杆菌(E.coli)0157：7EDL 933   1600   1600  大肠杆菌0157：7904   3200   3200  大肠杆菌0157：7J61   3200   400  大肠杆菌0157：7131   3200   800  弗式柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)   1600   400  肺炎克氏杆菌   1600   200  痢疾志贺式菌(Sh.Dysenteriae)   1600   200  小肠结肠炎耶氏菌03   1600   400  小肠结肠炎耶氏菌09   1600   200  小肠结肠炎耶氏菌11   800   400  假结核耶氏菌ser 4   1600   200  假结核耶氏菌ser 14   1600   200

表5.粪肠球菌21和坚韧肠球菌26产生的肠球菌素的活性

  检测菌株   粪肠球菌   CAP   粪肠球菌   第I峰   粪肠球菌   第II峰   粪肠球菌   第I峰&第   II峰   坚韧肠球   菌   CAP   空肠弯曲杆菌ATCC   11168   12800   -   400   12800   6400   空肠弯曲杆菌L4   6400   -   400   6400   3200   空肠弯曲杆菌UV3   6400   -   400   6400   3200   空肠弯曲杆菌F2   6400   -   400   6400   3200   肠炎沙门氏菌1   1600   -   400   1600   3200   肠炎沙门氏菌4   1600   -   400   1600   3200   肠炎沙门氏菌204   1600   -   400   1600   3200   肠炎沙门氏菌237   1600   -   400   1600   3200   鸡雏白痢沙门氏菌   3200   -   800   3200   1600   鼠伤寒沙门氏菌320   3200   -   800   3200   1600   鼠伤寒沙门氏菌386/60   3200   -   800   3200   3200   猪霍乱沙门氏菌(S.   Choleraesuis)370   3200   -   400   3200   3200   猪霍乱沙门氏菌434/4   1600   -   400   1600   3200   大肠杆菌0157：7EDL933   3200   -   400   3200   1600   大肠杆菌0157：7904   3200   -   800   3200   1600   大肠杆菌0157：7J61   3200   -   400   3200   3200   大肠杆菌0157：7131   3200   -   200   3200   3200   弗式柠檬酸杆菌   6400   -   400   6400   1600   克雷伯氏肺炎杆菌   1600   -   200   1600   1600   痢疾志贺式菌   6400   -   800   6400   1600   小肠结肠炎耶氏菌03   6400   -   400   6400   3200   小肠结肠炎耶氏菌09   3200   -   400   3200   3200   小肠结肠炎耶氏菌11   3200   -   400   3200   1600   假结核耶氏菌ser 4   3200   -   400   3200   1600   假结核耶氏菌14   3200   -   400   3200   1600   奇异变形杆菌(Proteus   mirabilis)   800   -   200   800   -   摩氏摩根菌   800   -   200   800   -   铜绿假单胞菌   (Pseudomonas   aeruginosa)ATCC 9027   6400   -   400   6400   -

  单核细胞增生李斯特菌   9-72   6400 -   800   6400   3200   单核细胞增生李斯特菌   9-30   12800 -   800   12800   -   单核细胞增生李斯特菌A   6400 -   800   6400   3200   金黄色葡萄球菌   (Staphylococcus aureus)   6400 -   800   6400   1600   表皮葡萄球菌   (Staphylococcus   epidermidis)4   3200 -   400   3200   1600

实施例6

CAP和细菌素用大约15％重量的琼脂糖凝胶和大约1％SDS(9×12cm)在三甘氨酸缓 冲液中进行SDS-PAGE电泳。大约100mA进行大约4小时电泳后，凝胶用含有大约15％ 乙醇和大约1％乙酸的溶液固定。该凝胶然后用蒸馏水洗涤4个小时。为了确定蛋白质组 分的分子量，凝胶用含有大约0.15％考马斯亮蓝R-250(Sigma，USA)，大约40％乙醇， 和大约7％乙酸的溶液染色。凝胶继而用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤大约1.5小时，并用去 离子水洗涤大约3小时。洗涤后的凝胶用Bhunia等的方法(Journal of Industrial Microbiology， Volume 2，319-322，1987；通过引用并入文本)检测其对三种目标细菌，空肠弯曲杆菌ATCC 11168，大肠杆菌0157：H7 904，和肠炎沙门氏菌237的抗性。凝胶置于皮氏培养皿(Petri dishes)中，用大约5％裂解羊血-半固体弯曲杆菌琼脂(大约0.75％)或半固体琼脂(0.7％) 覆盖，用检测菌株的细胞接种。含有空肠弯曲杆菌的平板在微需氧条件下在大约42℃培育 大约48小时，大肠杆菌O157：H7和肠炎沙门氏菌在大约37℃培育大约24小时。检测是 基于在细菌素存在的条件下观察到检测菌株生长抑制区域。纯化细菌素的活性被评价(表 6是乳酸杆菌菌种，表7是肠球菌菌种)。

