Nipah病毒的引物和探针及一步法实时RT－PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Nipah病毒和参照基因的引物和两条针对Nipah病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Nipah病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，能够实现对不同物种目的基因的检测，通用性强，减少了引物和探针的数量及实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实验通常需要避免的污染机会。本发明试剂盒适用于科研或临床中Nipah病毒的检测，尤其适用病毒性疾病预防控制工作中对Nipah病毒的监测。

说明书

技术领域

本发明专利属于生物技术领域，涉及科研、临床和病毒流行病学监测等工作中使用RT-PCR方法对Nipah病毒RNA的检测和定量分析。具体是针对Nipah病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

Nipah病毒与人类疾病

Nipah病毒(Nipah Virus，NiV)是近年来新出现的一种副粘病毒，可引起人和动物急性中枢神经系统病变。Nipah病毒感染于1998～1999年在马来西亚和新加坡首次爆发，最近在孟加拉国、泰国和印度也被发现。在人类，Nipah病毒引起热性脑炎并伴发呼吸系统症状，死亡率高。Nipah病毒的储存宿主被认为是果蝠，人类可通过与蝙蝠直接接触或与猪等中间宿主接触而被感染。然而Nipah病毒的病毒学特征和其在人群中传播的流行病学特点等相关问题仍不清楚。

Nipah病毒的检测

Nipah病毒的检测方法主要有以下几种：病毒分离与鉴定、血清中和试验(Serumneutralization test，SNT)、酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbentassays，ELISA)、PCR检测等。

病毒分离是病毒性脑炎最基础、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但Nipah病毒分离需在生物安全4级(P4)条件下进行。血清中和试验(Serum neutralization test，SNT)和酶联免疫吸附检测(Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)均为免疫学检测方法，敏感性高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制备单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高。PCR检测具有快速、准确的特点，也被广泛用于对Nipah病毒的检测。目前已经建立的PCR检测方法有：1)Guillaume等【Guillaume V，Lefeuvre A，FaureC，et al.Specific detection of Nipah virus using real-time RT-PCR(TaqMan).J Virol Methods，2004，120(2)：229-37】针对Nipah病毒N基因的Real time-PCR(Taqman荧光探针)检测方法，检测灵敏度能达1PFU的病毒量，该方法适合对自然感染样品或流行病学样本进行检测。2)Wacharapluesadee等【WacharapluesadeeS，Hemachudha，T，Duplex nested RT-PCR for detection of Nipah virus RNA fromurine specimens of bats.J.Virol.Methods，2006，doi：10.1016/j.jviromet.2006.11.023】建立了针对Nipah病毒N基因的Duplcxnest RT-PCR检测方法，用卡那霉素RNA质粒作为内参，同时扩增内参和Nipah病毒N基因，有效的避免了假阴性结果，检测限为0.37pg/ul，PCR检测的灵敏度进一步提高。

实时PCR(Real-time PCR)技术

实时PCR技术是近年来发展起来的一种新型的PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点，可以在基因检测、基因表达、SNP分析等领域广泛应用。而TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。

但是，由于实时PCR技术具有很好的敏感性和特异性，因此容易出现假阳性和假阴性结果，所以实际应用时需要设置参照(Control)。通常的做法是检测目的基因的同时检测样本物种基因组中表达稳定的看家基因，如GAPDH、β-actin、16或18SrRNA等。这样就存在几个问题：1、由于不同物种的看家基因序列存在差异，所以检测不同物种目的基因时，需要对每一种物种设计看家基因的引物和探针，缺乏通用性，且增加实验操作的繁琐性和成本；2、对目的基因和看家基因分两管并行检测时，增加了试剂和人力的成本，也增加了交叉污染机会。如果在同一管检测则会因为两套引物和探针之间的相互作用而降低PCR反应效率，并增加了引物和探针的设计难度。

本发明设计一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Nipah病毒和参照基因的引物和两条针对Nipah病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Nipah病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，减少了实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实验通常需要避免的污染机会，很好的避免了上述问题。

发明内容

本发明的目的提供针对Nipah病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。采用所述试剂盒，运用一步法实时RT-PCR并结合TaqMan探针技术，适用于检测多种不同制备方法得到的、不同物种的RNA样本(如总RNA、mRNA、病毒粒等)，对Nipah病毒RNA进行特异性检测和定量分析。

