一种缩短北虫草子实体生长周期的培育方法

摘要

本发明提供一种可以缩短北虫草子实体生长周期的培育方法，将北虫草菌株接种于PDA斜面，恒温箱中培养制成孢子悬液；用灭过菌的枪头将制好的孢子悬液加入米饭培养基，转入培养室培养；在营养生长阶段向生殖生长阶段过渡时，将羟基磷灰石纳米粒子-赤霉素喷洒在菌表面，应用纳米技术达到缓慢释放赤霉素的目的，在整个北虫草生长周期中，仪需喷洒一次；子实体生长已有2cm高左右时，将羟基磷灰石纳米粒子-赤霉素喷洒在子实体表面喷洒一次；培养至26天左右，子实体可长高到8－9cm左右，即可下架采摘。本发明培育的北虫草子实体生长周期缩短14天左右，产量可提高30％，可进一步满足市场对北虫草的需求。

说明书

技术领域：

本发明涉及快速培养北虫草子实体的方法，进一步将是提供一种可以缩短北虫草子实体生长周期的培育方法，属于生物菌类培养方法技术领域。

背景技术

北虫草(Cordyceps militaris)是指真菌的菌丝通过各种方法侵染鳞翅目昆虫，以昆虫体内的物质行寄生生活，通过不断的发育和分解后最终伸出昆虫体表，而形成的一种真菌与虫体外壳共存的生物体。其主要功效成份虫草素明显高于冬虫夏草。

随着人们生活水平的提高及保健意识的增强，做为保健、药品主要原料之一的虫草需求量日益增加，加之虫草的采集，严重破坏了野生植被。虫草属国家明令禁止野外采集并加以保护的野生物种资源。为了满足市场的需求，人工培养北虫草已成为当前的发展趋势。而目前国家普遍采用cordyceps miltitaris菌株为北虫草生产菌，该菌株在固体培养子实体的生长过程中存在着生长周期长，大约40d到50d左右，给生产管理及提高单位产量都带来了一定的制约。

发明内容

本发明提供一种可以缩短北虫草子实体生长周期的培育方法，应用纳米技术使植物生长素缓慢释放，目的旨在快速高产培养固体北虫草子实体，在保证北虫草子实体的营养成份不变的基础上缩短生长周期同时，将植物生长素的喷洒次数降至最低，从而提高北虫草子实体的产量，减低劳动。

本发明的技术解决方案包括以下操作步骤：

1.北虫草的培育

①马铃薯培养基

②将北虫草菌株接种于PDA斜面，26℃恒温箱中培养7天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，制成浓度约为3*10⁷个/mL的孢子悬液。

③栽培培养基：85份大米+15份蛹粉，含水量65％，分装于玻璃瓶内，121℃35分钟灭菌备用。

④用灭过菌的枪头将制好的孢子悬液加入米饭培养基，每罐头瓶培养基加2mL孢子悬液(孢子浓度为3*10⁷个/mL)，后用灭过菌的竹筷将米饭搅拌均匀，用封口膜封好，转入培养室培养。温度控制在23℃左右，空气相对湿度为60％左右，黑暗培养，菌丝封底后室内增加散射光，培养料表面或四周有桔黄色色素形成，即进入子实体管理时期。

⑤菌丝转色完成后，为刺激子实体原基形成，增加光照和温差刺激，每天光照不少于10h，温度19-25℃，相对湿度60-80％，每天通风10min以补充新鲜空气，蛹虫草子座长出后，增加光照强度，在500-700lx的散射光照，温度保持23℃左右，空气湿度65％左右，每天通风换气3次，每次10min。

2.羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素制备及喷洒

①溶液配置

溶液A配制：准确称取无水乙酸钙0.705g，加重蒸水定容至10ml，摇匀备用；

溶液B配制：准确称取磷酸二氢铵1.381g，乙酸铵4.008g，加重蒸水45ml，用浓氨水调节pH值在7.6左右，补加重蒸水定容至50ml，摇匀备用；

②羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素制备

步骤1准确称取赤霉素1mg，溶液B溶解，缓慢搅拌；

步骤2将溶液A逐渐滴加到溶液B中，保持反应体系温度在37±1℃，pH值7.4±0.2之间，缓慢搅拌1小时；

步骤3反应液4℃下10000rpm/min离心15分钟；

步骤4离心后沉淀室温下干燥48小时，4℃保存。

③称取羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素0.2g，用水定容1000ml，备用。

④在培养瓶培养大约7天左右，即已从营养生长阶段向生殖生长阶段过渡时，将0.1％的植物生长素喷洒在菌表面。由于羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素具有缓慢释放作用，因此在北虫草生活周期中只需要喷洒一次。

