酶辅助可溶性咖啡生产

摘要

本发明涉及不含显著含量的油和不溶性颗粒的咖啡饮料组合物，所述组合物包含(a)以咖啡固形物的总重量计至少15％的总甘露糖，其中游离甘露糖含量占总甘露糖含量的50％(重量)以下，和(b)以总咖啡固形物计1,000ppm以下的5－羟甲基糠醛。本发明还涉及生产可溶性咖啡提取物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将焙炒和磨碎咖啡与水混合，(ii)加入水解酶，(iii)湿磨至约10至约250μm的平均颗粒大小，(iv)将反应混合物暴露于约20℃至约90℃、优选约50℃至约60℃范围内的温度对其进行处理，和(v)使反应混合物循环通过错流半透膜分离装置，可溶性咖啡提取物作为透过液从中获得。

说明书

发明领域

本发明涉及在水解酶辅助下生产可溶性咖啡提取物的方法和涉及通过这个方法获得的咖啡产品。

发明背景

市售的可溶性咖啡通常通过分阶段热加工来生产，这种热加工是润湿、提取和水解阶段的组合，能使大部分的焙炒和磨碎咖啡固形物得到溶解。为实现热水解所要求的非常高的温度，会导致产生杂味，且致使成本和资金费用高。

已报道了使用糖酶酶加工法制造可溶性咖啡以图改进产品质量和工艺经济性的各种尝试。

JP-74012710涉及用含纤维素酶溶液处理咖啡豆进行的速溶咖啡生产。真菌如Rhizopus niveus在发酵液中产生的半纤维素酶混合物用离子交换树脂进行纯化，以分离掉不需要的杂质如蛋白酶和淀粉酶。然后用纯化的半纤维素酶混合物来使干磨焙炒咖啡溶解。

美国专利4,983,408描述了这样的工艺：将焙炒和磨碎咖啡在220℃-250℃下蒸汽处理1-10分钟后快速降压以使咖啡活化，然后用蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、木质素酶、纤维二糖酶和脂肪酶这几类酶中的至少一种酶在30℃-60℃下处理1-6小时。这种“喷蒸汽”活化法众所周知用于木质纤维素生物质进行酶处理前的预处理，在例如美国专利4,133,207和4,461,648中有描述。这个方法会产生热损害副产物，且其得率并非最优，不超过常规热水解技术的得率。

专利SU 1597151描述了制备咖啡提取物的方法，其中将咖啡用90℃-100℃热水在pH 4.7-5.0下提取3-5分钟，产生初级提取物。将该提取物分离，固形物流分进行β-葡聚糖酶和果胶酶复合酶水解，酶添加量为0.1-1％每100g干物质，在43℃-63℃、pH 4.7-5.0下连续搅拌水解0.5-1小时。然后将这样产生的次阶段提取物与第一(初级)咖啡提取物合并。这种方法据称能使可溶性咖啡的质量提高，且值得注意的是能耗降低了。

日本专利申请JP 2005-065558A描述了改进焙炒咖啡粉碎(pulverisation，一种用以降低固体的颗粒大小的方法)的效率的方法，该法目的是获得能容易分散和/或悬浮于热水中以制作口感爽滑的饮料的焙炒和磨碎咖啡颗粒。将焙炒咖啡粗磨至颗粒大小为500-1,000μm，然后调成水基浆液与酶(通常为甘露聚糖酶)接触来减少焙炒和磨碎咖啡水悬浮液的粘度，以便实现更为有效的粉碎或颗粒大小降低。接着将咖啡悬浮液在高达130℃的温度下加热使酶失活，然后再进行粉碎加工。粉碎加工最终使颗粒大小降低至1-10μm。没有使用到膜分离步骤，且杂味如5-羟甲基糠醛的减少在该专利中没有公开说明。

上述各种工艺尽管有其优点，但也有以下一些缺陷：1.它们效率低下的咖啡磨碎物预处理如干磨造成总得率并非最优；2.蒸汽爆破会造成另外的不需要的热降解和伴随产生的杂味；3.酶没有得到从终产品分离或再利用；4.随着反应的进行，有更小的糖类积累，这些糖类会对酶施加“反馈抑制”，降低反应速度和总转化率。

本发明的目标是提供没有上述缺陷的酶辅助可溶性咖啡生产方法。

发明概述

本发明涉及能同时使得率最优和使热降解减少的可溶性咖啡提取物生产方法，该法包括以下步骤：

(i)将焙炒和磨碎咖啡与水结合，

(ii)加入水解酶，

(iii)湿磨至平均颗粒大小为约10至约250μm，其中优选90％的颗粒其大小在150μm以下，

(iv)将该反应混合物暴露于约20℃至约90℃、优选50℃至约60℃范围内的温度，对其进行处理。

(v)使该反应混合物循环通过错流半透膜分离装置，在该装置中可溶性咖啡提取物作为透过液获得。

本发明还涉及通过这个方法获得咖啡产品，该产品以总可溶性咖啡固形物计其5-羟甲基糠醛(5-HMF)含量减少，为约1,000ppm以下，总甘露糖含量超过15％。

发明详述

本发明涉及通过将咖啡豆或磨碎咖啡或预提取咖啡磨碎物与水解酶进行微细湿磨来产生咖啡提取物的方法，所述水解酶优选为糖酶或蛋白酶(例如葡聚糖酶和甘露聚糖酶)或它们的混合物，该混合物优选包含甘露聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，且其中所述酶优选通过使用膜装置保留在反应区中，使得最终提取物基本上不含酶、油或颗粒物，所述酶最后可再使用。这个方法可以以分批方式、连续方式或半连续方式实施，以酶反应和膜分离同时和偶联进行的方式实施，或者以该反应和分离不同时进行的方式实施。

这个酶促方法的潜在优点是风味改进(因为避免了高温方法所产生的杂味)、得率可能更高及运营和资金成本可能更低。另外，本发明的方法与现有技术相比作出了以下几个改进：1.通过采用咖啡固形物和高效水解酶的微细湿磨，可实现与之前所描述现有技术下的加热方法和酶促方法相比更有竞争力或更优越的溶解作用。2.酶被有效固定化在反应空间中，因此酶不会出现在产品中，被保留的酶可多次重复使用，且该方法中油和颗粒材料得以与咖啡提取物分离开来。3.由于酶不会出现在产品中，可免去酶失活步骤。

