茶树咖啡碱合成途径中7-N-甲基转移酶基因的克隆及咖啡碱合成酶多克隆抗体的制备

摘要

茶叶中富含咖啡碱，而咖啡碱有着较多的生理功能，因此适量饮茶有利于人体健康。但是过量地摄入咖啡碱不但无益，还会对人体产生一定的副作用。在国内和国际市场，低咖啡碱茶和茶制品已成为一种流行趋势。传统的培育方式选育出来的低咖啡碱茶树品种，花费周期太长，而且得到的品种类型不一定拥有良好的适制型。在茶叶加工过程中去除咖啡碱会大大提高加工成本，并且会造成有害残留，处理过程亦会导致茶叶品质下降。因此，从长远来说，这些方法皆无法作为降低咖啡碱含量的有效途径。
　　运用基因工程技术，可以培育出我们想要的转基因品种，而且它还具有培育周期缩短、成本降低、优质高产等特点。因此，我们对茶树咖啡碱代谢途径中的相关基因进行更为详细的研究和探索，才能为后续的基因改造和优化奠定基础。
　　咖啡碱的核心合成途径为：黄嘌呤核苷甲基化反应生成7-甲基黄嘌呤核苷，再核糖水解作用产生7-甲基黄嘌呤，然后经过两次甲基化相继生成可可碱和咖啡碱，即XR→7mXR→7-MX→Tb→Cf。其中在茶树的咖啡碱生物合成过程中，催化第一步反应的7-甲基黄嘌呤核苷转移酶的研究一直是空白。另外，有关催化后两步反应的茶树咖啡碱合成酶TCS1在蛋白水平上的研究仍然有限，由于没有针对咖啡碱合成酶TCS1的商业化抗体出售，也不能检测TCS1在蛋白水平上的表达情况，因此TCS1的抗体制备尤为重要。
　　本研究通过对茶树中 N-甲基转移酶基因进行研究，尝试找到具有催化第一步甲基化反应的7-N-甲基转移酶，来调控7-MX的产量，从而调控咖啡碱的生物合成；同时通过制备TCS1多克隆抗体，为从蛋白水平上研究茶树体内咖啡碱合成代谢提供了条件。
　　主要研究内容和试验结果如下：
　　1、根据咖啡中CaXMT1-ORF序列设计特异性引物，对茶树cDNA进行PCR扩增，得到一条长度1119bp的片段，与CaXMT1-ORF序列一致性达到99％以上。
　　2、设计原核表达引物进行原核表达，构建原核表达载体，将构建好的重组质粒转入表达宿主细胞Reastta（DE3）pLysS中，通过优化诱导条件得到最优的蛋白表达条件，结果显示融合蛋白在28℃6 h诱导情况下，总蛋白、包涵体蛋白均能得到高效表达，可溶性蛋白也有表达但表达量不高。然后经HPLC和LC-MS检测，确定重组蛋白具有催化XR→7-MX的活性。
　　3、以茶树cDNA为模板，克隆出咖啡碱合成酶（TCS1），检测其重组蛋白表达情况，进行了体外酶活性测定，表达纯化了融合蛋白，制备出TCS1多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价，为1∶2000，Western blot分析表明，抗体具有良好的特异性。

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图表清单

1文献综述

1.1 茶树中咖啡碱的概况

1.2 咖啡碱的功能

1.3 茶树体内咖啡碱的生物合成

1.4低咖啡碱饮品的发展

2 引言

2.1研究目的与意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

3 材料与方法

3.1 材料

3.2 仪器与试剂

3.3 方法

4 结果与分析

4.1 RNA的提取与质量检测

4.2 茶树7-NMT基因的克隆、重组载体构建及在大肠杆菌中的表达

4.3 咖啡碱合成酶多克隆抗体的制备

5 讨 论

5.1 改良的试剂盒法提取总RNA

5.2茶树7-NMT基因的克隆与表达

5.3茶树咖啡碱合成酶多克隆抗体的制备

6 结 论

6.1茶树7-NMT基因的克隆

6.2 茶树7-NMT基因的原核表达

6.3茶树TCS1多克隆抗体的制备

参考文献

附录A 英文缩写及注释

附录B CaXMT1和TCS1基因ORF核苷酸序列

致谢

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