⑤培养至26天左右，子实体可长高到8-9cm左右，即可下架采摘。

为表明本发明的积极效果，通过以下单因素实验(包括不同培养原料、培养基含水量、PH值和不同温度、光照对子实体干重及质量的影响)对北虫草固体培养条件进行比较：

原料：选择不同的原料，复合原料均为9份大米+1份的其他原料(大米+蛹、大米、麦粒、玉米餷、大米+麦鼓、大米+豆粉)，每条件处理10瓶。计算平均产量，即子实体的干重(g/瓶)。

蛹粉浓度优化：在原料优化的基础上，进一步考察蛹粉不同浓度对栽培的影响，每条件处理10瓶。

原料含水量：选择85份大米+15份蛹粉作为原料，每瓶固体原料40g，加不同体积的水设置不同含水量，每条件处理10瓶。

pH值：栽培原料为85份大米+15份蛹粉。用1％NaOH和1％HCl调节水的pH。使原料起始pH分别为3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，每条件处理10瓶。

温度：将接种的栽培瓶分别在23℃，暗恒温培养至瓶底转色后，分别置不同温度，室内散射光培养出草，每条件处理10瓶。

光照强度：采用不同密度的遮阳网设置不同强度的光照，将黑暗发菌至瓶底转色的栽培瓶，置不同光照下培养出草，每条件处理10瓶。

实验结果及讨论：

1、不同栽培原料对虫草生长的影响

栽培原料对北虫草生长影响很大，结果表明(表.1)，大米和大米复合原料所产了实体的综合质量明显好于其他原料；从产量上看，单一原料以大米为最好，平均每瓶(40g原料)产干虫草3.84g；复合原料以大米+蛹粉产量最高，平均每瓶(40g原料)产干虫草4.76g。

表1栽培原料对北虫草生长的影响海瓶子实体干重

  大米+蛹    大米  麦粒    玉米餷    大米+麦麸    大米+豆粉    菌丝体发育周期/d    子实体质量评价    子实体产量/g    37    +++    4.76    37    +++    3.84  41  +  2.98    42    +    2.48    39    ++    4.32    38    +++    4.46

2、不同蛹粉浓度对北虫草生长的影响

由实验可知，添加蛹酚可有效增加北虫草子实体产量，在此基础上进一步考察不同蛹粉浓度对虫草生长的影响(结果见表2)。结果表明，蛹粉的浓度在5％-15％时虫草栽培的子实体质量好，产量均有明显的提高，15％时产量最高，子实体干重为4.79g；浓度为25％时，表现出草迟缓，产量降低。

表.2蛹粉不同浓度对北虫草生长的影响/％

    5％    10％    15％    20％    25％    菌丝体发育周期/d    37    37    36    39    44

    子实体评价    子实体产量/g    ++    4.39    +++    4.64    +++    4.79    ++    4.42    +    1.02

3、不同原料含水量对北虫草生长的影响

含水量对虫草子实体产量影响很大(表3)，以大米+蛹粉为原料栽培生产，分析实验数据知含水量在65％时有较高的子实体产量，质量也好。

表3原料含水量对北虫草生长的影响

    含水量    45    50    55    60    65    70    菌丝体发育周期/d    子实体质量评价    子实体产量/g    33    ++    4.07    34    ++    4.33    35    +++    4.39    35    +++    4.69    35    +++    4.85    43    +    3.19

4、不同pH值对虫草生长的影响

以85份大米+15份蛹粉为原料栽培生产，含水量定为65％，从表4.4数据可知，虫草对pH的适应范围较广，在原料起始pH在3.5-8.5均可生长出子实体，其最适宜pH为7.5。

表4不同pH值对北虫草生长的影响

  3.5  4.0    4.5  5.0  5.5    6.0    6.5    7.0    7.5    8.0    8.5  子实体质量评价  子实体产量/g  +  0.85  ++  1.48    ++    3.25  ++  4.02  +++  4.44    +++    4.56    +++    4.79    +++    4.75    +++    4.92    ++    3.76    +    1.74

5、不同温度对北虫草生长的影响

应用前面优化出的最佳条件培养，考察不同温度变化对北虫草子实体产量的影响。由表4.5知在温度为13-27℃范围均可出草，23℃为虫草最适温度，此时北虫草子实体干重为4.93g。

表5温度对北虫草生长的影响

    温度    13    15    17    19    21    23    25    27    子实体质量评价    子实体产量/g    ++    1.95    ++    2.86    +++    3.42    +++    4.22    +++    4.73    +++    4.93    ++    3.84    +    1.42

6、不同光照强度对北虫草生长的影响

光照对北虫草了实体的生长影响很大(表6)。黑暗处理不产生子实体；连续光照与问隔光照均能产生子实体；在500-700lx的散射光照处理的子实体产量最高。

表6光照对北虫草生长的影响

    黑暗    日光灯连续照射/lx    散射光间隔光照/lx  100    300    500    700    300    500    700    900    子实体质量评价    子实体产量/g    -    0  +  0.21    ++    4.02    +++    4.71    +++    4.56    ++    3.61    +++    5.13    +++    4.85    ++    3.11