本发明方法可应用于新制的焙炒和磨碎咖啡，或者应用于之前已用水提取过的焙炒咖啡磨碎物。关于实际提取方法可参考Sivetz，Desrosier的“Coffee Technology”(1979，The AVI publishing co.Inc.)。

还可以将本发明方法应用于通过常规可溶性咖啡加工获得的磨碎物。在该加工方法中，通常将焙炒咖啡磨碎并用水进行多阶段(热)提取。参考方法可见于Sivetz，Desrosier的“Coffee Technology”(1979，The AVI publishing co.Inc.)或BP 0 489 401。本领域常用两阶段操作，其中第一阶段包括将咖啡磨碎物润湿，回收香味和提取易溶成分(如咖啡因、矿物质、单糖)。第二阶段通常是水解阶段，其中大的咖啡生物高分子和结合成分被分解成较小的水溶性分子和成分。在第一阶段中，通常用100℃或100℃以下的水提取焙炒咖啡。这一提取过程后的磨碎物称为“常压磨碎物(atmospheric grounds)”，其然后用温度在140℃-180℃之间的过热水提取，或者按EP 0 363 529中所述的方法，使用约220℃的水温度实现甘露聚糖(天然咖啡生物高分子之一)的水解。过热提取后的部分提取磨碎物通常称为“过热磨碎物”。

如果将本发明方法应用于部分提取磨碎物，可将平均颗粒大小约900微米的焙炒和磨碎咖啡加入到装有水的带夹套搅拌罐中进行提取，其中固形物与水的比例为约1∶5。将所得浆液搅拌，间接加热至约140℃以下、优选约85℃至约90℃范围内的温度，并在此温度下保持约30分钟。然后从容器卸出浆液，用过滤器将随后的(subsequent)磨碎物和提取物分离。将所产生的提取物与用本发明方法从部分提取磨碎物产生的提取物合并。

本发明方法一般来说可应用于包含焙炒豆的焙炒和磨碎咖啡，该焙炒豆被磨至平均颗粒大小为约500至约5,000μm之间、优选约500至约900μm之间。

另外，本发明方法中可加入风味管理预处理工艺步骤，以在提取和/或水解阶段之前先回收咖啡的芳香化合物或芳香成分。有用的工艺方法包括但不限于EP 0 489 401中描述的工艺方法。实际的操作包括将焙炒和磨碎咖啡用水以约1∶0.5(重量)的比例在容器中进行润湿。给容器施加真空(例如约150mbara)，然后将低压蒸汽(大约2.5barg)施加到这一堆润湿磨碎物达约4-8分钟，以使芳香化合物从焙炒和磨碎咖啡中蒸发出来。将抽提出来的挥发性化合物例如在约5℃下冷凝，留待回加到提取物或提取的固形物中。

本发明方法可在已如上所述进行了低蒸汽吹扫提取挥发性风味成分的焙炒咖啡上实施。

将本发明方法应用于本领域技术人员公知具有可水解物质的任何类型咖啡磨碎物，如脱油咖啡磨碎物、脱咖啡因咖啡磨碎物等，都落入本发明的范围内。

在本发明方法的一个步骤中，将新制的或预处理过的焙炒咖啡豆或者得自初级常压和/或过热热提取的提取磨碎物湿磨至平均颗粒大小约10至约250μm，优选约15至约75μm。也可便利地分阶段湿磨咖啡，例如湿法或干法预磨至200-500微米平均颗粒大小(MPS)，然后微细湿磨至所需的约10-200μm范围，但是如上所述在单个阶段中完成湿磨至优选范围也是可接受的。不管阶段数多少，都将湿磨调整到能导致产生累积颗粒大小分布，在该分布中90％的颗粒的大小在150μm以下，优选100μm以下，更优选50μm以下。因此，根据本发明，将多重模态分布(multi-modal distribution)分阶段或连续磨至所需的颗粒大小分布。

要指出的是，干磨不能产生所需的好处。出乎意料的是，本发明方法的关键之处是将焙炒和磨碎咖啡进行湿磨。湿磨的优点在实施例8中进行明确定量。

为进行湿磨和随后的酶提取，将磨碎物用水稀释至约5-40％干物质。第一研磨步骤可使用转子/定子磨机，例如Ross Model ME-430XS-6(Charles Ross&Sons，Hauppage NY，USA)，不过其它磨机也适合，例如胶体磨机如Charlotte SD-2(Bradman-Lake，Charlotte WC，USA)或Dispx DRS-2000-5(IKAUSA)。一般来说，任何能够湿磨至所需颗粒大小范围的设备都可接受，这可包括转子-定子装置组合、带研磨介质的介质磨机或其它剪切装置如超声装置和空化装置。此外，对于特定的设备类型，可通过操作各种参数来改变其性能和所得的咖啡颗粒大小，所述参数如转速、咖啡的通过速度、介质的大小和形状(例如在微型磨机(micro mill)中)以及筛子大小(转子/定子或类似剪切装置中)。

在这个第一湿磨步骤中，磨碎物的平均颗粒大小降低到约100至约200μm。

然后将这磨碎的咖啡浆液在第二步骤中进行湿磨，例如在带1-2mm大小的氧化锆球的水平介质磨机如KDL-Pilot Dynomill(PremierMills，NY)中进行。其它合适的磨机例如是Attomill(Peterson Machine，Ontario)或Enco Zinger SV-4(Morehouse Cowles)。本文给出的磨机的选择并不意在限制本发明的范围。

在这个第二湿磨阶段中咖啡磨碎物的平均颗粒大小进一步被降低到约10-150μm、优选15-75μm的大小范围。

湿磨过的咖啡的颗粒大小分布是优选约90％或95％的颗粒＜150μm，更优选＜100μm，最优选＜50μm，使得咖啡细胞被破裂，酶促反应得率最大化。这一颗粒大小分布，不管是应用了多少个湿磨阶段获得，也不管是用了哪个特定的湿磨机获得，都能使酶促水解得以有效进行。因此认为它是本发明方法整个过程中所达到的累积颗粒大小分布。

