磷酸化肽受体设计、合成及与磷酸化肽作用机制研究

摘要

蛋白质磷酸化过程对生物体的诸多生理活动都起到重要的调控功能，是生物界最普遍也是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，被形象地称为“分子开关”。CTD作为RNA聚合酶Ⅱ最大末端羧基结构域，由于其高度保守性和可逆磷酸化的特性使其具有重要的生物学功能。因此，针对CTD肽设计出高选择性识别的受体有利于理解肽的磷酸化—去磷酸化过程，进而调控特定的生理活动。
　　在本组前期工作中考察了合成受体ZnDpaG与CTD肽的结合情况。为进一步考察合成受体ZnDpaG与磷酸化肽的相互作用机制，本文选取了具有不同序列的磷酸化模型肽，采用等温滴定微量热法考察了配位型受体ZnDpaG与磷酸化肽的结合常数，研究了模型肽中磷酸基团数量、密度以及位等因素对多肽与受体间结合强度的影响。研究结果表明:ZnDpaG受体对双磷酸化肽结合能力显著高于单磷酸化肽，其结合常数可提高10-40倍，且随着两个磷酸基团的距离接近，结合作用越强;而磷酸基团的位置显著影响受体与单磷酸化肽的结合强度，当磷酸基团与端羧基间距离与ZnDpaG中作用位点匹配时，多肽可与受体间同时存在配位及静电的协同识别作用，可显著提高其结合常数。本研究结果对于进一步优化磷酸化肽受体结构设计，实现肽与受体间高效、灵敏性识别提供了一定的理论基础。
　　为解决ZnDpaG溶解性差的缺点，本文在ZnDpa基团上成功引入β环糊精，合成了受体ZnDpaCD，不但提高了受体的溶解度，同时也实现了β环糊精与ZnDpa对CTD肽的协同识别的目的，结合常数最高可达1.49E5，且可有效区分CTD肽磷酸化与非磷酸化形式，对不同磷酸化形式具有一定的区分能力;采用核磁技术，通过一维1H谱，31P谱以及二维COSY，ROESY等，研究了受体ZnDpaCD与CTD肽的作用位点为受体Dpa基团，肽的磷酸根、酪氨酸，进而确定了主客体的作用模式为肽与受体相互靠近，并在环糊精外部产生疏水、静电、配位等作用，协同实现了主客体间的识别，为进一步设计更精确的人工受体提供了理论依据。
　　另一方面，本文首次运用了ITC的表征方法观察到了Zn(OH)2溶解度增加的现象。在利用ITC研究Zn2+与Dpa结合强度时，发现所得拟合曲线出现明显的热量增加现象，综合文献及实际体系，认为是由于Zn2+与Zn(OH)2平衡被打破，Zn(OH)2粒径减小，溶解度增加所致，采用TEM及DLS等表征手段，验证了上述推测的正确性，并考察了pH，温度等因素对这一现象的影响。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

第一节 磷酸化肽的研究意义

第二节 磷酸化肽人工受体的研究意义

第三节 磷酸化肽人工受体的研究进展

1．3．1 多胺类受体

1．3．2 胍盐类受体

1．3．3 Dpa配位型受体

1．3．4 印迹型受体

第四节 课题提出

第二章 合成受体ZnDpaG与模型肽相互作用研究

第一节 引言

第二节 材料仪器与实验方法

2．2．1 材料与仪器

2．2．2 实验方法

第三节 实验结果与讨论

2．3．1 受体与双磷酸化肽的相互作用

2．3．2 受体与单磷酸化肽的相互作用

2．3．3 受体与疏水单磷酸化肽的相互作用

第四节 本章小结

第三章 环糊精-Dpa型受体与CTD肽相互作用研究

第一节 引言

第二节 受体制备及表征

3．2．1 材料及仪器

3．2．2 6-单-对甲苯磺酰基-β-环糊精的合成与表征

3．2．3 6-单-2，2-二吡啶甲基氨-β-环糊精(DpaCD)的合成及表征

3．2．4 ZnDpaCD的合成与表征

第三节 受体ZnDpaCD与CTD肽的热力学研究

3．3．1 材料及仪器

3．3．2 实验方法

3．3．3 结果与讨论

第四节 受体ZnDpaCD与CTD肽识别作用位点研究

3．4．1 材料与仪器

3．4．2 实验方法

3．4．3 结果与讨论

第五节 本章小结

第四章 氢氧化锌微粒增溶效应研究

第一节 引言

第二节 材料仪器及实验方法

4．2．1 材料

4．2．2 仪器

4．2．3 实验方法

第三节 实验结果与讨论

4．3．1 Dpa滴定Zn(NO3)2的ITC测试

4．3．2 Zn(NO3)2对Dpa的ITC滴定

4．3．3 pH对滴定热增效应的影响

4．3．4 温度对滴定热增效应的影响

4．3．5 粒径对滴定热增效应的影响

4．3．6 不同缓冲物质对滴定热增效应的影响

4．3．7 其他金属离子体系的热增现象考察

第四节 本章小结

第五章 全文结论

参考文献

致谢

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果