本发明提供的用于检测Nipah病毒RNA的一步法实时RT-PCR检测试剂盒。其原理为：由MMLV来源的反转录酶MMLV RTase将Nipah病毒RNA反转录为cDNA，然后使用热启动Taq DNA聚合酶扩增cDNA。全部反应在同一反应体系中一步完成，反应过程无需开盖操作。热启动Taq DNA聚合酶有效避免了非特异扩增，同时结合TaqMan探针法，对Nipah病毒进行简单快速的高灵敏度、高特异性实时检测。

本发明中含有Nipah病毒检测用的FAM标记探针，同时还含有Nipah内参RNA和内参RNA检测用HEX标记探针，可以进行两色荧光双通道同时实时检测，反应过程无须开盖，反应结束无须电泳，检测快速，并极大减少了PCR产物污染所产生的假阳性结果。Nipah内参RNA的加入与检测可以排除因样品纯度等问题造成的假阴性结果。使用Nipah标准品RNA制作标准曲线，可以对Nipah病毒进行定量分析。

为实现上述目的而采用的技术方案之一是提供一组针对Nipah病毒的引物和探针，包括以下序列：

(1)Nipah病毒的上游引物，其序列为SEQ ID NO1；

(2)Nipah病毒的下游引物，其序列为SEQ ID NO2；

(3)Nipah病毒的TaqMan探针，其序列为SEQ ID NO3；

(4)内参RNA的TaqMan探针，其序列为SEQ ID NO4；

或者包含上述序列SEQ ID NO1～SEQ ID NO4的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列SEQ ID NO1～SEQ ID NO4同源性大于85％的序列；

或者上述序列SEQ ID NO1～SEQ ID NO4的碱基互补序列。

本发明的技术方案之二是提供一种含有上述引物和探针序列的Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其组成包括：One Step RT-PCR Master Mix、标准品RNA、内参RNA、Primer & Probe Mix、逆转录酶和水；其中所述的Primer& Probe Mix包括序列为SEQ ID NO1～SEQ ID NO4的混合物。

试剂盒中所述One Step RT-PCR Master Mix为含RT-PCR缓冲液、Mgcl₂，dNTPs、DNA聚合酶和无RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。

所述标准品RNA序列为SEQ ID NO5。

所述内参RNA序列为SEQ ID NO6。

所述水为无RNA酶水。

试剂盒中各组分试剂应保存于-20℃；尽量减少反复冻融。

本发明应用实时RT-PCR技术对样本中的Nipah病毒RNA进行检测，解决了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点；TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。

本发明设计一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Nipah病毒和参照基因的引物和两条针对Nipah病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Nipah病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，减少了实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实验通常需要避免的污染机会。

附图说明

图1是本发明采用的TaqMan探针图例。

图2是RiboGreen方法的RNA定量标准曲线。

图3是Nipah病毒RNA One Step RT-PCR扩增曲线。

图4是Nipah病毒RNA One Step RT-PCR标准曲线。

图5是内参RNA One Step RT-PCR扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明讲述的内容以后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所用无机化学试剂和有机溶剂均符合分子生物学实验的要求。引物和探针由上海生工公司合成，pBS-T载体购自北京TIANGEN公司，MMLV逆转录酶购自美国Stratagene公司、Taq DNA聚合酶购自美国ABI公司，DNase I、RNase H和T7RNA多聚酶购自大连宝生物公司，T3RNA多聚酶购自美国Promega公司，RiboGreen和RNA定量试剂盒购自美国Invitrogen公司。荧光PCR仪MX3000P为美国Stratagene公司产品，荧光PCR仪Rotor gene3000为澳大利亚Corbett Research公司产品。

1.引物和探针的设计

根据Gene Bank公布的Nipah virus序列(Accession Number：AF212302)设计引物和探针。使用Oligo 6.0软件在Nipah病毒基因序列第113nt-1711nt(N基因)中设计和优选引物与探针，并进行质量分析。所设计的引物和探针经Blast检索能检测出所有现有已知的Nipah病毒株，不与Hendra病毒株产生阳性结果。

(1)Nipah病毒的上游引物，其序列为SEQ ID NO1：

5’-AAA CAT CAG CAG GAA GGC-3’

(2)Nipah病毒的下游引物，其序列为SEQ ID NO2：

5’-CCA CTC TGT TCT ATA GGT TCT T-3’