然后将所获得的被研磨至优选颗粒大小范围的咖啡浆液用水解酶在酶有活性的温度下进行酶反应处理，所述温度通常在约25℃至约90℃的范围，优选约50℃至约60℃，处理时间为约1至约24小时，优选约4至约24小时。酶可在将磨碎物湿磨之前或湿磨过程中加入，以使咖啡浆液和酶的紧密混合和使得率得以增加。当然，也可以在湿磨之后或者上述两个湿磨步骤之间加入酶。

可用于本发明方法的酶是水解酶，优选糖酶。优选的是微生物酶、植物来源的酶特别是咖啡来源的酶。优选的酶是甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、纤维素酶特别是葡聚糖酶以及它们的任何组合，这些酶可获自多个来源，如Novozymes(Franklinton KY，USA)或Iogen(Ottawa，Canada)。其它有用的酶是蛋白酶。此外，也可使用在90℃以上有活性的嗜极菌酶(可从Thermotoga sp.获得)。优选的是甘露聚糖酶或者能协同作用的甘露聚糖酶和纤维素酶组合。还优选甘露聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶组合。另外还优选的是，酶基本上不含二糖酶即甘露二糖酶和纤维二糖酶。

在一个可能的批式操作方式中，酶促反应基本上完成后，将混合物进行粗分离，例如离心或带式过滤，除去大部分的不溶性固形物。分离出的提取物仍含有微细颗粒物、油和酶蛋白，将其循环通过错流膜装置，除去所有的不溶物，且如下所述还可除去酶。大部分的或所有的酶保留在膜截留液中，可循环到反应中。

在一个优选的操作方式中，在酶反应过程中不断移出半透膜透过液，即一部分的反应混合物连续循环通过错流半透膜分离池。这个过程可以以半连续方式操作，其中将透过液进行移出，直到反应容器中的体积降低到粘度或压降变高的地步为止。到了这个地步时，放出一些截留液，投放新制的咖啡浆液，加入一些新酶。放出的截留液可弃去，或者可洗涤回收酶，然后将酶再使用。在剩余(未放出)截留液中的酶得到保持和再使用。

或者，可将新投放浆液与一些酶一起连续加入到投料罐，同时从循环液流中抽除相等的体积。

无论如何，以半连续或连续操作方式运行本发明方法，都可使溶解的成分得以渗透出反应区，然后再作进一步的分解。

任何适合的膜装置都可用作错流半透膜分离池，如孔径大小优选0.8μm以下的微滤或超滤膜。该装置可以采取中空纤维、螺旋缠绕组件或滤芯(cartridge)、平板等的形式。出乎意料的是，这种宽孔膜在微细的咖啡固形物存在下能保持大部分或全部的酶。如果需要将酶完全除去，在一个实施方案中，将错流膜微滤和超滤串联使用，其中第二阶段超滤膜的分子量截值为20,000至约100,000，优选约30,000至约50,000。例如，AGT(Pall Corp.，East Hills，NY)中空纤维微滤膜滤芯在本发明方法中是有用的膜装置。

如果已用本发明方法处理了之前已用水提取过和/或已进行热水解的焙炒和磨碎咖啡所残留的磨碎物，可将本发明方法获得的提取物与之前获得的提取物合并。

在本发明的一个优选实施方案中，磨碎物在第一酶提取之后进行后处理。这个后处理包括用半乳聚糖酶进行的第二酶促反应和/或用温度在100℃-180℃之间的提取液进行温和热水解，在该第二酶促反应中优选半乳聚糖酶在约有75％的甘露聚糖已被水解之后加入。以常规分离步骤和/或根据本发明膜分离法对磨碎物进行了分离之后，可将所获得的提取物与其它提取物合并。

膜分离优选在膜分离池投料液中存在至少1-10％的微细不溶性咖啡固形物的情况下进行。

无论如何，用本发明方法获得的提取物其所含的低分子量糖类更少，这些糖类会给产品赋予不合需要的甜味和粘性。另外，由于水解反应是在水解产物不会发生进一步的化学反应(如焦糖化反应或美拉德反应)的低温条件下进行，提取物不含高温方法所产生的杂味(如但不限于5-HMF)。本领域技术人员公知，高水平的5-HMF会赋予令人不快的酒味或类似干草的味道(Coffee Flavour Chemistry，Ivon Flament，Wiley 2002第229页)。提取物的5-HMF含量以总可溶性咖啡固形物计，优选低于1,000ppm，更优选低于500ppm，甚至更优选低于250ppm，最优选低于150ppm。专业品尝师判定，通过本发明方法获得的提取物不呈现常规速溶咖啡提取物所特有的酒味和/或焦糖化后味。

5-HMF是本发明方法的质量改进的优选标志，因为它是相对非挥发性成分，因此在蒸发和干燥阶段中不会失去。但是，在其它更具挥发性的杂味上也观察到相同的改进，这些更具挥发性的杂味是通过热加工的高温阶段中水解产生的低聚物的化学降解反应而产生的，比如醛类。例如，本发明提取物的总醛类含量为30μg/g固形物以下，而在热水解提取物中它通常为1400μg/g以上。

此外，所获得的提取物不含酶残留物。出乎意料地发现，尽管膜的孔径大小会让酶渗出，但是酶与湿磨咖啡颗粒发生相互作用到了它不会通过渗过膜的程度，或者渗过膜的程度远低于预期。

提取物以可溶性咖啡固形物的总重量计还优选包含至少约15％总甘露糖，其中游离甘露糖含量占总甘露糖含量的50％重量以下，优选30％以下，更优选20％以下。最后，提取物以总可溶性咖啡固形物(DM，即干物质)计，可含有高达10％的纤维寡糖。

本发明的优点可总结如下：

1.溶解得率显著高于现有技术下的加热或酶促工艺方法，以阿拉比卡咖啡豆(Arabica bean)计焙炒和磨碎咖啡的溶解得率高达65％。总甘露糖含量以总可溶性咖啡固形物计为至少15％。

2.对咖啡进行低温“活化”(不采用会产生杂味的蒸汽爆破或其它高温处理)。5-HMF水平低，加工风味特性(processed flavour character)减少。