得到人工栽培北虫草菌株的最优培养条件为：原料为85份大米+15份蛹粉，原料的最适含水量为65％，子实体最适生长温度为23℃；最适pH为7.5，黑暗培养不利于子实体生长，在500-700lx的散射光照时产量最高。

7、喷洒赤霉素与不喷洒赤霉素北虫草固体培养子实体效果比较：

制备羟基磷灰石纳米粒子-赤霉素，可使赤霉素包裹在羟基磷灰石纳米粒子孔径中，起到缓慢释放的作用，从而在整个北虫草生长周期中，仅需喷洒羟基磷灰石纳米粒子-赤霉素一次。

分别在培养瓶培养大约7天，将羟基磷灰石纳米粒子-赤霉素喷洒在菌表面；

继续在培养室内进行培养，直至子实体生长已有2cm高左右时，在子实体表面喷洒一次。

表7喷洒赤霉素对北虫草固体培养子实体有效成分的有效成分

甘露醇含量   (mg/g)  多糖含量   (mg/g)虫草素含量     (μg/g)腺苷含量   (mg/g)  生长周期     /天  氨基酸   种类   子实体干重   北虫草子实体   (不喷洒赤霉素)  北虫草子实体   (喷洒赤霉素)   131.73    130.99    117.53    118.41      578.02      580.46      1.27      1.24      26      26      16      16    3.66±031    5.16±0.42 

在北虫草子实体生长过程中添加植物生长素后，培养时间缩短14天左右。菌丝体在PH6.5--7.5时生长较快。

产量可增加1/3左右(即原来可生产100公斤情况下，喷洒赤霉素好后生产130公斤。

本发明相对现有北虫草子实体的培养工艺优点在于：可促进北虫草的生理代谢机能，加快生长速度，缩短了北虫草培养周期，可由目前的常规培养周期50天左右缩短到26天左右，产量可提高30％，可进一步满足市场对北虫草的需求。

附图说明

图1为发明培养的北虫草子实体照片。

图2为常规方法培育的北虫草子实体照片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

一、北虫草的培养

①马铃薯培养基(PDA培养基)配置

②将北虫草菌株接种于PDA斜面，26℃恒温箱中培养7天，向斜面试管中注入无菌生理盐水，振荡后用无菌脱脂棉过滤，制成浓度约为3*10⁷个/mL的孢子悬液。

③栽培培养基：85份大米+15份蛹粉，含水量65％，分装于玻璃瓶内，121℃35分钟灭菌备用。

④用灭过菌的枪头将制好的孢子悬液加入米饭培养基，每罐头瓶培养基加2mL孢子悬液(孢子浓度为3*10⁷个/mL)，后用灭过菌的竹筷将米饭搅拌均匀，用封口膜封好，转入培养室培养。温度控制在23℃左右，空气相对湿度为60％左右，黑暗培养，菌丝封底后室内增加散射光，培养料表面或四周有桔黄色色素形成，即进入子实体管理时期。

⑤菌丝转色完成后，为刺激子实体原基形成，增加光照和温差刺激，每天光照不少于10h，温度19-25℃，相对湿度60-80％，每天通风10min以补充新鲜空气，蛹虫草子座长出后，增加光照强度，温度保持20-23℃左右，空气湿度60-85％左右，每天通风换气3次，每次10min。

二、添加植物生长素

羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素制备及喷洒

①溶液配置

溶液A配制：准确称取无水乙酸钙0.705g，加重蒸水定容至10ml，摇匀备用；

溶液B配制：准确称取磷酸二氢铵1.381g，乙酸铵4.008g，加重蒸水45ml，用浓氨水调节pH值在7.6左右，补加重蒸水定容至50ml，摇匀备用；

②羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素制备

步骤1准确称取赤霉素1mg，溶液B溶解，缓慢搅拌；

步骤2将溶液A逐渐滴加到溶液B中，保持反应体系温度在37±1℃，pH值7.4±0.2之间，缓慢搅拌1小时；

步骤3反应液4℃下10000rpm/min离心15分钟；

步骤4离心后沉淀室温下干燥48小时，4℃保存。

③称取羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素0.2g，用水定容1000ml，备用。

④在培养瓶培养大约7天左右，即已从营养生长阶段向生殖生长阶段过渡时，将0.1％的植物生长素喷洒在菌表面。由于羟基磷灰石纳米粒子-植物生长素具有缓慢释放作用，因此在北虫草生活周期中只需要喷洒一次。

⑤培养至26天左右，子实体可长高到8-9cm左右，即可下架采摘。

北虫草子实体产量：每40g固体培养基得北虫草子实体干重5.16±0.4g。参见图1、2。