(3)Nipah病毒的TaqMan探针，其序列为SEQ ID NO3

5’-FAM-AAA TTT GCT GCA GGA GGT GTG CTC AT-DABCYL-3’

(4)内参RNA的TaqMan探针，其序列为SEQ ID NO4：

5’-HEX-CTG GAC GAA GAG CAT CAG GGG CTC-BHQ1-3’

探针设计原理如图1，其中FAM、HEX为荧光报告基团，DABCYL、BHQ1为荧光淬灭基团。

2.Nipah病毒标准品RNA及内参RNA的制备和标定

应用PCR方法从出发质粒(含Nipah病毒N基因)扩增一段序列，其中含有前述引物和探针结合序列；将PCR产物纯化后连接pBS-T载体，测序正确后线性化载体，使用T7或T3 RNA聚合酶进行体外转录，所得到产物用DNase I和RNase H消化后使用RNA纯化试剂盒纯化，加入适量无RNA酶水，即为标准品RNA，放-80℃冰箱备用。使用RiboGreen方法和RNA定量试剂盒(Invitrogen)制作标准曲线，将得到的标准品RNA定量，并换算成拷贝数/ul。

内参RNA的制备和标定同Nipah病毒标准品RNA。用RiboGreen方法和RNA定量试剂盒制作的标准曲线如图2。

标准品RNA序列为SEQ ID NO5：5’-GCGAAUUGGG UACCGGGCCC CCCCUCGAGG

UCGACGGUAU CGAUAAGCUU GAUUACCAUG CUGGAGGAAU UGAUCAGAAC AUGGCAAAUA

GACUGGGACU AAGUUCAGAU CAAGUUGCAG AACUCGCUGC UGCAGUUCAG GAAACAUCAG

CAGGAAGGCA AGAGAGUAAU GUUCAGGCUA GAGAGGCAAA AUUUGCUGCA GGAGGUGUGC

UCAUUGGAGG CAGUGAUCAA GAUAUCGAUG AAGGGGAAGA ACCUAUAGAA CAGAGUGGCA

GACAGUCAGU UACCUUCAAA AGGGAGAUGA GUAUUUCAUC CCUUGCUAAC AGUGUGCCGA

GCAGUUCUGU GAGCACAUCC GGUGGGACCA GAUUGACUAA UUCAUUACUA AACCUCAGAU

CAAGACUGGC UGCAAAAGCA GCAAAAGAAG CCGCCUCAUC CAAUGCAACA GAUGAUCCAG

CAAUCAGCAA CAGAACUCAA AUCGAAUUCC UGCAGCCCGG GGGAUCCACU AGUUCUAGAG

CGGCCGCCAC CGCGGUGGAG CUCCAGCUUU UGUUCCCUUU AGUGAGGGUU AAUUUCGAGC

UUGGCGUAAU CAUGGUCAUA GCUGUUUC-3’

内参RNA序列为SEQ ID NO6：5’-GGAACAAAAG CUGGAGCUCC ACCGCGGUGG CGGCCGCUCU

AGAACUAGUG GAUCCCCCGG GCUGCAGGAA UUCGAUUAGA AAACAUCAGC AGGAAGGCAA

GCCGGUCUUG UCGAUCAGGA UGAUCUGGAC GAAGAGCAUC AGGGGCUCGC GCCAGCCGAA

CUGUUCGCCA GGCUCAAGGC GAGCAUGCCC GACGGCGAGG AUCUCGUCGU GACCCAUGGC

GAUGCCUGCU UGCCGAAUAU CAUGGUAAGA ACCUAUAGAA CAGAGUGGUC UAAUCAAGCU

UAUCGAUACC GUCGACCUCG AGGGGGGGCC CGGUACCCAA UUCGCCCUAU AGUGAGUCGU

AUUACAAUUC ACUGGCCGUC GUUUUACAA-3’

3.One Step RT-PCR反应

将装有2×One Step RT-PCR Master Mix、5×Primers & Probes Mix、RNA样品或标准品RNA、内参RNA、MMLV和无RNA酶水的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，低速短暂离心，用移液器按下表中的说明在冰盒上配制One Step RT-PCR反应体系(参见表1)。