3.物质组成优异：单糖含量低。

4.产品不含杂质(不可溶物、酶残留物)。

5.酶可以容易地循环，从而显著降低成本。

6.在半连续或连续操作中，在分离咖啡可溶物的同时将酶保留在反应区中。

本发明方法获得的提取物用来制作咖啡饮料。首先，咖啡饮料组合物没有显著量的油和不可溶颗粒物。所谓“没有显著量的油”是指咖啡油的水平以可溶性咖啡固形物重量计低于约2％，更优选低于约1％。它包含如上所述的低水平5-HMF，且它优选包含至少15％重量的咖啡固形物总甘露糖，其主要部分如上所述并不由甘露糖组成，而是由聚合度2-8之间的甘露寡糖组成。咖啡饮料组合物优选还包含纤维寡糖。

在常压磨碎物用作本发明方法的投料的情况下，可将所产生的提取物与常压提取阶段获得的提取物合并。各提取物是根据每个阶段所得的提取焙炒得率(extracted roasted yield)的比例进行合并的。然后将合并的提取物浓缩，调香和干燥，这是本领域的常规操作。

咖啡饮料组合物可进行脱水，如可溶性咖啡或干式混合组合物(dry mix composition)，或者它可以是即饮咖啡产品、液体混合组合物(liquid mix composition)、冷冻组合物或液体浓缩组合物。本发明组合物也可用于非饮料应用，如即食甜点(instant dessert)或糖食产品等。

从可溶性咖啡提取物制备这些咖啡组合物的方法是本领域技术人员公知的。

现通过描述本发明优选实施方案的具体实施例对本发明进行阐述。这些实施例并不意在限制本发明的范围。

实施例

实施例1

本发明的加工阶段

将哥伦比亚-中美洲-巴西混合阿拉比卡咖啡豆在Probat鼓式焙炒机中焙炒至颜色6.5Lange。将焙炒过的咖啡豆用Mahlkoenig板磨机(plate mill)磨至平均颗粒大小为900微米。这些焙炒咖啡豆是所有以下实施例的原料，除非另有说明。

将焙炒和磨碎咖啡加入到装有水的带夹套搅拌罐(工作容积200升)。固形物与水之比为1∶5(20kg咖啡∶100kg水)。将所得浆液搅拌，间接加热至85℃-90℃的温度，并在此温度下保持30分钟。然后用供应到夹套的10℃冷水将浆液冷却至25℃。将浆液从罐中卸出，用粗滤网分离随后的磨碎物和提取物。

使用这个方法，按可溶性固形物测量大约有25％重量的咖啡豆被提取。

初级常压提取后的被提取磨碎物含有大约30-35％DM。将这些磨碎物以两阶段方法进行研磨。将磨碎物用水稀释至大约10％DM的目标含量。第一研磨阶段使用Ross Model ME-430XS-6(Charles Ross&Sons，Hauppage NY，USA)转子/定子磨机。将29.09kg稀释水放入投料罐中，以11-19lpm(升/分钟)的速度循环通过磨机。用螺旋投料机在5分钟时间里将15.86kg的咖啡磨碎物逐渐加入到循环水中，所有咖啡都加入后继续进行研磨大约2分钟。使冷却水循环通过投料罐的夹套，以保持浆液温度低于40℃。这一转子/定子研磨过程将平均颗粒大小(MPS)降低至175μm(目标大小100-250μm)。收集到的总浆液为45.25kg，比投料稍高，这是由于设备管道中的水所致。

颗粒大小用以下方法测定：将咖啡物料用纯化的MilliQ^TM水进行约1∶10稀释，在400rpm(转/分钟)下搅拌至少15分钟。然后将所得分散液滴加到Horiba LA-900激光衍射颗粒大小分析仪的样品槽中，直到变暗淡至92％光透过率以下。颗粒大小是在最低速度下1分钟和3分钟的循环和搅拌后测量的。在本说明书中，颗粒大小分布用平均颗粒大小(MPS)来描述，后者定义为D43，即体积加权平均。

然后将Ross磨机研磨过的咖啡浆液投料到第二阶段的带1-2mm大小的氧化锆球的水平介质磨机(KDL-Pilot Dynomill(Premier MillsNY，USA))。将磨机投料罐中的咖啡浆液保持搅动以防止磨碎物沉淀，并用蠕动泵(Watson-Marlow)以10％总磨机体积/分钟的速度投料到磨机。使冷却水循环通过夹套将磨机冷却，以保持出口温度低于45℃。经过微细研磨的咖啡浆液其MPS为57μm(目标范围15-75μm)。

将12.27kg的微细研磨浆液放入锥底带夹套密闭不锈钢储罐中，同时进行刮面式搅动(scraped-surface agitation)。将物料加热至55℃，加入酶即β-甘露聚糖酶和纤维素酶(β-葡聚糖酶)组合，也即以10％DM咖啡浆液计加入0.0275％Mannaway 25L和0.0275％RS-103，前者为单成分细菌β-甘露聚糖酶(Novozymes，Franklinton，NC USA)，后者为含有β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶活性的多成分真菌(里氏木霉(Trichoderma reesei))制剂(Iogen，Ottawa，Canada)。将浆液在55℃下温和搅动保持16小时，以进行酶反应。反应过程中抽取几份样品。反应过程结束时，将混合物加热至90℃，然后立即冷却至35℃。从罐中最终回收到10.59kg反应过的浆液。此浆液含有9％总干固形物和4.81％溶解固形物，后者是通过使浆液等分试样滤过0.7μm GMP针头过滤器测量的。浆液和滤液中的固形物用CEM微波分析仪在100％功率设置下测量。这代表了38％的增量提取焙炒得率(incrementalextracted roasted yield)。

用Beckman JE离心机以分批方式将混合物离心，即将浆液放在1升瓶中，2,000rpm下转动10分钟。离心能除去大部分的不溶性固形物，所产生的离心饼或沉淀占初始浆液质量的约32％，上清液占68％。总离心了10,453.1g浆液，产生7,064.3g初级上清液，其含有5.9％总固形物(DM)和4.81％溶解固形物(在0.7μm膜滤液中测量)。将沉淀在体积等于所除去上清液的水中再成浆后离心，得到洗涤上清液。洗涤上清液含有2.27％总固形物和2.01％溶解固形物。将初级上清液和洗涤上清液合并。