CAP样品和细菌素置于IEF凝胶(pH大约3.1-10.0)(Novex，San Diego，CA)上。 凝胶电泳在XCM II^TM Mini-Cell(Novex)中用大约100V进行大约1小时，用200V进行大 约2小时，用500V进行大约30分钟。凝胶用蒸馏水洗涤大约30秒，不固定，然后用考 马斯亮蓝R-250(Sigma，USA)染色以确定细菌素的等电点(pI)以及它们抑制检测菌株生 长的能力，如下述表6和表7所示，表6为lactocins，表7为肠球菌素。

如图1所示，唾液乳酸杆菌PVD 32的CAP OR7含有大约6kDa，大约16kDa，和大 约40kDa的三个蛋白组分。为了检测它们的活性，含有所述肽的染色电泳条带被置于培 育有空肠弯曲杆菌ATCC 11168，肠炎沙门氏菌，和大肠杆菌O157：H7的细胞的半固体弯 曲杆菌琼脂上。大约6kDa的组分被发现具有抵抗所有三种检测菌株的活性。等电聚焦鉴 别了一种pI等于大约9.0的组分表现出抵抗所有三种检测菌株的活性。

如图2所示，纯的嗜酸乳酸杆菌LWP320的lactocin LWP320和纯的坚韧肠球菌LWP26 的肠球菌素LWP26分别含有大约6kDa和大约3kDa的蛋白质组分。为了检测它们的活 性，含有所述肽的染色电泳条带被置于培育有空肠弯曲杆菌ATCC 11168，肠炎沙门氏菌， 和大肠杆菌O157：H7的细胞的半固体弯曲杆菌琼脂上。大约6kDa和大约3kDa的组分 被发现具有抵抗所有三种检测菌株的活性。等电聚焦鉴别了一种pI分别等于大约8.5和大 约7.8的组分表现出抵抗所有三种检测菌株的活性。

如图3所示，分离的粪肠球菌LWP21的肠球菌素LWP21含有大约3.0kDa(第1峰) 和大约6.0kDa(第2峰)的两个蛋白组分。为了确定抗菌活性，电泳条带被置于培育有 空肠弯曲杆菌ATCC 11168，肠炎沙门氏菌，和大肠杆菌O157：H7的细胞的半固体弯曲杆 菌琼脂上。大约6.0kDa的组分具有抵抗所有三种检测菌株的活性。没有观察到大约3.0kDa 的组分有抗菌活性。对于分离的肠球菌素LWP26，等电聚焦鉴别了一种pI为大约7.8的 单一蛋白组分对所有三种检测菌株有拮抗性(表7)。最高活性与在斑点实验中的肠球菌 素LWP21的第1峰+第2峰组分发生联系，而最低活性显示在SDS-PAGE和IEF中。

表6.由斑点实验，SDS-PAGE，和IEF确定的lactocins CAP的抗菌活性

  CAP   检测菌株   斑点实验中的   抑制活性   (AU/ml)   SDS-PAGE中的   抑制活性   (kDa)  IEF中的抑制活  性  (pI)   OR-7lactociin   空肠弯曲杆菌   ATCC 11168   3200   M.W.＝6.0  9.0   肠炎沙门氏菌   204   800   M.W.＝6.0  9.0   大肠杆菌   O157：H7 904   3200   M.W.＝6.0  9.0   LWP320   lactocin   空肠弯曲杆菌   ATCC 11168   1600   M.W.＝6.2  8.5   肠炎沙门氏菌   204   800   M.W.＝6.2  8.5   大肠杆菌   O157：H7 904   800   M.W.＝6.2  8.5