表1 One Step RT-PCR反应体系的配制

 One Step RT-PCR反应成分    20ul反应体系    50ul反应体系    体积(ul)    终浓度    体积(ul)    终浓度 2×One Step RT-PCR Master Mix    10    1×    25    1× 5×Primers & Probes Mix    4    1×    10    1× RNA样品或标准品RNA或无RNA酶水    2    -    5    - MMLV 50U/ul    0.2    0.5U/ul    0.5    0.5U/ul 内参RNA(10²copies/ul)    1    -    2.5    - 无RNA酶水    2.8    -    7    -

反应条件：42℃30minutes，1个循环；

95℃15minutes，1个循环；

95℃12seconds，55℃20秒，72℃20秒，40个循环。

4.敏感性和特异性：

连续10倍稀释Nipah标准品RNA进行敏感性分析。在20ul RT-PCR反应体系中按3中的反应条件进行One Step RT-PCR反应，由软件自动产生Nipah病毒OneStep RT-PCR扩增曲线、标准曲线，见图3、4。标准曲线的线性范围为1.7×10⁷～1.7×10²copies/ul。

内参RNA扩增曲线见图5。

阴性对照(用无RNA酶水代替RNA样品)无FAM荧光信号扩增，有HEX荧光信号扩增，见图3、5。

5.操作中防止假阴性和假阳性现象的措施。

(1)无论是进行阴性对照、阳性对照实验，还是实际样品检测时，反应体系中都务必添加内参RNA，防止出现假阴性。

(2)同时进行阴性对照实验，防止出现假阳性。

(3)同时进行阳性对照实验，防止出现假阴性。

6.结果判定

①阴性对照实验

在配制实时RT-PCR反应液时，用无RNA酶水替代检测样品。对各种实验结果的判定情况说明见表2。

表2阴性对照实验结果判定

  FAM荧  光   HEX荧   光    结果判定  -   +    结果正常  -   -    可能是操作失败或试剂失活  +   -    RT-PCR反应体系污染。在确保反应体系不被污染    的情况下再次进行反应。  +   +

②阳性对照实验

制作标准曲线时，用Nipah标准品RNA的各浓度梯度稀释液替代检测样品。对各种实验结果的判定情况说明见表3。

表3阳性对照实验结果判定

    Nipah标准品RNA    FAM    荧光    HEX    荧光    结果判定    10²    10³    +    +    +    -(+)    结果正常    10⁴～10⁷    +    -    10²～10⁷    -    +    RT-PCR反应失败。可能是探针或    Nipah标准品RNA分解。    -    -    RT-PCR反应失败。可能是实验操作    失败或试剂失活。

③实验样品的检测

对各种实验结果的判定情况说明见表4。

表4实验样品的检测结果判定

    FAM    荧光    HEX    荧光结果判定    +    -    (+)如果同时进行的阴性对照实验结果正常，检测实际样品时，不管HEX荧光信号是否检出(如果检测样品浓度高会抑制内参RNA的扩增)，只要有FAM荧光检出，判定为阳性。    -    +如果同时进行的阳性时照实验结果正常，检测实际样品时有HEX荧光检出，无FAM荧光检出。判定为阴性或样品中Nipah病毒RNA含量低于检测限。    -    -RT-PCR反应失败。注意以下几个方面后再次进行反应。①如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品RNA制备有问题，如样品中可能存在RT-PCR反应的抑制物等。②如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或试剂失活。

7.注意事项

A、RNA实验操作注意事项

本试剂盒是利用RT-PCR反应对病毒或内参RNA样品进行扩增。RNA的纯度和完整性会影响实验结果，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA酶污染。

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理：用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下浸泡12小时；然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。

用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60min.)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1％的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA(只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应)。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法(异硫氰酸胍法)制备高纯度RNA。

为了防止RNA分解，RNA样品应尽量避免反复冻融，并尽可能保存于-80℃环境。

B、生物样本实验操作注意事项

生物样本有潜在危险，样品的采集、处理、保存、运输、检测实验均应遵循国家相应的管理规定和生物安全条例。必须做好相关的保护措施，以确保实验人员安全。

本试剂盒所使用的Nipah Positive Control RNA是通过人工合成DNA后，再经体外转录得到的。使用安全，无感染性。

C、PCR实验注意事项

本试剂盒检测灵敏度高，为了防止污染，实验要分区操作：①第一区：反应液配制区。②第二区：样品制备区。③第三区：样品添加区及反应检测区。

三个区间必须进行物理性隔离，避免人为因素造成污染。

PCR实验用荧光标记探针应避光保存。

当同时需要进行数次Real Time One Step RT-PCR反应时，应先配制各种试剂的混合液(其中包括Master Mix、无RNA酶水、Buffer、各种酶等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。