离心上清液除含残余酶蛋白外，还含纤维材料的微细不溶性颗粒和油，它们不被离心除去。将13,926.5g的合并上清液用总表面积2,600cm²、标称孔径大小0.6μm的AGT中空纤维微滤组件进行澄清。用Waukesha 15PD泵以5.86kg/分钟的初始速度将投放物料从投料罐循环通过膜滤芯，澄清的透过液以约100cc/分钟的控制速度抽出。将投料循环至基本上耗尽，也即循环至没有足够的物料回到泵中的地步。微滤透过液澄清透明，不含可见的油和颗粒状物质。

取透过液样品用粘度测定法测定其残余甘露聚糖酶活性。将25μl透过液等分试样混合到30ml的1％刺槐豆胶溶液中，用BrookfieldRVT粘度计(转轴6支，20rpm)在21℃下监测粘度。粘度显示无变化(大约2.650PI)超过1小时，表明无酶活性。与此对比，反应混合物的等分试样显示粘度快速下降，斜率为0.055PI/分钟。用2％羧甲基纤维素(grade 7MF，Hercules，Wilmington DE，USA)按相同的方式测定透过液样品的残余纤维素酶活性。同样没有发现活性。

将膜透过液的等分试样冷冻干燥，分析其游离碳水化合物和总碳水化合物。

对于总碳水化合物分析，用三氟乙酸水解样品，然后用DionexED40脉冲安培检测器进行检测。

对于游离碳水化合物分析，将2-脱氧-D-葡萄糖内标和水加入到样品中，用Dionex ED40脉冲安培检测器进行分析。

将常压提取物和本发明方法产生的提取物再合并。也用上述方法测量此样品的游离碳水化合物和总碳水化合物。

分析样品中作为热降解的量度标准的5-HMF。用超声波水浴在30℃下提取和溶解分析物，接着进行固相部分纯化，然后用HPLC分析5-HMF含量。结果总结于下表中。

总甘露糖和游离甘露糖的差值代表甘露寡糖的含量。用ANDS(7-氨基-萘-1，3-二磺酸(一钾盐))和氰基硼氢化钠对甘露聚糖低聚物进行衍生化后，用毛细管电泳技术进行的另外的分析表明聚合度在2-8之间。

同样，总葡萄糖和游离葡萄糖的差值代表纤维寡糖的含量。

  5-HMF  (ppm)  游离葡萄糖  g/100g  游离甘露糖  g/100g  总葡萄糖  含量  (g/100g)  总甘露糖  含量  (g/100g)  按本发明产  生的提取物  62  2.9  3.4  10.1  42.7  再合并产品  62  1.7  2.0  6.4  30.3

上表显示在本发明方法中基本上没有显著产生5-HMF。

测量本发明方法所得提取物的总醛水平，并与用热水解法产生的提取物进行比较。为测量醛类含量水平，将提取物转移到小瓶中，用去离子水稀释，加热，用气相色谱法测量顶空气体。结果以总可溶性咖啡固形物计表示。下表所示数据明确表明，由本发明方法产生的醛类较少。

  总醛水平(μg/)  通热水解产生的提取物  1555  通过本发明方法产生的提取物  25

实施例2

酶反应和膜分离的同时进行

将7.18kg的实施例1微细研磨浆液放入圆底不锈钢带夹套罐中，同时进行刮面式搅动。在温和搅动下，将混合物加热至55℃，加入与实施例1完全相同的酶，每种0.055％。将混合物搅动保持1小时，然后用Waukesha(SPX，Delavan，WI)30PD泵以约5.4kg/分钟的速度使其循环通过标称平均孔径大小0.7μm的微滤滤芯(Oceanside，CA)PVDMFB-2514-46F。加酶后73分钟，打开膜滤芯上的透过液阀，将透过液流调整至约20ml/分钟。随着透过液收集的继续进行，将罐中混合物搅动和保持在55℃。透过液收集继续进行75分钟，期间总收集到1,361.1g透过液，含3.32％溶解固形物。

用实施例1所述的分析方法，分析透过液样品的残余纤维素酶和甘露聚糖酶活性。发现透过液没有纤维素酶活性。这是出乎意料的，因为据报道里氏木霉(Trichoderma reesei)(一种能产生RS103酶的微生物)的纤维素酶其分子量在44-48,000之间(J.Biotechnol.V57，191(1997))，应该能容易通过微滤膜。透过液的甘露聚糖活性为未过滤反应混合物的约39％：斜率(0.021PI/分钟比0.054)。出乎意料的是，酶被标称孔径大小比酶分子量大得多的膜排除(拒绝)。推测认为，这一排除是因为酶与不溶性咖啡颗粒物结合和/或酶形成聚集体而发生的。

实施例3

只用甘露聚糖酶进行反应

按实施例1进行本发明方法，唯一例外的是只加入0.0275％的β-甘露聚糖酶(Mannaway)。反应过程与实施例1相同。按实施例1进行16小时反应、加热和冷却后的最终浆液含有9.53％总固形物和4.49％溶解固形物。这代表了咖啡浆液中总固形物的44.6％计算溶解率(solubilization)和33.5％的增量提取焙炒得率。

实施例4

超滤除酶

将含有部分残余甘露聚糖酶活性的以上实施例2的微滤透过液再滤过不同分子量截值(MWCO)和材料的微滤和超滤膜，以确定完全除去甘露聚糖酶活性所需的条件。结果在总结于下表中：

  物料  过滤  MWCO⁽¹⁾  甘露聚糖酶  PI/分钟  反应混合物  无  0.054  微滤透过液  无  0.021  微滤透过液  30,000  0  微滤透过液  100,000  0.0051  反应混合物  100,000  0.0038

⁽¹⁾MWCO＝膜的分子量截值(标称)

30,000MWCO超滤膜将透过液中的甘露聚糖酶活性降低到零。100,000MWCO膜除去一部分甘露聚糖酶活性，其从存在咖啡固形物的反应混合物除酶比从微滤透过液除酶有效性稍高。

实施例5

a)酶膜保留-咖啡固形物的影响

将RS-103(Iogen，Ottawa，CA)在以下介质中进行1∶100稀释：

(1)去离子水

(2)常压提取磨碎物的微细研磨浆液，8.365％TS(总固形物)，MPS65微米

(3)废弃常压提取磨碎物(Bunn-2000brewer)，粗磨(大约850微米)

以上三个样品在制备后立即用标称100,000MWCO(C)和30,000MWCO(R)的Pall“Nanosep”离心过滤器进行膜过滤。将样品离心到基本上所有的液体都已透过膜为止。C膜的各过滤透过液全部按实施例1所述用粘度测定法分析酶活性。