表7.基于SDS-PAGE和等电聚焦结果的肠球菌素LWP21和LWP26的活性组分的特性

  肠球菌素   检测菌株   斑点实验中的活   性(AU/ml)   基于   SDS-PAGE的分   子量(kDa)   细菌素的等电   占

 肠球菌素  LWP21第I峰  组分   空肠弯曲杆菌   ATCC 11168   -   3.0   5.6   肠炎沙门氏菌   204   -   3.0   5.6   大肠杆菌   O157：H7 904   -   3.0   5.6  肠球菌素  LWP21 Peak II  fraction   空肠弯曲杆菌   ATCC 11168   400   6.1   8.4   肠炎沙门氏菌   204   400   6.1   8.4   大肠杆菌   O157：H7 904   400   6.1   8.4  肠球菌素  LWP21第I峰  +第II峰组分   空肠弯曲杆菌   ATCC 11168   12800   3.0，6.1   5.6，8.4   肠炎沙门氏菌   204   1600   3.0，6.1   5.6，8.4   大肠杆菌   O157：H7 904   3200   3.0，6.1   5.6，8.4  肠球菌素  LWP26   空肠弯曲杆菌   ATCC 11168   6400   3.0   7.8   肠炎沙门氏菌   204   3200   3.0   7.8   大肠杆菌   O157：H7 904   1600   3.0   7.8

实施例7

如上述实施例2所述获得的细菌素的粗制抗菌制备物用凝胶过滤和离子交换色谱纯 化。lactocin OR7和lactocin LWP320的粗制抗菌制备物(CAP)被注入到用大约75ml磷 酸钠缓冲液，pH大约5.9平衡的Superose 12HR 16/50柱(Pharmacia，1.6×50cm)中。所 述制备物用相同的缓冲液以大约8ml/分钟的流速洗脱。检测洗脱组分抵抗空肠弯曲杆菌 ATCC 11168的活性。蛋白质的浓度用Lowry等的方法(Journal of Biological Chemistry， Volume 193，1951)检测。抑制空肠弯曲杆菌生长的组分用CM-Sepharose柱(Pharmacia，2.5 ×20cm)通过阳离子交换色谱进一步纯化。CM-Sepharose柱用缓冲液C(50mM柠檬酸盐 -磷酸盐缓冲液，pH大约5.0)以大约8ml/分钟的流速平衡。细菌素用其中NaCl浓度为大 约0.1％至大约0.8％的大约8mM的缓冲液C以大约8ml/分钟的流速洗脱。确定每个组分 的抗菌活性和蛋白质浓度。纯化的组分称为lactocins OR7和LWP320。

纯化的OR7和LWP320用SDS-PAGE和等电聚焦进行评价，如上述实施例4中所述。 活性最高的组分(OR7)是分子量为大约6kDa，pI为大约9.0的肽(图1和表6)，活性 组分LWP320是分子量为大约6kDa，pI为大约8.5的肽(图3和表6)。

CAP的肠球菌细菌素通过两个步骤纯化：离子交换色谱和疏水色谱。实施例4中得到 的活性CAP组分被注入用缓冲液C(20mM磷酸钠，pH大约7.8)以大约18ml/分钟的流 速平衡的SP-Sepharose Fast Flow柱(V-30ml)中。该柱用4倍体积的缓冲液C洗涤，组分 用大约100ml含0.5M NaCl的缓冲液C洗脱。组分活性用空肠弯曲杆菌ATCC 11168通过 如上述实施例5所述的斑点实验确定。能抑制空肠弯曲杆菌的生长的组分被注入用含有 0.2M NaCl的缓冲液D(0.06M硼酸盐缓冲液，pH大约8.5)平衡的Phenyl-Sepharose CL-4B 柱中。该柱用4倍体积的缓冲液D洗涤。组分用约4ml的含有大约70％乙醇(v/v)的缓 冲液D洗脱。每种组分的拮抗活性用斑点实验测定。用SP-Sepharose或Phenyl-Sepharose CL-4B再次进行阳离子交换色谱获得纯化的制备物。蛋白质浓度用Lowry的方法(如上所 述)确定。分离的组分称为肠球菌素LWP21和LWP26。