反应液的配制、分装应一定使用新的(无污染的)枪头、Microtube等，尽量避免污染。

8.试剂盒使用实例

试剂准备：(1)Nipah病毒的一步法实时RT-PCR检测试剂盒；(2)待检测RNA样品

操作步骤：(1)根据检测样本数量(N)计算所需反应管数(R)，以每个样本做3个重复为例，总反应管数为设需要的管数为R＝(N+6+1)×3+1，其中用来做定量标准曲线的标准品RNA6管，阴性对照1管。为避免分液过程中损失，一管备用。

(2)选择20ul或50ul反应体系，根据表1所建议体积乘以总反应管数后，在1.5mlEP管中冰上配制除标准品RNA或样品RNA外的其它组分，混匀后分装18ul或45ul反应混合液至PCR管，分别加入标准品RNA或样品RNA或无RNA酶水，盖好盖子，放入实时PCR仪。

(3)运行PCR仪，根据表1建议的反应条件进行PCR反应。实时荧光PCR仪设置为同时采集FAM和HEX荧光信号。

(4)反应结束后利用PCR仪随机附带分析软件分析结果。

(5)参照表2～表4对反应结果进行判定。

本发明中涉及的核酸序列：

SEQ ID NO1，Hendra病毒的上游引物：

5’-TAT CAA AGA GAG TAC TGC ACA G-3’

SEQ ID NO2，Hendra病毒的下游引物：

5’-TCC TGA GTC TGC CTG AGG G-3’

SEQ ID NO3，Hendra病毒的TaqMan检测探针：

5’-FAM-CTC ATC GGA AAG AAA CCC ACC TAA TA-DABCYL-3’

SEQ ID NO4，内参RNA的检测探针：

5’-HEX-CTG GAC GAA GAG CAT CAG GGG CTC-BHQ1-3’

SEQ ID NO5，标准品RNA：

5’-GGAACAAAAG CUGGAGCUCC ACCGCGGUGG CGGCCGCUCU AGAACUAGUG GAUCCCCCGG

GCUGCAGGAA UUCGAUUUCU CUCGCAGACA GUGUCCCAAG CAGUUCAGUG AGUACAUCCG

GAGGAACGAG AUUGACAAAU UCUCUAUUGA AUCUCAGAUC CAGAUUAGCU GCAAAGGCUA

UCAAAGAGAG UACUGCACAG AGCUCAUCGG AAAGAAACCC ACCUAAUAAC CGCCCUCAGG

CAGACUCAGG AAGGAAAGAU GACCAGGAAC CCAAACCUGC CCAAAAUGAU UUGGACUUUG

UUAGAGCAGA CGUGUGACGC UUAAUCAGAA ACUCAUAUAA GCUCCAAAUC AUUCUCUAUG

ACACACUCUU AUAAAUGAAU UCGAAGCAAU CAAGCUUAUC GAUACCGUCG ACCUCGACGG

GGGGGCCCGG UACCCAAUUC GCCCUAUAGU GAGUCGUAUU ACAAUUCACU GGCCGUCGUU

UUACAA-3’

SEQ ID NO6，内参RNA：

5’-GCGAAUUGGG UACCGGGCCC CCCCUCGAGG UCGACGGUAU CGAUAAGCUU GAUUAGAUAU

CAAAGAGAGU ACUGCACAGA AGCCGGUCUU GUCGAUCAGG AUGAUCUGGA CGAAGAGCAU

CAGGGGCUCG CGCCAGCCGA ACUGUUCGCC AGGCUCAAGG CGAGCAUGCC CGACGGCGAG

GAUCUCGUCG UGACCCAUGG CGAUGCCUGC UUGCCGAAUA UCAUGGUCCC UCAGGCAGAC

UCAGGAUCUA AUCGAAUUCC UGCAGCCCGG GGGAUCCACU AGUUCUAGAG CGGCCGCCAC

CGCGGUGGAG CUCCAGCUUU UGUUCCCUUU AGUGAGGGUU AAUUUCGAGC UUGGCGUAAU

CAUGGUCAUA GCUGUUUCC-3’