一种强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用

摘要

本发明涉及液相色谱技术，具体的说是一种易操作、维护方便、无需增加额外硬件装置，并可实现了纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用。本发明采用强阴离子预柱和反相C18分离柱作为自动化分离分析的系统，成功解决了预柱和分离柱均为反相C18固定相系统的不足，发展了一种易操作，维护方便，无需增加额外硬件的装置，实现了纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联用对磷酸化肽样品高效准确的自动化分析。

说明书

技术领域

本发明涉液相色谱技术，具体的说是一种易操作、维护方便、无需增加额外硬件装置，并可实现了纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用。

背景技术

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组中研究的热点课题。蛋白质磷酸化是最常见，最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节者生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是目前所知道的信号转导的主要传递方式。

蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记，Edman降解以及薄层层析等方法。这些方法操作繁琐，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，而且存在潜在的放射性危险。质谱技术已经发展成为鉴定磷酸化蛋白的重要工具之一。但是质谱在鉴定磷酸化蛋白现在仍然面临着巨大的挑战，其具体体现在：第一，磷酸化蛋白在细胞内中属于低丰度蛋白；第二，磷酸化肽段的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量的非磷酸化肽段的质谱信号通常会淹没磷酸化肽的离子信号。因此，复杂蛋白酶解产物中磷酸化肽段的分离，纯化和富集是质谱成功鉴定磷酸化最为重要的一步。磷酸化蛋白组的研究中，通常运用两种不同的富集策略，富集磷酸化蛋白和富集磷酸化肽段。磷酸化蛋白的富集主要是通过磷酸化蛋白质的抗体和化学方法进行修饰改变磷酸基团的化学性质，然后特异性的分离纯化。磷酸肽段的富集使用最多的是固定化金属亲和色谱(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC(Fe³⁺，Ga³⁺))。近来TiO₂和ZrO₂微柱，Al(OH)₃，Fe₃O₄/TiO₂壳孔纳米颗粒等也被用来特异纯化和富集磷酸肽。另外一种常用的方法是化学标记，通过化学反应特异地将磷酸基团修饰成亲和位点而达到纯化和富集磷酸肽的目的。

然而，磷酸化蛋白质及其酶解物样品自动化进样、分离分析仍然是磷酸化蛋白质组研究中的巨大挑战.目前大规模磷酸肽样品的自动化分析主要利用大内径但较短的毛细管柱作为预柱，采用大流速进样，然后再进行分离分析。Licklider等人(“Automation of nanoscale microcapillary liquid chromatography-tandem massspectromentry with a vented column”，《Analytical chemistry》，P3076-3083，2002年)发明了一种带排泄口的自动化的预柱装置，能够快速高效的自动化进样进行分离分析。而在之前，所有的自动化的操作都是采用阀切换的模式进行，整个装置构建很复杂，维护不便，且样品损失量相当大。但Licklider等人的装置也存在预柱更换不方便和易堵塞的缺点。有鉴于此，非专利文献2中Yi等人(“Amicrocapillary trap cartridge-microcapillary high-performance liquid chromatographyelectrospray ionization emitter device capable of peptide tandem mass spectrometry atthe attomole level on an ion trap mass spectrometer with automated routine operation”，《Rapid Communication.Mass Spectrometry.》，P2093-2098，2003年)进一步发展了这种自动化系统，使得预柱固定相易于更换，便于维护，且进一步减小了死体积，降低了样品的损失。但是，在这些系统中，由于预柱与分离柱都是采用的反相C18作为固定相，它们之间的死体积对分离的影响较大，所以仍然存在分离时间延迟、峰展宽和分离窗口变窄等缺陷。而且由于磷酸肽亲水性强，使用C18预柱有可能引起较大的样品损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易操作、维护方便、无需增加额外硬件装置，并可实现了纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种强阴离子预柱在磷酸化肽自动化分析过程中的应用。

所采用的分析的系统包括自动进样器、两位六通自动切换阀、微型三通阀(3)和微型四通阀，自动进样器通过微型三通阀与强阴离子预柱的一端相连，微型三通阀的另一个接口与两位六通自动切换阀的④位；

强阴离子预柱的另一端通过微型四通阀与反相C18分离柱相连，四通阀的第三个接口与两位六通自动切换阀的②位，四通阀的第四个接口连接提供电喷雾喷针的所需电压的单电极铂丝，单电极铂丝另一端与质谱仪相连；

反相C18分离柱的另一端为电喷雾喷针状，其与质谱仪连接；

两位六通自动切换阀的②位通过毛细管a与微型四通阀连接；两位六通自动切换阀的④位通过毛细管b与微型三通阀连接；①位和⑤位为废液出口，③位堵死。

原理：以强阴离子固定相为预柱，反相固定相为分离柱，使磷酸化肽样品在高pH的条件下富集在强阴离子预柱上，然后通过改变pH值或盐浓度将样品洗脱到反相分离柱，而后进行分离分析。本发明的特征是。