分离的LWP21和LWP26组分用SDS-PAGE和等电聚焦进行评价，如上述实施例4 中所述。LWP21的活性最高的组分2是分子量为大约6kDa，pI为大约8.4的肽(图2和 表7)，LWP21的没有活性的组分1是分子量为大约3kDa，pI为大约5.6的肽(图2和 表7)。LWP26的活性最高的组分是分子量为大约3kDa，pI为大约7.8的肽(图3和表 7)。

纯化细菌素的氨基酸序列用491 cLC自动测序仪(Applied Biosystems，USA)通过 Edman降解法确定。细菌素在真空中在大约110℃在大约6M HCl中水解大约72小时。用 Voyager-DERP(Perkin-Elmer，USA)通过质谱确定分子量。MALDI-TOF系统，一种基质辅 助激光解吸附电离飞行时间系统，与基质，2-氰基-羟基肉桂酸一起使用。四种细菌素的氨 基酸序列是：

OR7：

KTYYGTNGVHCTKNSLWGKVRLKNMKYDQNTTYMGRLQDILLGWATGAFGKTFH

SEQ ID NO 1

LWP320：

ARKYGNGVCGSKWINNGGFQVIGNNAAANLTNWGEAFASATKSGCSATTCIINAMA

SEQ ID NO 2

LWP21(组分1)：FNIRGGYNFGKSVRHWDAIGNMAGIIKL SEQ ID NO 3

LWP21(组分2)：

VFHAYSARGVRNNYKCAGVPDAIGCAVRGIFIHGYSLQWMQVKWGWLFK SEQ ID NO

4

LWP26：TKTTRGNGVNKECWETYKAGTVDILWASWSK SEQ ID NO 5

OR7肽的计算分子量为大约6,000Da。MALDI-TOF分析表明OR7的分子量为5,123 Da。

LWP320肽的计算分子量为大约6,000Da。MALDI-TOF分析表明LWP320的分子量 为5,858Da。

LWP21肽(组分1)的计算分子量为大约3,000Da。MALDI-TOF分析表明LWP21 (组分1)的分子量为2,786Da。

LWP21肽(组分2)的计算分子量为大约6,000Da。MALDI-TOF分析表明LWP21 (组分2)的分子量为4,986Da。

LWP26肽的计算分子量为大约3,000Da。MALDI-TOF分析表明LWP26的分子量为 3,231Da。

表8.lactocin OR7的生物化学纯化

  样品   体积   (ml)   蛋白质(mg/ml)   特异活性AU/mg   纯度(％)   培养物上清   150   1.2   13034   0   CAP((NH₄)₂SO₄沉淀)   9.8   0.9   19174   9.09   Superose 12凝胶过滤   6   0.4   58312   82.3   CM-Sepharose阳离子   交换色谱   1.3   0.14   532317   93.8

表9.肠球菌素LWP21的生物化学纯化

  样品   体积(ml)   蛋白质(mg/ml)   特异活性   (AU/mg)   纯度(％)   培养物上清   1500   2.3   17932   0   CAP((NH₄)₂SO₄沉淀)   4.5   1.2   24142   10.2   SP-Superose Fast Flow   2.1   0.9   79243   80.2   Phenyl-Sepharose CL-4B   1.3   0.4   238732   93.3

实施例8

测定了酶、温度、和pH对细菌素活性的影响。大约10μl的下述酶之一被转移到含有 大约20ml细菌素的管中：β-胰凝乳蛋白酶-大约100mg/ml，蛋白酶K-大约200mg/ml，木 瓜蛋白酶-大约60mg/ml，溶菌酶-大约75mg/ml，和脂肪酶-大约100mg/ml(所有均是来 自Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis MO)。大约37℃培育大约3小时后，细菌素和酶的混合 物用如实施例5所述的斑点实验分析其抗菌活性。未处理的细菌素作为阳性对照。

为了研究细菌素的热稳定性，大约2mg/ml的样品在水浴中煮沸大约15分钟，冷却， 通过斑点实验评价其抗菌活性。大约2mg/ml细菌素用于评价pH的效果。大约2ml的无 菌溶液，大约10mM NaOH或大约10mM HCl被加入到样品中以检测大约3至大约10的 pH。样品在约37℃培育大约2小时和24小时，在大约90℃培育大约20分钟。通过加入 大约4mM无菌磷酸盐缓冲液调整样品至pH大约7.2，用如上述实施例5所述的斑点实验 分析其抗菌活性。