纤维素酶活性

如下表中所总结，在咖啡固形物(1C)不存在下滤过100,000MWCO膜，纤维素酶活性有一定的下降，而在微细研磨咖啡固形物(2C)存在下进行过滤则纤维素酶活性降低约2/3。粗咖啡固形物(3C)在降低酶活性上相对无效果。样品(1)滤过30,000MWCO膜(R)排除了所有的纤维素酶活性。

  斜率PI/分钟  未过滤  -0.03476  1C(无咖啡)  -0.025  2C(微细研磨)  -0.0117  3C(粗磨)  -0.0288  1R(超滤)  0

甘露聚糖酶活性

如下表所总结，微细研磨咖啡固形物(2c)也增强了100,000MWCO膜对甘露聚糖酶活性的排除。

  斜率PI/分钟  未过滤  -0.550  1C(无咖啡)  -0.573  2C(微细研磨)  -0.347  3C(粗磨)  -0.611  1R(超滤)  -0.0035

实施例6

a)将蛋白酶加入到微细研磨的部分提取咖啡磨碎物

与实施例1相似，向常压磨碎物的几份微细研磨浆液加入以下酶组合：

A)无

B)与实施例1相同

C)与实施例1相同加上0.0275％酸性蛋白酶II(Amano)。

将装有这些混合物的烧瓶在100RPM和55℃下振摇16小时，然后按与实施例1相同的方式进行加工。溶解得率为：

A)20.2％

B)44.0％

C)48.5％

蛋白酶的加入产生了超过糖酶的增量得率。

实施例7

将不同原料用于酶辅助水解阶段

a)未处理新制焙炒和磨碎咖啡(RSG)

这个试验的原料是混合的焙炒阿拉比卡咖啡豆(哥伦比亚/中美洲/巴西)。将咖啡干磨至大约500微米MPS，然后用水稀释至大约10％TS，用装有1mm氧化锆珠粒的KDL试验磨机进行湿法微细研磨。用蠕动泵将咖啡浆液以0.044磨机体积/分钟的速度投料到磨机。

将微细研磨浆液的等分试样分配到烧瓶中，加入酶。所用酶的类型和浓度同实施例1。将烧瓶在55℃和100rpm下振摇16小时，加热到95℃，立即冷却到20℃，按与实施例1相同的方式进行加工，例外的是对于微滤，使用在RO-Ultratech(Fallbrook，CA)平板错流装置中的Sepro PVDF-MF膜(大约0.5微米MWCO)。

b)蒸煮的焙炒和磨碎咖啡

这个试验的原料是混合的阿拉比卡咖啡豆(哥伦比亚/中美洲/巴西)。用MPE4555滚筒磨机将整个咖啡豆磨碎至平均颗粒大小为800微米。接着将磨碎物用水(大约占咖啡豆重量的40％)预润湿，然后用低压蒸汽(1-2barg)蒸煮8-10分钟，从焙炒和磨碎咖啡蒸发出挥发性风味化合物。将这个挥发物流进行浓缩并通常在最终提取物干燥前回加到提取物中。在这个蒸煮过程后，按与实施例1相同的方式将固形物进行两阶段湿磨，例外的是第二阶段的投料速度是0.024磨机体积/分钟。

将Ross研磨和微细研磨浆液的等分试样分配到烧瓶中。使用与实施例7a相同的酶和加工条件。

c)常压提取的磨碎物

本试验的原料是与实施例1相同的磨碎物。按实施例1对磨碎物进行两阶段湿磨，例外的是第一阶段在装有细筛/超细筛/超细筛的Dispax磨机中进行(IKA USA)。Dispax研磨的磨碎物其MPS为224微米，而微细研磨的磨碎物其MPS为57.7微米。

甘露聚糖水解的时程数据

对于下述实验，原料是按以上实施例7c所述进行了两阶段湿磨的常压提取磨碎物。

将微细研磨浆液的四个等分试样分配到烧瓶中，将类型和组成同实施例1的酶的混合物加入到微细研磨浆液中。将烧瓶在55℃和100rpm下振摇4、8、12和16小时。到指定反应时间时，将烧瓶如前所述进行加工。

下表显示在不同时间时总甘露聚糖水解百分数。

    时间(小时)    总甘露聚糖水解百分数^＊    4    65.20    8    78.51

    12    82.43    16    84.65

*％值是基于最终产品中甘露聚糖与原料中甘露聚糖之比。

**样品用总碳水化合物方法进行分析，在这个方法中，用酸水解样品，然后用Dionex ED40脉冲安培检测器进行检测。

即使在4小时时，已有相当部分的甘露聚糖已被水解。

d)过热磨碎物

本试验的原料是用过热水提取后留下的过热磨碎物(大约180℃，“过热磨碎物”)。

用水将过热磨碎物稀释至大约10％TS，按以上实施例7c所述进行两阶段湿磨。Dispax磨机的流出物其MPS为73.5微米，微型磨机的流出物则为27.9微米。

将微细研磨浆液和一种Dispax浆液的等分试样分配到烧瓶中，加入其类型和含量水平同实施例7a的酶。将烧瓶在55℃和100rpm下振摇16小时，加热到95℃，立即冷却到20℃，然后按实施例7a进行加工。受试的甘露聚糖酶与纤维素酶组合对微细研磨浆液产生14.7％增量溶解率(以过热磨碎物原料的质量计)，对Dispax浆液产生13.6％增量溶解率。微细研磨磨碎物中单独使用甘露聚糖酶(0.55％)其溶解率为4.1％，而不加酶的微细研磨对照溶解率为2.8％。

结果

以下两表显示从不同平均颗粒大小的不同原料得到的得率。

与实施例1相同，使用含有具β-甘露聚糖酶活性的酶和具β-甘露聚糖酶加纤维素酶活性的酶的50∶50混合物的酶复合物：

    实施例    原料    ％得率⁽¹⁾    7a    未处理的焙炒和磨碎咖啡    60.5    7b    蒸煮的焙炒和磨碎咖啡    59.2    7c    常压提取磨碎物    62.5

