中药材中残留有机磷农药的检测方法

摘要

中药材中残留有机磷农药的检测方法，包括下述步骤：(1)制备一定浓度并包含有17种有机磷农药的对照品溶液；(2)在适当的色谱条件下检测对照品溶液，并得出对照品色谱图；(3)制备供试品：将供试品粉末加入乙酸乙酯超声提取2次并以PSA小柱进行净化脱色，减压浓缩，即得；(4)在与对照品相同的色谱条件下对供试品进行检测，得出供试品色谱图；(5)将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图用保留时间对比法进行比对，并确认相应特征峰，再通过外标法计算出含量值。本方法易于推广应用，净化效果好，解决了色素对色谱仪的污染问题。具较高灵敏度；方法回收率在64％－110％之间，重现性好，偏差小于15％。

说明书

(一)技术领域：

本发明涉及一种检测方法，具体是中药材中残留有机磷农药的检测方法。

(二)背景技术：

有机磷农药是一类含磷的有机化合物，种类很多，目前大量生产与使用的至少有60多种，按其毒性可分为高毒(如对硫磷，俗称1605、敌敌畏、甲拌磷等)、中等毒、低毒三类。有机磷农药具有用药量小，杀虫效率高，选择作用强，对农作物药害小，使用经济，并因其性质不稳定，在自然界容易分解，在作物中残留时间极短，以及在生物体内易受酶作用而水解，在体内不蓄积等特点而被广泛应用。由于中药材的种植周期相对较长，在其生长过程中不可避免的要使用各种农药，尽管从采收到成为备用原料，基本上都需晒干或烘干，同时经历较长的储存过程，因此对所使用的有机磷农药而言，当用作原料使用时，基本上已降解，残留量较低甚至无法检出。但鉴于某些有机磷农药属高毒农药，对哺乳动物急性毒性较强，一旦被其污染，极易造成人畜急性中毒，因此《中国药典》2005年版一部附录中专门规定了“药材及制剂中有机磷农药残留量测定法”，说明了对中药材中有机磷农药残留量的测定具有其必要性和现实意义。

药典规定的检测方法是在供试品中先加入无水硫酸钠，再以乙酸乙酯作为熔媒进行超声提取2次，提取物稀释后置活性碳柱上，置多功能真空样品处理器上，用正己烷-乙酸乙酯洗脱分离，最后以色谱法分离检测出12种有机磷农药。经过近一年的检测实践证明，此方法具有提取效率高，操作快速简便等优点。但不足之处一是需要配置价格昂贵的多功能真空样品处理器，这对于一般的企业而言难以承受，限制了该检测方法的推广应用，使中药材中有机磷农药的检测项目难以开展，安全用药留下隐患。二是净化效果较差，具体表现是活性碳柱对去除样品中的色素效果不理想，导致在进入色谱分析时，对进样口系统、衬管、进样针、色谱柱有较大程度的污染，使仪器运行成本增高、重复性差。

(三)发明内容：

本发明的目的就是针对上述检测方法中所存在的问题而提出的一种易于推广应用，净化效果好，对色谱系统无污染的中药材中残留有机磷农药的检测方法。

本检测方法包括下述步骤：

(1)对照品溶液的制备

分别精密吸取浓度为1000ug/ml的乙酰甲胺磷、氧化乐果标准储备液40ul及敌敌畏、甲胺磷、甲基内吸磷、甲拌磷、二嗪磷、久效磷、乐果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、甲基对硫磷、倍硫磷、对硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、乙硫磷标准储备液各20ul于10ml容量瓶中，用丙酮定容至刻度，充分混匀，即得乙酰甲胺磷、氧化乐果浓度为4ug/ml，其它15种标准储备液浓度为2ug/ml的有机磷对照品混合溶液，备用；

(2)色谱条件

气相色谱仪：Agilent 6890N

色谱柱：DB-1701毛细管色谱柱，30m×0.32mm×0.25μm

进样口条件：载气为氮气，纯度大于99.999％；温度180℃；不分流模式，分流阀流量10ml/min，阀开启时间0.75min

柱温箱条件：初温100℃保持5min以5℃/min升到260℃

柱参数：恒压模式，流速1.8ml/min

检测器条件：火焰光度检测器，温度200℃，H2流量75ml/min，Air流量100ml/min，尾吹气氮气流量60ml/min

理论塔板数以敌敌畏计不低于5000

(3)对照品溶液的检测

取上述有机磷对照品混合溶液60ul于样品瓶中，加入丙酮540ul，充分混匀，得乙酰甲胺磷、氧化乐果浓度为0.4ug/ml，其它15种对照品浓度为0.2ug/ml的对照品混合溶液，在Agilent 6890N气相色谱仪及上述色谱条件下进行气相色谱分析，得出对照品色图谱；