所述细菌素在用β-胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K、和木瓜蛋白酶处理后失去了活性，但是 在用溶菌酶、脂肪酶、或加热到大约90℃时保留活性(表10和11)。它们在从大约3.0 至大约9.0的不同pH值是稳定的，但是在大约pH 10变得无活性(表12和13)。肠球菌 素在pH大约9.1和大约10失去其活性。

表10.酶和温度对OR7的抗菌活性的效果

 处理   活性^* β-胰凝乳蛋白酶   -  蛋白酶K   -  木瓜蛋白酶   -  胰凝乳蛋白酶  脂肪酶  90℃，15分钟

^*斑点实验中抵抗空肠弯曲杆菌ATCC 11168的活性

(+)存在活性

(-)处理后失去活性

表11.酶和温度对肠球菌素LWP21和肠球菌素LWP26的抗菌活性的效果

 处理   活性^* β-胰凝乳蛋白酶   -  蛋白酶K   -  木瓜蛋白酶   -  溶菌酶   +  脂肪酶   +  90℃，15分钟   +

^*斑点实验中抵抗空肠弯曲杆菌ATCC 11168的活性

(+)处理后存在活性

(-)处理后失去活性

表12.pH对lactocin OR7的活性的效果

  pH   37℃2小时后的活性^*  37℃24小时后的活性^*  90℃20分钟后的活性   3.0   +   -   +   5.0   +   +   +   6.2   +   +   +   7.0   +   +   +   8.4   +   +   +   9.1   +   -   -   10.0   -   -   -

^*斑点实验中抵抗空肠弯曲杆菌ATCC 11168的活性

(+)处理后存在活性

(-)处理后失去活性

表13.pH对肠球菌素LWP21和肠球菌素LWP26的活性的效果

  pH   37℃2小时后的活性   ^*  37℃24小时后的活   性   90℃20分钟后的活   性^*  3.0   -   -   -   5.0   +   +   +   6.2   +   +   +   7.0   +   +   +   8.4   +   +   +   9.1   -   -   -   10.0   -   -   -

^*斑点实验中抵抗空肠弯曲杆菌ATCC 11168的活性

(+)处理后存在活性

(-)处理后失去活性

实施例9

细菌素OR7如实施例5中所述纯化。按本领域所知，纯化的细菌素OR7置于聚乙烯 吡咯烷酮中加入商品家禽饲料中，浓度大约250mg/kg商品家禽饲料。大约100g由磨碎的 玉米谷物制成的治疗组合物含有大约0.5g细菌素OR7，大约1.25g聚乙烯吡咯烷酮，和大 约8.6％的水。大约100g这种组合物被加入到大约2kg家禽饲料中。1天龄、6天龄和18 天龄的雏鸡被分组置于分开隔离的配有送料器、水、和过滤空气供应的单元中。食物和水 随意供应。对于1天龄的雏鸡(表14)：第一组雏鸡作为对照组，自由获取不添加细菌素 的规定饮食。这些雏鸡在生命的第一天就受到如上述实施例1所述的空肠弯曲杆菌L4和 B1的刺激(challenge)。这些菌株通过经口管饲以0.2ml体积中大约2×10⁶的浓度饲喂。 五只雏鸡在刺激后大约7天处死(sacrificed)，其余五只在刺激后大约10天处死。第二组雏鸡在其生命的第1天受到空肠弯曲杆菌L4和B1的刺激，与上述第一组相同。这些雏 鸡在生命的第4天起的三天中自由获取含有大约250mg细菌素OR7/kg食物的规定饮食。 第二组雏鸡在空肠弯曲杆菌刺激后大约7天处死。第三组雏鸡接受的刺激和喂食与第二组 雏鸡相同，在刺激后10天处死，结果如表15所示。

表14.细菌素OR-7对于肉仔鸡中实验诱导空肠弯曲杆菌感染的治疗效果

  组别   禽编   号#   受刺激后处死时间   (天)   空肠弯曲杆菌浓度g/g   盲肠内容物   保护指数％   一   对照   1   7   6.63   2   7   6.18   3   7   6.15   4   7   5.87   5   7   6.21   6   10   9.00   7   10   8.68   8   10   8.95   9   10   9.34   10   10   8.99   二   1   7   0.00   100％   2   7   0.00   100％   3   7   6.95   0.89％   4   7   0   100％   5   7   4.23   1.47％   7   7   0   100％   8   7   0   100％   9   7   5.36   1.16％   10   7   0   100％   三   1   10   0   100％   2   10   0   100％   3   10   0   100％   4   10   0   100％   5   10   0   100％   6   10   0   100％   7   10   6.11   1.47％