本发明的有益效果：

本发明是一种利用强阴离子预柱装置作为磷酸化肽样品分析的自动进样系统，推动了采用纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联用进行大规模高效鉴定磷酸化肽方法的发展。本发明采用强阴离子交换预柱和反相C18分离柱作为自动化分离分析的系统，成功解决了预柱和分离柱均为反相C18固定相系统的不足，采用反相分离柱分析蛋白酶解物样品，进一步减少了非磷酸化样品的干扰，并提高了鉴定磷酸化蛋白的效率。该系统易操作，维护方便，无需增加额外硬件的装置。

附图说明

图1为本发明分析系统装置构建及操作流程示意图之一。

图2为本发明分析系统装置构建及操作流程示意图之二。

图3为利用本发明分析系统检测分析鼠肝蛋白酶解物图。

图4为利用现有技术检测分析鼠肝蛋白酶解物图。

标号为：2.自动进样器，3.微型三通，4.微型四通，5.两位六通自动切换阀，6.质谱，7.预柱固定相，8.整体柱塞，9.强阴离子预柱，10.反相C18分离柱，11.电喷雾喷针，12.单电极铂丝，13.毛细管b，14.毛细管a。

具体实施方式

下面结合附图说明对本发明作具体叙述。

1.强阴离子预柱系统的构建

具体应用过程如下，

1)量取10cm长、内径为100μm的毛细管，按文献方法(Xie，CH等，“Electrochromatographic evaluation of a silica monolith capillary column forseparation of basic pharmaceuticals”，《Electrophoresis》，P790-797(2005年)制作1-2mm的整体柱塞。方法如下：1.06g聚乙二醇溶于10ml 0.01M的醋酸中，缓慢滴加4.5ml四甲氧基硅烷。混合物在冰浴中剧烈搅拌40分钟形成溶胶。将溶胶充满毛细管，用硅橡胶封住毛细管册两端后放置于柱温箱中，40℃反应24小时。待反应完成后，用水冲洗即可。毛细管内用粒径5μm、孔径200大小的强阴离子固定相(Thermo公司Hypersil-5-120、Applied Biosystems公司Porous 20HQ)填充长约2cm的预柱；

2)量取20cm长、内径为75μm的毛细管，其一端烧制成约5μm的尖端，作为电喷雾喷针使用。毛细管内用粒径5μm、孔径100大小的反相C18固定相(Michrom BioResources公司Magic C18AQ、Daiso公司ODS-AQ)填充长约12cm的分离柱。

2.自动化分析的系统：(如图1、图2所示)包括自动进样器(2)、两位六通自动切换阀(5)、微型三通阀(3)和微型四通阀(4)，自动进样器(2)通过微型三通阀(3)与强阴离子预柱(9)的一端相连，微型三通阀(3)的另一个接口与两位六通自动切换阀(5)的④位，微型三通阀(3)的第三个接口与自动进样器(2)相连，自动进样器(2)连有高效液相色谱(1)；

强阴离子预柱(9)中采用强阴离子作为预柱固定相(7)，并且强阴离子预柱(9)近微型四通(4)端通过整体柱塞(8)将其封堵。

强阴离子预柱(9)的另一端通过微型四通阀(4)与反相C18分离柱(10)相连，微型四通阀(4)的第三个接口与两位六通自动切换阀(5)的②位，微型四通阀(4)的第四个接口连接提供电喷雾喷针(11)的所需电压的单电极铂丝(12)，单电极铂丝(12)另一端与质谱仪(6)相连；

反相C18分离柱(10)的另一端为电喷雾喷针状(11)，其与质谱仪(6)相连；

两位六通自动切换阀(5)的②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接；两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接；①位和⑤位为废液出口，③位堵死。

具体过程如下：通过自动调节两位六通自动切换阀来控制进样和分离模式。

1)预平衡，两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四阀(4)通连接，②位与③位相通，使流动相充满系统，预平衡自动进样系统；

2)上样，④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与③位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与①位相通，样品上载到强阴离子预柱(9)；

3)强化洗脱，两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与③位相通，上载到强阴离子预柱(9)的样品通过洗脱进入反相C18分离柱(10)；

4)梯度洗脱并检测，两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)，②位与③位相通，样品在反相C18分离柱(10)中梯度洗脱，洗脱液通过反相C18分离柱(10)末端的电喷雾喷针(11)进入质谱(6)检测。

实施例1

采用本发明自动化分析的系统对富集后的鼠肝磷酸化肽样品进行分析

1)鼠肝蛋白酶解物的制备：1mg鼠肝蛋白，溶于含有6M盐酸胍的20mMTris缓冲液(pH8.1)中，加入二巯基苏糖醇(终浓度5Mm)，37℃水浴2小时，然后加入碘代乙酰胺(终浓度10mM)，室温暗处放置1小时。再用20mM Tris缓冲液稀释，使胍浓度降至1M以下。最后按酶∶蛋白(1∶25)的质量比加入序列纯胰蛋白酶，37℃酶解反应20小时。采用反相C18固相萃取柱除盐后冻干，得鼠肝蛋白酶解产物。