(4)供试品的制备

精密称取药材粉末5g，加无水硫酸钠5g，活性炭0.2g，加入乙酸乙酯50ml，振摇30min，静置过夜，冰浴超声5min，放置，取上层液滤过，残渣加乙酸乙酯30ml，冰浴超声5min，放置，滤入上次滤液，用10ml乙酸乙酯分次洗残渣、滤纸，与上述滤液合并。取滤液于40℃减压浓缩至近干，用10ml二氯甲烷预淋洗PSA小柱，弃去淋洗液，用二氯甲烷少量溶解样品，并转移至柱中，用15ml二氯甲烷+90∶10丙酮分次洗涤浓缩瓶，洗脱PSA小柱，待洗脱液下降至填料上层，再用15ml丙酮+95∶5甲醇洗脱，控制柱流速，缓慢逐滴流下，接收全部洗脱液，于40℃减压浓缩至近干，用乙酸乙酯或丙酮溶解，定容至2ml，得供试品溶液，待测；

(5)供试品的检测

取上述待测供试品溶液1ml，置自动进样器样品瓶中，在上述相同的色谱条件下自动进样分析，得出供试品图谱

(6)检测结果分析

将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图进行比对，若有相同的特征峰，即可说明供试品中残留有该有机磷农药，并通过相应峰面积计算出含量值；

所使用的标准储备液来源于国家农业部环境监测总站。

所使用的分析纯硫酸钠必须在550℃灼烧4小时；分析纯活性炭用3mol/L盐酸浸泡过夜，抽滤后，用蒸馏水洗至无氯离子，于120℃下烘干备用。

本发明作出的改进是将现有检测方法中净化部分用活性碳小柱-乙酸乙脂预洗，置多功能处理器，用正己烷-乙酸乙脂洗脱的步骤改为在样品处理前期加入活性碳，起初步脱色的作用；再将提取后的样品上PSA固相萃取小柱，并基于十几种农药之间极性差异采用两组极性不同的混合洗脱剂洗脱，通过一次提取、净化完成17种有有机磷的检测，比现有方法完成的12种有机磷检测多出5种。本方法不但革除了价格昂贵的多功能处理器，而且具有较好的净化效果，解决了色素对进样口系统、衬管、选样针、色谱柱污染的问题。

对本方法的回收率及精密度的验证

(1)试验药材  黄芪(产地甘肃，批号20050608)以《中国药典》2005年一部附录规定的“药材及制剂有机磷农药残留量测定法”对2份平行样进行检测，未检出有机磷农药，可以视为其无有机磷农药残留。

(2)试验方法精密称取上述黄芪药材粉末样品5g，加入含有17种有机磷农药(甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏、甲胺磷、甲基内吸磷、甲拌磷、二嗪磷、久效磷、乐果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、甲基对硫磷、倍硫磷、对硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、乙硫磷)混合标准溶液100ul，其中乙酰甲胺磷、氧乐果浓度为4ug/ml，其它15种有机磷农药浓度为2ug/ml，按本发明的方法进行提取、净化、浓缩，用丙酮2ml溶解，充分混合均匀，置于样品瓶，进样分析。分析数据如下：

表中的数据显示，用本发明的方法进行植物性中药材有机磷农药残留量的检测，色谱分析方法分离良好，柱效高，RSD值小于15％，方法回收率在64％-110％之间。除此之外还进行了仪器精密度、线性范围考察、最低限试验，其结果亦表明仪器精密度高，且在0.005至5ug/ml浓度范围内线性关系良好，具较高灵敏度。

(四)附图说明：

图1是17种有机磷农药对照品溶液的气相色谱图；

图2是黄芪药材中残留的有机磷农药的气相色谱放大图；

图3是当归药材中残留的有机磷农药的气相色谱放大图。

图中，1-敌敌畏、2-甲胺磷、3-乙酰甲胺磷、4-甲基内吸磷磷、5-甲拌磷、6-氧化乐果、7-二嗪磷、8-久效磷、9-乐果、10-甲基嘧啶磷、11-毒死蜱、12-甲基对硫磷、13-倍硫磷、14-对硫磷、15-马拉硫磷、16-杀扑磷、17-乙硫磷。

(五)具体实施方式：

实施例1黄芪药材中残留的有机磷农药的检测

一、对照品溶液的制备

分别精密吸取由国家农业部环境监测总站提供的浓度为1000ug/ml的乙酰甲胺磷、氧化乐果标准储备液40ul及敌敌畏、甲胺磷、甲基内吸磷、甲拌磷、二嗪磷、久效磷、乐果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、甲基对硫磷、倍硫磷、对硫磷、马拉硫磷、杀扑磷、乙硫磷(丙酮)标准储备液各20ul于10ml容量瓶中，用丙酮定容至刻度，于涡旋振荡器上充分混匀，即得乙酰甲胺磷、氧化乐果浓度为4ug/ml，其它15种标准储备液浓度为2ug/ml的有机磷对照品混合溶液，置冰箱中贮存备用。

二、主要实验仪器、色谱条件和试剂

1、实验仪器

气相色谱仪：Agilent 6890N-弹性石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)DB-1701