  8   10   0   100％   9   10   0   100％   10   10   0   100％

^*在商品食物的基础上为1-10天龄的雏鸡制备治疗性规定饮食。

对于6天龄的雏鸡，对照组自由获取不添加细菌素的规定饮食。这些雏鸡在实验的第 2天接受大约0.2ml体积中大约10⁶CFU的如实施例1中所述的空肠弯曲杆菌菌株L-4，和 B-1的刺激。空肠弯曲杆菌通过经口管饲喂食。雏鸡在刺激后9天、11天、和14天处死。 两组实验雏鸡从生命的第6天开始自由获取具有包封在聚乙烯吡咯烷酮中的细菌素OR7 的规定饮食。这些雏鸡与上述对照雏鸡相同在实验的第2天受到刺激。雏鸡在生命的第9 天、11天、和14天处死。结果如下述表15所示。

表15.饲料中添加细菌素OR7的与空肠弯曲杆菌有关的感染的6天龄雏鸡的实验处理

  组别   每组雏鸡数   空肠弯曲杆   菌刺激的时   间和剂量   (CFU)   饲喂持续的   天数   处死雏鸡的   年龄   每克盲肠物   质中空肠弯   曲杆菌的浓   度   对照   4   第2天   10⁶CFU   -   4   8×10⁸  5   第2天   10⁶CFU   -   9   1.8×10⁸  5   第2天   10⁶CFU   -   11   1.02×10⁹  5   2^nd Day   10⁶CFU   -   14   8.2×10⁸  饲料中有细   菌素⁸OR7   10   第2天   10⁶CFU   3   9   3只雏鸡＝0   1只雏鸡   ＝1×10¹  4只雏鸡   ＝1×10²  2只雏鸡   ＝1×10³  9   第2天   10⁶CFU   5   11   6只雏鸡＝0   1只雏鸡   01×10¹  2只雏鸡   ＝1×10⁴

  9   第2天   10⁶CFU   8   14   4只雏鸡＝0   1只雏鸡   ＝1×10³  1只雏鸡   ＝1×10⁴  1只雏鸡   ＝1×10⁵  1只雏鸡   ＝1×10⁷  1只雏鸡   ＝1×10⁸

^*给雏鸡喂食的纯剂量为3天时间＝大约26.4mg；5天＝大约50.6mg；8天＝大约80.5mg

对于18天龄的雏鸡，对照雏鸡自由获取不添加细菌素的规定饮食。这些雏鸡如上所 述在实验的第15天经口管饲喂食大约0.2ml体积的10⁷CFU空肠弯曲杆菌菌株L-4和B-1 的剂量。雏鸡在实验的第24天处死。接受如上所述的含有细菌素OR7的常规饮食的雏鸡 从生命的大约第19天开始的大约五天中自由获取含有大约0.25g细菌素OR7/kg饲料的饲 料，纯治疗剂量是每只雏鸡大约109mg。雏鸡在生命的第24天处死。结果如下述表16所 示。

表16.饲料中添加细菌素OR7的与空肠弯曲杆菌有关的感染的18天龄雏鸡的实验处理

 组别   雏鸡数目   空肠弯曲杆菌   刺激的时间和   剂量CFU   处死雏鸡的年   龄   每克盲肠物质   中空肠弯曲杆   菌浓度(CFU)  对照   5   第15天   10⁷CFU   24   7.84×10⁹ 细菌素OR7处  理   9   第15天   10⁷CFU   24   3只雏鸡＝0   6只雏鸡   ＝2.4×10²

雏鸡在生命的第1天受到刺激，对照雏鸡自由获取不添加细菌素的食物和水。雏鸡在 生命的第1天经口管饲受到大约10⁶CFU的空肠弯曲杆菌菌株L4和B1的刺激。对照雏鸡 在生命的第17天处死。在实验组I中，1天龄的雏鸡受到与对照雏鸡相同的刺激，从生命 的第14天开始自由获取含有大约0.250g细菌素OR7/kg饲料的饲料，在生命的大约第17 天处死；第II组的雏鸡在生命的第1天受到与对照雏鸡相同的刺激，在生命的第14天自 由获取含有大约0.500g细菌素OR7/kg饲料的饲料；在生命的第17天处死。结果如表17 所示。