  7d  过热磨碎物  55

与实施例3相同，使用只具β-甘露聚糖酶活性的酶：

  实施例  原料  ％得率⁽¹⁾  7c  常压提取磨碎物  59.5  7d  过热磨碎物  50.1

⁽¹⁾％得率定义为从焙炒咖啡豆提取的可溶性物质的百分数

下表显示使用不同原料时可供水解的甘露聚糖量和发生水解的甘露聚糖量。

  酶辅助水解  的原料  原料中的阿拉  伯半乳聚糖  (g)  可供水解的  甘露聚糖  (g)  水解的  甘露聚糖  (g)  剩余的  甘露聚糖  (g)  焙炒和  磨碎咖啡  9.1  20.5  17.2  3.3  蒸煮的焙炒和  磨碎咖啡  9.1  2.05  16.7  3.8  常压磨碎物  6.8  19.8  16.4  3.4  过热磨碎物  0.4  7  0  0

从上表可见，当用耗尽阿拉伯半乳聚糖的磨碎物作为酶辅助水解方法的原料时，甘露聚糖的提取效率较为低下。

酶的协同作用

当用包含纤维素酶和甘露聚糖酶的酶混合物处理湿磨焙炒咖啡时，该混合物对溶解得率的作用是相加性(additive)的，也就是说，用纤维素酶加甘露聚糖酶进行处理所获得的增量得率可完全由提取物的纤维寡聚物浓度的增加来解释；甘露寡聚物浓度没有显著变化。根据现有技术的教导，这是可预期到的。但是，已发现优选的纤维素酶加甘露聚糖酶组合，对例如通过批量分离(bulk separation)方法如离心进行的提取物分离后所获得的不溶性残余物的物理体积有明显的协同减少作用，这在下表中显示。例如，将下文定义为FM和FC的酶混合物加入到BM中，只使溶解得率增加13.8％，但残余体积减少32％。更小的残余物物理体积将有助于提取物的分离和回收。

  酶混合物  残余体积％  相对溶解得率  对照(无)  65  1  BM  53  1.59  FM+FC  40  1.27  FC  57  1  BM+FM+FC  37  1.81

FM＝RS-103的甘露聚糖酶成分；

BM＝Mannaway 25L；

FC＝RS-103的纤维素酶成分；

酶在微细研磨常压磨碎物的混合物中均为0.0275％，55℃，16小时反应；残余体积为占如前所述离心后的初始体积的百分数(％)。

实施例8

8a.常压磨碎物-湿磨与干磨的比较

在实施例1中证实，当将常压磨碎物湿磨至15-75微米的优选颗粒大小，并与优选的酶即Mannaway和RS-103各0.0275％组合进行搅动温育16小时时，可实现高达51.1％溶解率。

i.将实施例1的未处理粗常压磨碎物的样品冻干，用MPE 660超微细成粒机(Ultrafine Granulator)将干燥物料干磨至70微米的平均颗粒大小(MPS)。将此物料在水中调浆至10％总固形物。

ii.将相同的湿常压磨碎物如实施例7c所述进行Dispax湿磨，总固形物约为10％。

iii.将ii.的Dispax湿磨磨碎物如实施例7c所述进行微细研磨，投料速度为0.11磨机体积/分钟，一次投料通过磨机。

iv.将ii.的Dispax湿磨磨碎物如实施例7c所述进行微细研磨，投料速度为0.11磨机体积/分钟，但循环通过磨机40分钟。

向所有的大约10％总固形物浆液中加入与实施例1相同的酶，将所得混合物在55℃下保持15小时，然后按实施例1进行加工。

如下表所示，湿磨比干磨更为有效地使常压磨碎物得到酶促溶解，且随着湿磨MPS接近优选的范围，溶解百分数增加。常压磨碎物即使干磨至优选的颗粒大小，也不能有效地使酶促溶解得以发生。

  处理  磨机  酶  振摇^(a)  MPS微米  溶解％  i  干磨  0  +  70  12  i  干磨  +  +  70  15.4  ii  Dispax  0  224  17.1  ii  Dispax  +  224  31.2  iii  微型磨机  一次通过  0  -  144.4  18.05  iii  微型磨机  一次通过  +  -  144.4  40.02  iv  微型磨机  循环  0   -  65.5  17.9  iv  微型磨机  循环  +   -  65.5  46.0

^(a)定轨振荡器，100RPM

8b.焙炒咖啡-湿磨与干磨的比较

本比较的原料为阿拉比卡咖啡豆。

对于干磨实施例，用MPE 669超微细成粒机将咖啡进行干磨。然后将磨碎的咖啡与水混合得10％浆液，静置浸泡1小时，然后进行酶水解。

对于湿磨实施例，将咖啡干磨至约500μm的平均颗粒大小(MPS)，然后用水稀释至大约10％总固形物(TS)，用装有1mm氧化锆珠粒的KDL试验磨机进行湿法微细研磨。用蠕动泵将咖啡浆液以0.044磨机体积/分钟的速度投料到磨机。

或者，按实施例7c对500微米咖啡进行Dispax研磨，将10％TS的咖啡加入到循环液体中，在加入固形物后紧接着(“一次通过”)和在循环通过磨机后5分钟，采集研磨浆液样品。

将干磨和湿磨浆液的等分试样分配到烧瓶中，加入酶。所用酶的类型和浓度同实施例1。将烧瓶在55℃和100rpm下振摇16小时，然后如前所述进行加工。

以原始焙炒和磨碎咖啡计的溶解率在下表中以得率％表示。此得率定义为从焙炒咖啡豆提取的可溶性物质的百分数。

  研磨类型  磨机  方式 MPS微米  酶⁽¹⁾  溶解得率％  1a.干磨  Dyno  - 77  0  30.1  1b.干磨  Dyno  - 77  +  35.9  2a.湿磨  KDL  1次通过 32  0  32.1  2b.湿磨  KDL  1次通过 32  +  57.4  3a.湿磨  KDL  2次通过 77  0  31.7  3b.湿磨  KDL  2次通过 77  +  60.5  4a.湿磨  Dispax  1次通过 229  0  26.5  4b.湿磨  Dispax  +  34.3  5a.湿磨  Dispax  5分钟循环 133  0  27.6  5b.湿磨  Dispax  5分钟循环  133  +  42.0