2)ZrO₂纳米材料特异性富集和纯化磷酸化肽

(1)鼠肝蛋白酶解产物用50％ACN，10％HAC(pH＝2-3)溶解作为上样液。

(2)取100μL的ZrO₂纳米材料，加入100μL的酶解上样液，室温下平衡30分钟，然后在35000×g下高速离心，弃去上层清液。

(3)加入400μL的50％ACN，10％HAC，振摇清洗ZrO₂纳米粒子5分钟，然后在35000×g下高速离心，弃去上层清液。

(4)加入400μL的50％ACN，振摇清洗ZrO₂纳米粒子5分钟，然后在335000×g下高速离心，弃去上层清液。

(5)加入200μL的NH₃.H₂O超声清洗ZrO₂纳米粒子5分钟，然后在35000×g下高速离心，收集上层清液。

(6)将收集的上层洗脱后的NH₃.H₂O放入冷冻干燥机浓缩，冻干待分析。

3)磷酸化肽段混合物运用本发明自动化进样系统分析：梯度洗脱并检测，两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与③位相通，样品在反相C18分离柱(10)中梯度洗脱，洗脱液通过反相C18分离柱(10)末端的电喷雾喷针(11)进入质谱(6)检测。

(参见图1、图2)1)预平衡，两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与③位相通，此时反相分离毛细管柱(10)上流速为200nL，流动相的组成为10mM乙酸铵(pH 7.0)，流动相自自动进样器(2)进入在分流后使流动相充满系统，预平衡自动进样系统10分钟；

2)上样，④位通过毛细管b(13)与微型三通连接，④位与③位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与①位相通，此时流速为2μL/min，流动相的组成为10mM乙酸铵(pH 7.0)，流动相均从毛细管a(14)排空毛细管流出，样品通过自动进样器(2)进入分流后，将20μL的样品上载到强阴离子预柱(9)上，进样时间15分钟。

3)强化洗脱，两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与③位相通，此时流速为200nL，流动相组成为500mM乙酸铵(pH2.6)，上载到强阴离子预柱(9)的样品通过强阴离子的洗脱进入反相C18分离柱(10)，洗脱时间5分钟。

4)梯度洗脱并检测，两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与③位相通，此时流速为200nL，样品在反相C18分离柱(10)中梯度洗脱，梯度从0.1％甲酸至5％乙腈/0.1％甲酸，共5分钟；然后从5％乙腈/0.1％甲酸至35％乙腈/0.1甲酸，共60分钟；再从35％乙腈/0.1甲酸升至0.1％甲酸至80％乙腈/0.1甲酸，共10分钟；最后从80％乙腈/0.1甲酸至0.1％甲酸，共15分钟。整个分析过程共90分钟，洗脱液通过反相C18分离柱(10)末端的电喷雾喷针(11)进入串联质谱(6)检测(参见表1)。

表1

(2)结果表明强阴离子预柱分离系统分析鼠肝磷酸化肽样品的色谱分离窗口是69分钟(参见图3)，结果共有97个磷酸化肽段被鉴定。

比较例

1)鼠肝蛋白酶解物的制备及ZrO₂纳米材料特异性富集和纯化磷酸化肽与实施例1相同。

2)磷酸化肽段混合物运用反相预柱系统自动化进样及分析

按Yi，EC等“A microcapillary trap cartridge-microcapillaryhigh-performance liquid chromatography electrospray ionization emitterdevice capable of peptide tandem mass spectrometry at the attomole levelon an ion trap mass spectrometer with automated routine operation”，《RapidCommunication.Mass Spectrometry.》，P2093-2098(2003年)，将实施例1中强阳离子预柱(9)换为反相C18预柱(10)进行实验。

1)两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与③位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与①位相通，此时流速为2μL/min，流动相的组成为0.1％甲酸(pH 3.0)，流动相均从毛细管a(14)排空柱流出，20μL的样品上载到反相预柱上，进样时间15分钟。

②两位六通自动切换阀(5)的④位通过毛细管b(13)与微型三通阀(3)连接，④位与⑤位相通，②位通过毛细管a(14)与微型四通阀(4)连接，②位与③位相通，流速为200nL，在分流后采用梯度洗脱法将样品分离和串联质谱检测。梯度洗脱从0.1％甲酸至5％乙腈/0.1％甲酸，共5分钟；然后从5％乙腈/0.1％甲酸至35％乙腈/0.1甲酸，共60分钟；再从35％乙腈/0.1甲酸升至0.1％甲酸至80％乙腈/0.1甲酸，共10分钟；最后从80％乙腈/0.1甲酸至0.1％甲酸，共15分钟。整个分析过程共90分钟。

(2)结果发现富集后的鼠肝磷酸化肽样品使用反相预柱分离系统发生非常严重的延迟分离，其色谱分离窗口为50分钟(参见图4)，结果只有65个磷酸化肽段被鉴定。

结果说明本发明的强阴离子预柱分离系统分离磷酸肽样品的能力与现有技术反相预柱分离系统相比其分离分析效率明显优于反相预柱进样系统。