表17.饲料中添加细菌素OR7的感染空肠弯曲杆菌的雏鸡的实验处理

  组别   雏鸡数目   空肠弯曲杆菌刺激   的时间和剂量CFU   生命的第17天时每   克盲肠物质中空肠   弯曲杆菌浓度   对照   10   1天龄   10⁶CFU   2只雏鸡＝4.0×10⁶  1只雏鸡＝1.9×10⁷  7只雏鸡＝0.3×10⁹  用含有0.250g/1kg   饲料的饲料处理   16   1天龄   10⁶CFU   14只雏鸡＝0   1只雏鸡＝1.3×10³  1只雏鸡＝1.2×10³  用含有0.500g/1kg   饲料的饲料处理   16   1天龄   10⁶CFU   13只雏鸡＝0   1只雏鸡＝3.5×10³  1只雏鸡＝0.4×10³

前述详细描述是为了举例说明的目的，这些细节仅仅是为了该目的，本领域技术人员 可以作出变化而不会背离本发明的精神和范围。

序列表

<110>Stern，Norman J

     Svetoch，Edward A.

     Eruslanov，Boris V.

     Volodina，Larisa I.

     Kovalev，Yuri N.

     Kudryavtseva，Tamara Y.

     Perelygin，Vladimir V.

     Pokhilenko，Victor D.

     Levchuk，Vladimir P.

     Borzenkov，Valery N.

     Svetoch，Olga E.

     Mitsevich，Eugeni V.

     Mitsevich，Irina P.

<120>细菌素和新的细菌菌株

<130>D.N.0135.03

<160>5

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>54

<212>PRT

<213>唾液乳酸杆菌

<400>1

Lys Thr Tyr Tyr Gly Thr Asn Gly Val His Cys Thr Lys Asn Ser Leu

1                 5                      10                   15

Trp Gly Lys Val Arg Leu Lys Asn Met Lys Tyr Asp Gln Asn Thr Thr

             20                   25                    30

Tyr Met Gly Arg Leu Gln Asp Ile Leu Leu Gly Trp Ala Thr Gly Ala

        35                    40                     45

Phe Gly Lys Thr Phe His

    50

<210>2

<211>56

<212>PRT

<213>嗜酸乳酸杆菌

<400>2

Ala Arg Lys Tyr Gly Asn Gly Val Cys Gly Ser Lys Trp Ile Asn Asn

1                 5                     10                    15

Gly Gly Phe Gln Val Ile Gly Asn Asn Ala Ala Ala Asn Leu Thr Asn

            20                      25                   30

Trp Gly Glu Ala Phe Ala Ser Ala Thr Lys Ser Gly Cys Ser Ala Thr

        35                     40                    45

Thr Cys Ile Ile Asn Ala Met Ala

    50                      55

<210>3

<211>29

<212>PRT

<213>粪肠球菌

<400>3

Phe Asn Ile Arg Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Lys Ser Val Arg His Val

1                 5                     10                    15

Val Asp Ala Ile Gly Asn Met Ala Gly Ile Ile Lys Leu

              20                    25

<210>4

<211>49

<212>PRT

<213>粪肠球菌

<400>4

Val Phe His Ala Tyr Ser Ala Arg Gly Val Arg Asn Asn Tyr Lys Cys

1                5                       10                  15

Ala Gly Val Pro Asp Ala Ile Gly Cys Ala Val Arg Gly Ile Phe Ile

             20                      25                     30

His Gly Tyr Ser Leu Gln Trp Met Gln Val Lys Trp Gly Trp Leu Phe

         35                   40                      45

Lys

<210>5

<211>31

<212>PRT

<213>坚韧肠球菌

<400>5

Thr Lys Thr Thr Arg Gly Asn Gly Val Asn Lys Glu Cys Trp Glu Thr

1                 5                     10                   15

Tyr Lys Ala Gly Thr Val Asp Ile Leu Trp Ala Ser Trp Ser Lys

             20                     25                     30