DB-1701毛细管色谱柱，中等极性键合交联柱，固定液：(14％氰丙基苯基)甲基聚硅氧烷，30m*0.32mm*0.25um nominal

2、色谱条件

进样口条件：载气为氮气，纯度大于99.999％；温度180℃；不分流模式，分流阀流量10ml/min，阀开启时间0.75min。

柱温箱条件：初温100℃保持5min以5℃/min升到260℃。

柱参数：恒压模式，流速1.8ml/min。

检测器条件：火焰光度检测器，温度200℃，H2流量75ml/min，Air流量100ml/min，尾吹气(氮气)流量60ml/min。

理论塔板数以敌敌畏计不低于5000。

3、试剂

丙酮：色谱纯；

乙酸乙酯：，色谱纯；

二氯甲烷：色谱纯；

甲醇：色谱纯；

硫酸钠：分析纯，550℃灼烧4小时备用；

活性炭：分析纯，用3mol/L盐酸浸泡过夜，抽滤后，用蒸馏水洗至无氯离子，于120℃下烘干备用。

三、对照品溶液的检测

取上述有机磷对照品混合溶液60ul于样品瓶中，加入丙酮540ul，于涡旋振荡器上充分混匀，得乙酰甲胺磷、氧化乐果浓度为0.4ug/ml，其它15种对照品浓度为0.2ug/ml的对照品混合溶液，在Agilent6890N-FPD气相色谱仪及上述色谱条件下进行气相色谱分析，得出对照品色图谱。

四.供试品的制备

精密称取黄芪(产地，甘肃，批号20060305)药材粉末5g，过二号筛，加无水硫酸钠5g，活性炭0.2g，加入乙酸乙酯50ml，振摇30min，静置过夜，冰浴超声5min，放置，取上层液滤过，残渣加乙酸乙酯30ml，冰浴超声5min，放置，滤入上次滤液，用10ml乙酸乙酯分次洗残渣、滤纸，与上述滤液合并。取滤液于40℃减压浓缩至近干，用10ml二氯甲烷预淋洗PSA小柱，弃去淋洗液，用二氯甲烷少量溶解样品，并转移至柱中，用15ml二氯甲烷+90∶10丙酮分次洗涤浓缩瓶，洗脱PSA小柱，待洗脱液下降至填料上层，再用15ml丙酮+95∶5甲醇洗脱，控制柱流速，缓慢逐滴流下，接收全部洗脱液，于40℃减压浓缩至近干，用乙酸乙酯或丙酮溶解，准确定容至2ml，得供试品溶液，待测。

五.供试品的检测

取上述待测供试品溶液1ml，置于2ml自动进样器样品瓶中，在上述相同的色谱条件下自动进样分析，得出供试品图谱。

六.检测结果分析

将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图用保留时间对比法进行比对，并确认相应特征峰，可以看出有与2号峰甲胺磷和17号峰乙硫磷相同的特征峰，说明本批次的黄芪药材中有两种有机磷农药残留。按外标法计算，甲胺磷含量为0.00346ug/ml，乙硫磷含量为0.00855ug/ml，符合我公司关于《中药材中有机磷农药残留量标准》中的规定。

实施例2  当归药材中残留的有机磷农药的检测

一、对照品溶液的制备            同实施例1

二、实验仪器、色谱条件和试剂    同实施例1

三、对照品溶液的检测同实施例1

四、供试品的制备

精密称取当归(产地，甘肃，批号20060510)药材粉末5g，过二号筛，加无水硫酸钠5g，活性炭0.2g，加入乙酸乙酯50ml，振摇30min，静置过夜，冰浴超声5min，放置，取上层液滤过，残渣加乙酸乙酯30ml，冰浴超声5min，放置，滤入上次滤液，用10ml乙酸乙酯分次洗残渣、滤纸，与上述滤液合并。取滤液于40℃减压浓缩至近干，用10ml二氯甲烷预淋洗PSA小柱，弃去淋洗液，用二氯甲烷少量溶解样品，并转移至柱中，用15ml二氯甲烷+90∶10丙酮分次洗涤浓缩瓶，洗脱PSA小柱，待洗脱液下降至填料上层，再用15ml丙酮+95∶5甲醇洗脱，控制柱流速，缓慢逐滴流下，接收全部洗脱液，于40℃减压浓缩至近干，用乙酸乙酯或丙酮溶解，准确定容至2ml，得供试品溶液，待测。

五、供试品的检测

取上述待测供试品溶液1ml，置于2ml自动进样器样品瓶中，，在上述相同的色谱条件下自动进样分析，得出供试品图谱.

六、检测结果分析

将供试品检测出的色谱图与对照品色谱图用保留时间对比法进行比对，并确认相应特征峰，可以看出有与1号峰敌敌畏和12号峰甲基对硫磷相同的特征峰，说明本批次的当归药材中有两种有机磷农药残留。按外标法计算，敌敌畏含量为0.00279ug/ml，甲基对硫磷含量为0.00375ug/ml，符合我公司关于《中药材中有机磷农药残留量标准》中的规定。