(1)(+)表示酶类型和浓度同实施例1。

湿磨咖啡的酶促溶解率显著高于干磨所能达到的溶解率。

8c.在酶存在下进行湿磨

将常压咖啡磨碎物的浆液按实施例7c进行两阶段湿磨，但有以下例外：

i.使浆液以0.14磨机体积/分钟的速度循环通过第二阶段KDL试验微型磨机(磨机流出物返回投料罐)30分钟。将研磨浆液的等分试样分配到烧瓶中，向烧瓶中加入与实施例1相同的酶。将烧瓶在100rpm下搅动16小时，然后和实施例1一样进行加工。

ii.在进行第二阶段微细研磨前加入与实施例1相同的酶，然后使浆液以0.14磨机体积/分钟的速度循环通过第二阶段KDL试验微型磨机30分钟，向磨机夹套输入冷却水保持温度在45℃。接着将研磨浆液分配到烧瓶中，在100rpm下振摇16小时，然后按实施例1进行加工。

以总浆液固形物计的溶解得率，(i)为45.8％，(ii)为49.8％。(i)的无酶对照其溶解得率为20.4％。在进行研磨前加入酶获得了增量得率，推测认为是因为改进了酶和咖啡之间的接触所致。

实施例9(比较例)

SU1597151——制备咖啡提取物的方法(莫斯科食品工业技术研究院)的付诸实施

这个比较例的原料是磨碎至平均颗粒大小500μm的混合罗布斯塔咖啡豆(Robusta bean)。将大约100g磨碎咖啡与水1∶20混合，加热到90℃，在此温度下保持5分钟。用Whatman#1滤纸过滤分离磨碎物和提取物。

将这第一阶段磨碎物用酶复合物辅助水解进行第二次提取。酶复合物为果胶酶和β-葡聚糖酶的50∶50混合物。将水以20∶1的比例加入到磨碎物中，酶复合物的加入水平为1％每100克干物质(DM)。将这样得到浆液在50℃下连续搅动保持60分钟。用Whatman#1滤纸过滤分离提取物和磨碎物。

本方法的下一个阶段使用前面两个提取所产生的提取物代替水作为提取介质，对新制的焙炒和磨碎咖啡进行提取。同样，提取物与咖啡磨碎物的比例为1∶20。提取条件同前面实施例(加热到90℃并在此温度下保持5分钟)。以上程序用大约500μm的研磨大小进行。在提取阶段后，用Whatman#1滤纸过滤分离磨碎物和提取物。

本方法所得的得率在下表中显示：

  1.0％果胶酶和β-葡聚糖酶

  第一次和第二次提取的得率  28.8  用第一和第二提取物进行提取的得率  31

还用混合的阿拉比卡咖啡豆重复以上实验。这些实验所得的得率在下表中显示。所得得率比本发明方法的得率要低得多。

  1.0％果胶酶和β-葡聚糖酶  第一次和第二次提取的得率  23.9  用第一和第二提取物进行提取的得率  25.4

实施例10(比较例)

美国专利4,983,408——生产咖啡提取物的方法(Colton；Ralph L)的付诸实施

按实施例1的描述焙炒和提取阿拉比卡咖啡豆。常压提取所得的提取磨碎物含有大约30-35％干物质(DM)。将部分提取的磨碎物转移到压力容器中，在24bar直接蒸汽注射下处理2分钟时间。

将50g蒸汽处理初级磨碎物的样品用100g去离子水1∶2稀释，用0.029％含甘露聚糖酶活性的酶和0.029％含纤维素酶/甘露聚糖酶组合活性的酶进行处理。将蒸汽处理的重复样品标记为对照，用0.058％去离子水进行处理。将各样品混合，在55℃下静置保持20小时。然后将各样品加热到95℃使酶灭活，冷却到室温，5,000rpm下离心10分钟。收集上清液，使一部分上清液通过0.45微米和0.80微米针头过滤器(Supor)。

酶水解阶段的提取得率基于0.45微米滤液的固形物浓度蒸汽处理磨碎物中的固形物量进行计算。然后将水解阶段的得率加和到蒸煮和常压提取的报道提取得率，在下表中作为本方法的总得率报道。

将第二个实施例(10b)付诸实施，即用水将焙炒和磨碎的混合阿拉比卡咖啡豆(哥伦比亚/中美洲/巴西)1∶2(水∶咖啡)混合，接着在25barg下蒸煮4分钟。然后将蒸煮过的磨碎物与RS103在45℃下反应3小时。所得得率和5-HMF水平列于下表中。

  提取得率  (％)  总甘露糖  (g/100g)  5-HMF  (ppm) 实施例10a：常压提取磨碎物的蒸汽爆 破(加酶)  53  17  2556 实施例10a：常压提取磨碎物的蒸汽爆 破(不加酶)  47.6  14.5  1937 实施例10b：新制焙炒和磨碎咖啡的蒸 汽爆破(加酶)  46  16.5  6773 实施例10b：新制焙炒和磨碎咖啡的蒸 汽爆破(不加酶)  46  15.2  6725

实施例11

本发明基础产品(base product)的感官评定

本实施例的目的是将本发明方法获得的提取物的质量与热水解获得的提取物的质量进行感官上的比较。

按实施例1的描述用相同的焙炒和磨碎阿拉比卡混合咖啡豆进行常压提取。在这个阶段，按可溶性固形物测量有大约25％(重量)的咖啡豆被提取。然后将这个提取的残留磨碎物按实施例1的描述用酶进行处理。按可溶性固形物测量有大约38％(重量)的咖啡豆被提取。为产生最终产品，将两个阶段的提取物按基于可溶性固形物的重量比1∶1.5(常压提取所得提取物：酶处理所得提取物)进行掺合。

合并的提取物其可溶性固形物含量经测量为5％，接着用Heidolph旋转蒸发仪将其浓缩至30％可溶性固形物，这个操作在真空下进行。然后将浓缩的提取物冷冻干燥，产生最终水分含量为1.3％的产物。

将相同的阿拉比卡混合咖啡豆的分阶段提取和热水解过程所得的提取物用相同的设备按上文所述条件进行浓缩和干燥。此产品的最终水分含量为1.7％。

将干燥产品用75℃水复溶，得到可溶性固形物浓度为1.5％的饮料。专业咖啡品尝师对复溶产品评估发现，本发明产品比用常规热水解方法制备的产品更加澄清，酒味和加工杂味更少。